Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Resumen

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Resumen

Células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son una gran promesa para el modelado de la enfermedad y las terapias regenerativas. Hemos informado anteriormente el uso de vectores episomales (EV) para generar células iPS sin integración a partir de células mononucleares de sangre periférica (PB CMN). Los vectores episomales utilizados son plásmidos de ADN incorporados con elementos oriP y EBNA1 del virus Epstein-Barr (EB), que permiten la replicación y largo plazo Contención de plásmidos en células de mamífero, respectivamente. Con una optimización adicional, miles de colonias IPSC se pueden obtener a partir de 1 ml de sangre periférica. Dos factores críticos para lograr altas eficiencias de reprogramación son: 1) el uso de un 2A "auto-división" péptido para enlazar Oct4 y Sox2, logrando de esta manera la expresión equimolar de los dos factores; 2) el uso de dos vectores para expresar MYC y KLF4 individualmente. Aquí se describe un protocolo paso a paso para la generación libre de integración de IPSC a partir de muestras de sangre periférica de adultos. Las células iPS generadas están libres de integración como plásmidos episomales residuales son indetectables después de cinco pasajes. Aunque la eficiencia de reprogramación es comparable a la de Virus Sendai vectores (SV), plásmidos EV son considerablemente más económico que los vectores SV disponibles comercialmente. Este sistema EV reprogramación asequible tiene potencial para aplicaciones clínicas en medicina regenerativa y ofrece un enfoque para la reprogramación directa de las multinacionales del PP a las células libres de integración madre mesenquimales, células madre neurales, etc.

Introducción

Después de la expresión forzada de varios factores de transcripción (Es decir, Oct4, Sox2, MYC y KLF4), las células somáticas pueden ser reprogramadas para células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), los cuales son muy prometedores para aplicaciones en la medicina regenerativa y la terapia de reemplazo celular ^1-3. Hasta la fecha, diversos métodos han sido desarrollados para aumentar la tasa de éxito de la reprogramación de ^4-7. Los vectores virales reprogramación inducida es ampliamente utilizado para la generación eficiente de células iPS, debido a la integración viral conduce a un alto nivel, la expresión estable de los....

Protocolo

Todas las muestras de PB humanos se obtuvieron de donantes adultos anónimos que no tienen información de identificación disponible de Tianjin Centro de Sangre con la aprobación del comité local de ética de investigación.

1. Endo-libre plásmido Preparación

1. Utilizar un kit de purificación de plásmidos Maxi comercial para extraer vectores episomales de E. coli según el protocolo del fabricante. Para la etapa final, tampón TE sustituto con agua estéril libre de endotoxina para disolver el sedimento de ADN.
2. Medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro comercial UV / Vis. La concentración es por lo....

Resultados

El uso de este protocolo, podemos obtener cientos de colonias de 1 x 10 ⁵ nucleofected PB MNC (Figuras 1A y 1B). La eficiencia de reprogramación es de aproximadamente 0,2 a 0,5% y las colonias expresan marcadores de pluripotencia (Figuras 1C y 1D). iPSCs generadas utilizando el protocolo descrito están libres de integración y tienen la capacidad de formar teratoma componer las 3 capas germinales (Figur.......

Discusión

La adquisición de las muestras de sangre de donantes sanos o pacientes es conveniente y no invasivo, lo que es una fuente de células atractiva para la investigación básica y clínica de terapia celular. Aquí hemos descrito un protocolo para la generación altamente eficiente de iPSCs libre de integración a partir de muestras de sangre periférica. Este enfoque reproducible y asequible debería beneficiar al campo de IPSC.

Hemos informado que hay dos factores críticos responsables de la reprogram.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio de expansión de células madre hematopoyéticas	Sigma	S0192	Almacenar a 4 & grados; C
Factor de células madre humanas (SCF)	Peprotech	300-07	Almacene a -20 o -80 ° C
Interleucina-3 (IL-3)	Peprotech	AF-200-03	Almacene a -20 o -80 ° C
Eritropoyetina (EPO)	Peprotech	100-64	Almacene a -20 o -80 ° C
Factor de Crecimiento de Insulina-1 (IGF-1)	Peprotech	100-11	Almacene a -20 o -80 ° C
Dexametasona	Sigma	D4902	Almacene a -20 o -80 ° C
1-tioglicerol (MTG)	Sigma	M6145	Almacenar a -20 o -80 ° C
DMEM/F12 mediano	Gibco	112660-012	Tienda a 4 & deg; C
L-glutamina (100x)	Gibco	25030-081	Almacenar a -20 ° C
Penicilina/estreptomicina (100x)	Gibco	15140-122	Almacenar en -20 ° C
Solución de aminoácidos no esenciales (100x)	Gibco	11140-050	Almacenar a 4 & grados; C
Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2)	Peprotech	100-18B	Almacene a -20 o -80 ° C
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS, 100x)	Gibco	41400-045	Tienda en 4 ° C
Ácido ascórbico	Sigma	49752	Almacenar a -20 ° C
DMEM (alta glucosa) medio	Thermo	SH30243.01B	Almacenar a 4 & grados; C
Suero Fetal Bovino (FBS)	Hyclone	SV30087.01	Tienda a -20 ° C
Ficoll	GE Healthcare, SIGMA	17-5442-02	Tienda en RT
Trehalose	Sigma	T9531	Tienda en 4 ° C
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650	Tienda en RT, proteger de la luz
Endofree Plasmid Maxi Kit (10)	Qiagen	12362	Tienda en RT
IMDM	Gibco	21056-023	Tienda en 4 ° C
Kit de nucleofección de células humanas CD34 + Lonza		VPA-1003	Almacene en RT, el tampón de nucleofección y el suplemento deben almacenarse a 4 & deg; C
Butirato de sodio	Sigma	B5887	Almacene a -20 o -80 °
Inhibidor de C ROCK - Y27632	DERIVANTE	04-0012-10	Almacenar a -20 ° C
Essential 8 medio basal (E8)	Gibco	A15169-01	Tienda a 4 ° C, el suplemento debe almacenarse a -20 o -80 ° C
Matrigel	BD 354277		Almacenar a -20 o -80 ° C
2x EasyTaq PCR SuperMix (+dye)	TransGen Biotech	AS111	Store a -20 °
Solución de desprendimiento de células	STEMGENT	01-0006	Almacenar a -20 ° C, Accutase como solución de desprendimiento de celda para obtener una suspensión de una sola celda
DAPI	Sigma	D9542-1MG	Almacenar a 4 o -20 ° C
Anti-Nanog AF488	BD	560791	Almacenar en 4 ° C, anticuerpo primario utilizado para la inmunofluorescencia, diluido 1/100 cuando se usa
Anti-OCT4	abcam	ab19857	Almacenar a 4 & grados; C, anticuerpo primario utilizado para la inmunofluorescencia, diluir 1/100 cuando se usa
AF488 burro anti-ratón	IgG Invitrogen	A21202	Almacenar a 4 & grados; C, anticuerpo secundario utilizado para la inmunofluorescencia,  diluir 1/500 cuando se usa
PE anti-humano anticuerpo TRA-1-60-R	Biolegend	330610	Almacenar a 4 & grados; C, anticuerpo utilizado para la citometría de flujo
eFluor 570-conjugado anti-SSEA4	eBioscience	41-8843	Almacenar en 4 & grados; C, anticuerpo utilizado para la citometría de flujo
Isotipo anticuerpo	eBioscience	11-4011	Almacenar a 4 & grados; C, anticuerpo utilizado para la citometría de flujo
Kit de detección de fosfatasa alcalina	SiDanSai	1102-100	Almacenar a 4 & grados; C
Kit de extracción de ADN genómico	TIANGEN	DP304-02	Almacenar en RT
Solución de Trypan Blue	Sigma	T8154	Almacenar en RT
Citometría de flujo analizador	BD	LSRII
Disco giratorio Microscopio confocal (SDC)	PerkinElmer	UltraVIEW VOX	para imagen confocal
Dispositivo de nucleofección	Lonza	Nucleofector 2b	para la nucleofección de PB MNC
ImageQuant LAS-4010	GE		para tomar fotos de la tinción de AP a granel

C celular