Artículo de método

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

DOI:

10.3791/55091

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1 de enero de 2017

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1State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Division of Regenerative Medicine, Department of Medicine, Loma Linda University, 3Department of Orthopaedic Surgery, Loma Linda University, 4Center for Stem Cell Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Department of Stem Cell & Regenerative Medicine, Peking Union Medical College, 6Collaborative Innovation Center for Cancer Medicine, 7Tianjin Key Laboratory of Blood Cell Therapy and Technology

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son una gran promesa para el modelado de la enfermedad y las terapias regenerativas. Hemos informado anteriormente el uso de vectores episomales (EV) para generar células iPS sin integración a partir de células mononucleares de sangre periférica (PB CMN). Los vectores episomales utilizados son plásmidos de ADN incorporados con elementos oriP y EBNA1 del virus Epstein-Barr (EB), que permiten la replicación y largo plazo Contención de plásmidos en células de mamífero, respectivamente. Con una optimización adicional, miles de colonias IPSC se pueden obtener a partir de 1 ml de sangre periférica. Dos factores críticos para lograr altas eficiencias de reprogramación son: 1) el uso de un 2A "auto-división" péptido para enlazar Oct4 y Sox2, logrando de esta manera la expresión equimolar de los dos factores; 2) el uso de dos vectores para expresar MYC y KLF4 individualmente. Aquí se describe un protocolo paso a paso para la generación libre de integración de IPSC a partir de muestras de sangre periférica de adultos. Las células iPS generadas están libres de integración como plásmidos episomales residuales son indetectables después de cinco pasajes. Aunque la eficiencia de reprogramación es comparable a la de Virus Sendai vectores (SV), plásmidos EV son considerablemente más económico que los vectores SV disponibles comercialmente. Este sistema EV reprogramación asequible tiene potencial para aplicaciones clínicas en medicina regenerativa y ofrece un enfoque para la reprogramación directa de las multinacionales del PP a las células libres de integración madre mesenquimales, células madre neurales, etc.

Introducción

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Después de la expresión forzada de varios factores de transcripción (Es decir, Oct4, Sox2, MYC y KLF4), las células somáticas pueden ser reprogramadas para células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), los cuales son muy prometedores para aplicaciones en la medicina regenerativa y la terapia de reemplazo celular 1-3. Hasta la fecha, diversos métodos han sido desarrollados para aumentar la tasa de éxito de la reprogramación de 4-7. Los vectores virales reprogramación inducida es ampliamente utilizado para la generación eficiente de células iPS, debido a la integración viral conduce a un alto nivel, la expresión estable de los factores de reprogramación. Sin embargo, la integración permanente del vector de ADN en el genoma de la célula puede inducir la mutagénesis de inserción 5. Además, la falta de inactivación de los factores de reprogramación puede perturbar la diferenciación iPSCs 8. Como tal, el uso de iPSCs sin la integración de factores de reprogramación es imprescindible, especialmente para uso en aplicaciones de terapia celular.

Vectores episomales (EVs) son ampliamente utilizados en la generación de iPSCs sin integración. El EV más comúnmente utilizado es un plásmido que contiene dos elementos, origen de replicación viral (oriP) y EB antígeno nuclear 1 (EBNA1), por el virus de Epstein-Barr (EB) 9. El elemento oriP promueve la replicación del plásmido en células de mamífero, mientras que el elemento EBNA1 ata el plásmido de ADN que contiene oriP-al ADN cromosómico que permite la compartimentación del episoma durante la división de la célula huésped. En comparación con otros enfoques libre de integración, incluyendo el virus Sendai (SV) y el ARN de la transfección, los vehículos eléctricos poseen múltiples ventajas 5,6,10. Como ADN plásmido, los vehículos eléctricos se pueden producir fácilmente y modificados en la casa, que les hace extremadamente asequible. Además, la reprogramación con EV es un proceso menos laborioso ya que una única transfección con los vehículos eléctricos es suficiente para la generación de IPSC, mientras que varios transfecciones de ARN son necesarias para la reprogramación éxito.

refibroblastos ermal se han utilizado en muchos estudios de reprogramación. Sin embargo, la biopsia de piel no sólo es un proceso invasivo y doloroso, pero también consume mucho tiempo para la expansión de las células a cantidades suficientes para la reprogramación. De mayor preocupación, células de la piel de donantes adultos a menudo han sido expuestos a la radiación de luz UV a largo plazo, lo que puede dar lugar a mutaciones asociadas a tumores, lo que limita las solicitudes de células iPS derivadas de fibroblastos de la piel 11,12. Recientemente, se ha informado de que las células de la piel humana normal se acumulan mutaciones somáticas y múltiples genes del cáncer, incluyendo la mayor parte de los principales impulsores de los carcinomas de células escamosas cutáneas, están bajo fuerte selección positiva 13.

En contraste con los fibroblastos de piel, células de la sangre periférica (PB) son una fuente preferida de células para la reprogramación porque 1) células sanguíneas se pueden obtener fácilmente a través de un proceso mínimamente invasivo, 2) células de sangre periférica son la progenie de las células madre hematopoyéticasque residen en la médula ósea, por lo tanto protegido de la radiación dañina. Las células mononucleares de sangre periférica (PB CMN) se pueden recoger en una hora de la capa leucocitaria tras un simple centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). Las MNCs PB obtenidos se componen de linfocitos, monocitos y unas pocas células progenitoras hematopoyéticas (HPC) 14. Aunque los linfocitos T humanos son uno de los principales tipos de células en PB, células T maduras contienen reordenamientos del receptor de células T (TCR) genes y carecen de un genoma intacto que limita su potencial para aplicaciones 15,16. Sin embargo, el rejuvenecimiento de las células T a través de la generación de IPSC puede tener aplicaciones potenciales en quimérico Receptor de Antígeno (CAR), la terapia de células T 17-19. En comparación, HPC tiene un genoma intacto y son fácilmente reprogramables. Aunque sólo 0,01-0,1% de células en la circulación periférica son HPCs, estas células se pueden expandir ex vivo en un medio de eritroides que favorece la proliferación de erythrcélulas progenitoras oid 14.

En nuestro estudio anterior, se utilizó el factor de BCL-XL además de los factores Yamanaka (Oct4, Sox2, MYC y KLF4), lo que resultó en un aumento de 10 veces en PB eficiencia de reprogramación 20. BCL-XL, también conocido como Bcl2l1, es un potente inhibidor de la muerte celular, inhibiendo la activación de las caspasas 21,22. Pero, BCL-XL también puede desempeñar un papel importante en el mantenimiento de la pluripotencia 21,22. Recientemente, hemos optimizado nuestro sistema EV reprogramación expresando separado MYC y KLF4 con dos vectores, lo que conduce a un aumento de aproximadamente 100 veces en la eficiencia de reprogramación 23. Usando este método, la eficiencia de reprogramación, definido por el número de colonias a partir dividido por el número de células en la transfección, es desde 0,2 hasta 0,5% de donantes sanos. En la siguiente manera, se describe el procedimiento experimental detallado para la generación de células iPS sin integración de PB.

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Protocolo

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Todas las muestras de PB humanos se obtuvieron de donantes adultos anónimos que no tienen información de identificación disponible de Tianjin Centro de Sangre con la aprobación del comité local de ética de investigación.

1. Endo-libre plásmido Preparación

  1. Utilizar un kit de purificación de plásmidos Maxi comercial para extraer vectores episomales de E. coli según el protocolo del fabricante. Para la etapa final, tampón TE sustituto con agua estéril libre de endotoxina para disolver el sedimento de ADN.
  2. Medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro comercial UV / Vis. La concentración es por lo general mayor que 1 g / l, con A260 / A280 y los ratios A260 / A230 de más de 1,8 y 2,0, respectivamente.

2. Medios de Cultivo

  1. Preparar medio eritroide: madre hematopoyéticas expansión celular medio suplementado con 100 ng / mL Stem Cell Factor humano (SCF), 10 ng / ml de interleucina-3 (IL3), 2 U / ml de eritropoyetina (EFactor-1 PO), 20 ng / ml de insulina Crecimiento (IGF1), 1 mM de dexametasona y 0,2 mM 1-tioglicerol. Filtro de esterilizar con un filtro de jeringa de 0,22 micras. medio eritroide se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de un mes.
  2. Preparar medio IPSC: medio DMEM / F12 (medio Eagle modificado / Mezcla Nutriente de Dulbecco F-12) suplementado con 1x L-glutamina, 1x penicilina / estreptomicina, 1 x solución no esenciales aminoácidos, 50 ng / mL factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2 ), 1x suplemento de insulina-transferrina-selenita (ITS), y ácido ascórbico 50 mg / ml. Filtro de esterilizar con un filtro de jeringa de 0,22 micras. medio IPSC se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de un mes.
  3. Preparar medio MEF: de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; alto de glucosa) suplementado con 1x penicilina / estreptomicina y 10% suero bovino fetal (FBS). Filtro de esterilizar con un filtro de jeringa de 0,22 micras. medio MEF se puede almacenar a 4 ° C hasta por un mes o recién añadir 1x L-glutamina antes de su uso.
  4. PAGmedio repare IPSC crioconservación (2x): Se disuelven 5 g de D-trehalosa en 30 ml de agua estéril en un baño de agua C 37 °. Llevar la temperatura de 4 ° C y luego agregar 10 ml de FBS y 10 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Filtro de esterilizar con un filtro de jeringa de 0,22 micras. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 3 meses 24.

3. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PB MNC)

  1. Combinar 10 ml de muestra PB fresco y 10 ml de tampón PBS en un tubo de 50 ml y mezclar bien. Llevar PBS a RT o 37 ° C antes de su uso.
    NOTA: aproximadamente 1 - 3 x 10 6 MNCs (frescos o crioconservados) se puede obtener a partir de 1 ml de PB. Después de 6 días de cultivo, esperar a tener 0,5 - 1 x 10 6 células totales debido a la muerte de las células maduras durante el cultivo. Aproximadamente 1 x 10 7 células se pueden obtener a partir de 10 ml de PB fresco.
  2. Añadir 10 ml de Ficoll a la parte inferior del tubo con una jeringa de 10 ml unida a una aguja larga. este proproceso debe hacerse lentamente para asegurar que la capa de Ficoll no se mezcla con el PB.
  3. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a una velocidad de aceleración y deceleración baja. Después de la centrifugación, las MNCs PB están en la capa blanca (capa leucocitaria) situado entre el plasma PB y el Ficoll.
  4. Lentamente aspirado de ~ 10 ml de plasma PB sin perturbar la capa leucocitaria. Con cuidado, la cosecha de la capa blanca con una punta de pipeta de 1 ml a un nuevo tubo de 50 ml. El volumen total de las células recogidas de la capa blanca será de entre 3 - 6 ml.
  5. Añadir PBS para llevar el volumen total a 30 ml y se mezcla bien con una pipeta de 10 ml. Centrifugar a 400 xg durante 10 min.
  6. Retire el sedimento celular sobrenadante y resuspender en 20 ml de medio de cultivo (es decir, de Iscove modificado de Dulbecco Medium, IMDM) y mezclar bien. Centrifugar a 400 xg durante 10 min para eliminar la mayoría de las plaquetas.
  7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 - 2 ml de IMDM. Las células se pueden usar fo la cultura inmediata, o congelado hacia abajo para su uso posterior. Para la criopreservación, añadir una cantidad igual de medio de criopreservación. células de alícuotas en crioviales (0,5 - 1 ml por vial) y crioviales de transferencia a un -80 ° C congelador inmediatamente. MNCs PB pueden ser almacenados en -80 ° C congelador durante varias semanas o transferirse a un tanque de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: Al descongelar las células congeladas, aunque nuestro medio de criopreservación puede sostener la viabilidad celular, el número de células puede disminuir debido a la muerte celular durante el proceso de descongelación. Se recomienda que 1 - 10 x 10 7 células se congelarán en cada vial.

4. La expansión de las multinacionales del PP en Eritroides Medio

  1. Preparar 5 ml de medio IMDM en un tubo de 15 ml. descongelar rápidamente las multinacionales PB congeladas en un baño de agua a 37 ° y luego transferirlos al tubo con el medio IMDM.
    NOTA: La longitud de tiempo en el baño de agua depende del volumen de las células criopreservadas y el u criovialSED. Por lo general, la célula congelada se descongele dentro de 1 min.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 5 - 10 minutos a. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en medio eritroide. Añadir 10 l solución de azul de tripano a la suspensión celular 10 l y mezclar bien. Tripán azul tiñe las células muertas de un radio de 1 - 3 minutos. Contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro.
  3. MNC Cultura del PP en una cultura no-tejido (no-TC) tratados placa de 6 pocillos con 2 ml de medio por pocillo, a una densidad celular de ~ 5 x 10 6 células / ml, a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubador humidificado.
  4. Añadir 1 ml de medio fresco eritroide directamente a cada pocillo sin cambiar el medio a D 3 y 5.
  5. En D 6, cosechar las multinacionales PB para nucleofection.

5. PB MNC Nucleofection y reprogramación

  1. Un día antes de nucleofection, pre-capa TC-tratada placas de 6 pocillos con gelatina al 0,1% a 37 ° C durante 20 minutos. Descongelar inactivada murino embrionarias Fibroexplosión (MEF) células alimentadoras en un baño de agua a 37 ° y de inmediato a transferir a un tubo de 15 ml que contenía 5 ml de medio de MEF.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. Retire la gelatina de la placa de 6 pocillos, volver a suspender el sedimento celular en medio MEF, y transferirlos a la gelatina previamente tratados con placa de 6 pocillos. En cada pocillo, semillas 2 - 4 x 10 5 células MEF inactivadas suspendieron en 2 ml de medio MEF.
  3. Cultivar las células alimentadoras MEF a 37 ° C en un 5% de CO2 humidificada.
  4. En el día de nucleofection, aspirar el medio MEF y reemplazarlo con 1 ml de medio eritroide. Pre-equilibrar la placa de cultivo durante 10 - 30 minutos a 37 ° C en un 5% de CO2 humidificada.
  5. Añadir 2 g PEV-OCT4-2A-Sox2, 1 mg PEV-MYC, 1 mg PEV-KLF4, y 0,5 g PEV-BCL-XL en un tubo Eppendorf de 1,5 ml estéril. Calentar el tubo a 50 ° C durante 5 min para evitar la contaminación, y se enfrían hasta la temperatura ambiente. Añadir57 l nucleofection tampón y 13 l suplemento.
  6. Cosecha 2 x 10 6 MNCs PB cultivadas a un tubo de 5 ml por centrifugación a 200 xg durante 7 min. Eliminar el sobrenadante y añadir el plásmido y nucleofection mezcla tampón al sedimento celular. Mezclar bien con un movimiento rápido del tubo con el dedo.
    NOTA: Por sólo 2 x 10 5 células puede ser utilizado para nucleofection, pero una eficiencia de reprogramación más baja se debe esperar también.
  7. Transferir el ADN y la suspensión de células a la cubeta proporcionada en el kit y la tapa de la cubeta. Seleccione el programa U-008 en el dispositivo nucleofection. Insertar la cubeta en el soporte y presione OK para aplicar el programa U-008.
  8. Tome la cubeta del soporte, se anaden 0,5 - 1 ml de pre-calentado medio eritroide en cada cubeta, y las células de transferencia a la placa MEF pre-equilibrada inmediatamente. Debido a la alta eficiencia de reprogramación y la variación de los donantes, la siembra de diferente número de células que van de 1-10 x 10 5 células per así es muy aconsejable.
  9. La transferencia de la placa a una cámara de hipoxia, y lavar la cámara con un gas mixto compuesto de 92% N 2, 5% de CO 2 y 3% O 2, por 1 - 2 min a una velocidad de 20 L / min. Después de sellar la cámara, cultivar las células a 37 ° C.
  10. En D2 post-nucleofection, agregar 2 ml de medio de IPSC directamente a cada pocillo.
  11. En D 4 después de la nucleofection, retire 3 ml de medio y agregar 2 ml de medio fresco de IPSC. En D 4 después de la nucleofection, la mayoría de las células vivas se han unido a la capa de alimentación.
  12. Después de D-6 después nucleofection, cambiar el medio cada 2 d dejando 500 l pasó medio y añadir 2 ml de medio fresco suplementado E8 con 0,25 mM butirato sódico hasta D 14 - 18.
    NOTA: las células de alimentación adicional se pueden añadir en los pocillos de cultivo cada vez que la observación de que las células alimentadoras se hayan separado. Después de la descongelación MEFs (ver 5.1 y 5.2), resuspender el sedimento celular en un volumen pequeño de medio de E8 (es decir, ~ 0.2 ml de un pocillo de una placa de 6 pocillos) y después se añaden MEFs en los pocillos de cultivo. Aproximadamente el 2% de FBS se puede añadir para aumentar la unión celular. Alternativamente, el medio acondicionado-MEF también se puede utilizar, pero es más laborioso.

6. La expansión de células iPS

NOTA: En la mayoría de los casos, un gran número de colonias IPSC aparecen en D de 8 - 10 nucleofection posterior. Después de 14 D, grandes colonias IPSC son generalmente listo para su recolección.

  1. Antes de recoger colonias, añadir 500 l de medio E8 complementado con inhibidor de ROCK, Y27632 (10 M), en un pocillo de un alimentador o Matrigel recubierto de placas de 24 pocillos. Utilizar una pipeta l 10 o 20 para rascar y recoger colonias bajo el microscopio. La transferencia de las piezas de cada colonia a los pocillos que contienen el medio de cultivo.
    NOTA: La concentración de Matrigel difiere de un lote a otro. Por lo general, se utiliza una dilución 1: 100 de Matrigel.
    1. Con el fin de evitar la contaminación cruzada, recogercolonias que son grandes y bien separados de los demás. IPSCs de cultivo a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora humidificada.
      NOTA: Debe ser en cuenta que la población de IPSC puede ser policlonal debido a la migración celular cuando hay decenas o cientos de colonias en cada pocillo de una placa de 6 pocillos.
  2. No cambie medio para la primera 2 d. Inhibidor de la roca puede promover la supervivencia de las pequeñas colonias 25.
  3. De D 2 en adelante, cambio de medio cada día mediante la eliminación de medio gastado y añadiendo medio fresco E8 500 l en cada pocillo.
  4. Aproximadamente 1 semana más tarde, cuando las colonias son lo suficientemente grandes, se elimina el medio y el tratamiento de las células con 300 solución de desprendimiento celular l (EDTA 0,5 mM en PBS) a 37 ° C durante 1-3 min. Eliminar la solución de desprendimiento de las células y se añade medio de E8 que contiene inhibidor de roca (10 mM) de suspender iPSCs. No romper las colonias en células individuales, que pueden conducir a la muerte celular excesiva. Los grupos de células con 5 a 50 célulass son adecuados para el paso de IPSC.
  5. Transferencia de 50 - 100% de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 6 pocillos de 12 o que ha sido pre-revestido con alimentadores o Matrigel.
  6. Para el cultivo a largo plazo en placas recubiertas con Matrigel (ver nota en 6.1), cambiar el medio cada día. Cuando la confluencia celular alcanza 40 - 60%, el tratamiento de las células con 1 ml solución de desprendimiento de las células (EDTA 0,5 mM en PBS) a 37 ° C durante ~ 3 min. Cuando las colonias empiezan a enroscarse, eliminar la solución de desprendimiento de las células y añadir E8 medio que contiene inhibidor de roca (10 mM) de suspender las células iPS. células de paso con un factor de división de 4 - 8. inhibidor ROCA debe añadirse cuando pases las células para aumentar la supervivencia, y se retiran de 1 d tarde para evitar la diferenciación.
  7. Para congelar abajo CMPI, el tratamiento de las células con solución de desprendimiento de las células a 37 ° C durante 3 - 5 min de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuando las colonias IPSC comienzan a enroscarse, aspirar el tampón y se anaden 0,5 - 1 mediana ml E8.
  8. Añadir un volumen igual de medio de criopreservación a la suspensión celular y se mezcla bien. Frozen iPSCs se puede almacenar en un congelador C -80 ° durante varias semanas o en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

7. La selección de células iPS sin residual episomal plásmidos

  1. Después del paso 5, iPSCs cosecha y extraer el ADN genómico.
    NOTA: Por lo general, después de 5 pasajes de la cultura, los plásmidos episomales residuales son indetectables. Por lo tanto, casi todas las colonias IPSC en pasajes anteriores 5 (es decir, el paso 10) son insuficientes, plásmidos episomales residuales.
  2. Utilice el ADN genómico de MNCs PB no transfectadas como control negativo. Añadir 1,6 pg plásmido PEV-OCT4-2A-Sox2 en el ADN control negativo 1 mg para imitar las células con una copia de pEV plásmido por célula.
  3. Añadir 9 l de agua de calidad para PCR incluyendo 100 ng de ADN genómico y 1 mu L cebadores específicos (10 mM cada uno de los cebadores directo e inverso) en 10 l de alta fidelidad PCR Master Mix. Normalizar la mañanaporte de ADN por GAPDH. Utilice los siguientes cebadores para la PCR: EBNA1-F TTTAATACGATTGAGGGCGTCT, EBNA1-R GGTTTTGAAGGATGCGATTAAG, WPRE-F GGTTTAAACGCGTCGACAAT, WPRE-R GTTGCGTCAGCAAACACAGT, GAPDH-F GAGTCCACTGGCGTCTTC, GAPDH-R GACTGTGGTCATGAGTCCTTC.
  4. Incubar la mezcla de reacción a 98 ° C durante 60 s; seguido de 98 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s. Después de 30 ciclos; extender la reacción a 72 ° C durante 5 min.
  5. Cargar 5 productos l de PCR en cada pocillo de un gel de agarosa al 1%. Dejar correr el gel de 20 - 30 minutos a 100 V. Elija los clones IPSC con bandas indetectables para EBNA1 y WPRE para el posterior cultivo y análisis de aguas abajo.

8. Citometría de Flujo

  1. Cosecha iPSCs tratándolos con Accutase a 37 ° C durante 3-5 min para obtener una suspensión de células individuales. Añadir 1 l PE-conjugado anti-TRA-1-60 o eFluor 570-conjugado anti-SSEA4 o anticuerpo isotípico 100 l de suspensión de células (1 - 5 x 10 5 células) En tubos de 5 ml. Incubar los tubos en un lugar oscuro a temperatura ambiente durante 20 min.
  2. Después de la tinción durante 20 min a RT, añadir 2 ml de PBS y centrifugar a 400 xg durante 5 min. Resuspender las células en 300 l de PBS para el análisis de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando un analizador de células citometría de flujo. 23,26

9. Imagen confocal

  1. iPSCs de semillas en la cámara de diapositivas Matrigel recubiertos.
  2. Después de 3 - 4 d de la cultura, se elimina el medio de crecimiento y fijar con paraformaldehído al 4% (PFA) a TA durante 30 min. Lavar las células dos veces con PBS.
    Nota: PFA es tóxico y dañino.
  3. Se tratan las células con 0,1% Triton X-100 en PBS (PBS-T) a TA durante 30 min. Lavar las células dos veces con PBS.
  4. Bloquear las células con tampón de bloqueo (suero de cabra al 5% en PBS, V: V) a TA durante 1 h.
  5. Durante la etapa de bloqueo, se diluye el anticuerpo primario (100x) en tampón de bloqueo.
    NOTA: La información anticuerpos aparece en la Tabla de Materiales / Equipos.
  6. Se incuban las células con anticuerpo diluido a 4 ° CO / N.
  7. Lavar dos veces con PBS-T durante 15 min, seguido por dos veces con PBS durante 15 min.
  8. Se incuban las células con un anticuerpo secundario fluoróforo conjugado diluido a TA durante 2 h.
  9. Lavar las células dos veces con PBS-T durante 15 min, seguido por dos veces con PBS durante 15 min.
  10. Teñir el núcleo con DAPI (1 mg / ml) en PBS a temperatura ambiente durante 10 min.
  11. Lavar las células dos veces con PBS durante 15 min.
  12. Captura de imágenes con un microscopio confocal. 23,27

10. El teratoma Ensayo

Cosecha 1 x 10 6 iPSCs con solución de desprendimiento de las células (EDTA 0,5 mM en PBS) y volver a suspender las células en 200 l DMEM / F12 diluido (1: 1) de Matrigel.

  1. Por vía subcutánea inyectar las células en el anca trasera de ratones inmunodeficientes NOD / SCID.
  2. A las 8 - 12 semana después de la inyección de IPSC, diseccionar y fijar los teratomas en formalina al 10%. 28
  3. Después microsectioning ytinción con hematoxilina y eosina (H & E), analizar las muestras. 29

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Resultados

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El uso de este protocolo, podemos obtener cientos de colonias de 1 x 10 5 nucleofected PB MNC (Figuras 1A y 1B). La eficiencia de reprogramación es de aproximadamente 0,2 a 0,5% y las colonias expresan marcadores de pluripotencia (Figuras 1C y 1D). iPSCs generadas utilizando el protocolo descrito están libres de integración y tienen la capacidad de formar teratoma componer las 3 capas germinales (Figur...

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Discusión

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La adquisición de las muestras de sangre de donantes sanos o pacientes es conveniente y no invasivo, lo que es una fuente de células atractiva para la investigación básica y clínica de terapia celular. Aquí hemos descrito un protocolo para la generación altamente eficiente de iPSCs libre de integración a partir de muestras de sangre periférica. Este enfoque reproducible y asequible debería beneficiar al campo de IPSC.

Hemos informado que hay dos factores críticos responsables de la reprogram...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen intereses contrapuestos o conflictivos que divulgar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015CB964902, 2013CB966902 y 2012CB966601), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81500148, 81570164 y 81421002), la subvención GCAT de la Facultad de Medicina de la Universidad de Loma Linda (2015) y el Centro de Investigación de Telemedicina y Tecnología Avanzada (W81XWH-08-1-0697).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medio de expansión de células madre hematopoyéticasSigmaS0192Almacenar a 4 & grados; C
Factor de células madre humanas (SCF)Peprotech300-07Almacene a -20 o -80 ° C
Interleucina-3 (IL-3)PeprotechAF-200-03Almacene a -20 o -80 ° C
Eritropoyetina (EPO)Peprotech100-64Almacene a -20 o -80 ° C
Factor de Crecimiento de Insulina-1 (IGF-1)Peprotech100-11Almacene a -20 o -80 ° C
DexametasonaSigmaD4902Almacene a -20 o -80 ° C
1-tioglicerol (MTG)SigmaM6145Almacenar a -20 o -80 ° C
DMEM/F12 medianoGibco112660-012Tienda a 4 & deg; C
L-glutamina (100x)Gibco25030-081Almacenar a -20 ° C
Penicilina/estreptomicina (100x)Gibco15140-122Almacenar en -20 ° C
Solución de aminoácidos no esenciales (100x)Gibco11140-050Almacenar a 4 & grados; C
Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2)Peprotech100-18BAlmacene a -20 o -80 ° C
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS, 100x)Gibco41400-045Tienda en 4 ° C
Ácido ascórbicoSigma49752Almacenar a -20 ° C
DMEM (alta glucosa) medioThermoSH30243.01BAlmacenar a 4 & grados; C
Suero Fetal Bovino (FBS)HycloneSV30087.01Tienda a -20 ° C
FicollGE Healthcare, SIGMA17-5442-02Tienda en RT
TrehaloseSigmaT9531Tienda en 4 ° C
Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD2650Tienda en RT, proteger de la luz
Endofree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen12362Tienda en RT
IMDMGibco21056-023Tienda en 4 ° C
Kit de nucleofección de células humanas CD34 + LonzaVPA-1003Almacene en RT, el tampón de nucleofección y el suplemento deben almacenarse a 4 & deg; C
Butirato de sodioSigmaB5887Almacene a -20 o -80 °
Inhibidor de C ROCK - Y27632DERIVANTE04-0012-10Almacenar a -20 ° C
Essential 8 medio basal (E8)GibcoA15169-01Tienda a 4 ° C, el suplemento debe almacenarse a -20 o -80 ° C
MatrigelBD 354277Almacenar a -20 o -80 ° C
2x EasyTaq PCR SuperMix (+dye)TransGen BiotechAS111Store a -20 °
Solución de desprendimiento de célulasSTEMGENT01-0006Almacenar a -20 ° C, Accutase como solución de desprendimiento de celda para obtener una suspensión de una sola celda
DAPISigmaD9542-1MGAlmacenar a 4 o -20 ° C
Anti-Nanog AF488BD560791Almacenar en 4 ° C, anticuerpo primario utilizado para la inmunofluorescencia, diluido 1/100 cuando se usa
Anti-OCT4abcamab19857Almacenar a 4 & grados; C, anticuerpo primario utilizado para la inmunofluorescencia, diluir 1/100 cuando se usa
AF488 burro anti-ratónIgG InvitrogenA21202Almacenar a 4 & grados; C, anticuerpo secundario utilizado para la inmunofluorescencia,  diluir 1/500 cuando se usa
PE anti-humano anticuerpo TRA-1-60-RBiolegend330610Almacenar a 4 & grados; C, anticuerpo utilizado para la citometría de flujo
eFluor 570-conjugado anti-SSEA4eBioscience41-8843Almacenar en 4 & grados; C, anticuerpo utilizado para la citometría de flujo
Isotipo anticuerpoeBioscience11-4011Almacenar a 4 & grados; C, anticuerpo utilizado para la citometría de flujo
Kit de detección de fosfatasa alcalinaSiDanSai1102-100Almacenar a 4 & grados; C
Kit de extracción de ADN genómicoTIANGENDP304-02Almacenar en RT
Solución de Trypan BlueSigmaT8154Almacenar en RT
Citometría de flujo analizadorBDLSRII
Disco giratorio Microscopio confocal (SDC)PerkinElmerUltraVIEW VOXpara imagen confocal
Dispositivo de nucleofecciónLonzaNucleofector 2bpara la nucleofección de PB MNC
ImageQuant LAS-4010GEpara tomar fotos de la tinción de AP a granel
C celular

Referencias

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