Summary
Мы представляем три новых и более эффективных протоколов дифференцировки человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и клетки гладкой мускулатуры и способ доставки, который улучшает приживление пересаженных клеток путем объединения инъекции клеток с патч-опосредованной доставки цитокина.
Abstract
Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) должны быть полностью дифференцируются в специфические типы клеток перед введением, но обычные протоколы для дифференциации hiPSCs в кардиомиоциты (hiPSC-КМВ), эндотелиальные клетки (hiPSC-ЭКС), и клетки гладкой мускулатуры (СМЦ) часто ограничена низким выходом, чистотой, и / или плохой стабильности фенотипической. Здесь мы представляем новые протоколы для генерации hiPSC-КМВ, -ECs и -SMCs, которые могут быть значительно более эффективными, чем традиционные методы, а также способ объединения инъекции клеток с цитокинами, содержащий патч, созданный по месту введения. Пластырь улучшает как удерживание инжектированных клеток, путем герметизации след иглы, чтобы предотвратить клетки от вытесняют из миокарда и выживаемости клеток, освободив инсулиноподобного фактора роста (ИФР) в течение длительного периода. В свином модели повреждений миокарда после ишемии-реперфузии, скорость приживления была более чем в два раза больше, когдаКлетки вводили с цитокинами, содержащий пластырь по сравнению с клетками без пластыря, и лечение обоими клетками и пластыря, но не с одним только клетками, было связано со значительным улучшением функции сердца и размера инфаркта.
Introduction
Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) являются одними из наиболее перспективных агентов для регенеративной клеточной терапии, потому что они могут быть дифференцированы в потенциально неограниченного круга и количества клеток, которые не отторгаются иммунной системой пациента. Тем не менее, их способность к самовоспроизведению и дифференциации может также привести к образованию опухоли и, следовательно, hiPSCs должны быть полностью дифференцируются в специфические типы клеток, такие как кардиомиоциты (КМВ), эндотелиальные клетки (ПАУ) и клеток гладкой мускулатуры (СМЦ ), перед введением. Одним из наиболее простых и наиболее распространенных способов введения клеток является прямым интрамиокардиальной инъекции, но количество трансплантированных клеток, которые привиты нативным ткани миокарда является исключительно низким. Большая часть этого истирания может быть связано с цитотоксической среды ишемизированной ткани; Однако, когда мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) вводили непосредственно в миокарде неповрежденных сердца, оолько ~ 40% из 5 миллионов клеток доставленных были сохранены в течение 3-5 ч 1, что свидетельствует о том , что значительная часть вводимых клеток покинул сайт администрации, возможно , потому , что они были вытеснены через игольное дорожки с помощью высоких давлений , создаваемых в ходе инфаркт сокращение.
Здесь мы представляем новые и значительно более эффективные методы для генерации hiPSC полученных из кардиомиоцитов (hiPSC-КМВ) 2, эндотелиальные клетки (hiPSC-ЭКС) 3, и клетки гладкой мускулатуры (СМЦ) 4. Следует отметить, что этот протокол hiPSC-SMC является первым , чтобы имитировать широкий спектр морфологических и функциональных характеристик , наблюдаемых в соматической SMCs 5, направляя клетки к преимущественно синтетическим или сократительной фенотипа SMC. Мы также предлагаем способ доставки клеток, что повышает скорость приживления клеток, инъецированных путем создания цитокинами, содержащей фибрин-рATCH над местом инъекции. Пластырь по-видимому, улучшить и удержания клеток, путем герметизации след иглы, чтобы предотвратить клетки от выхода из миокард, и выживаемость клеток, освободив инсулиноподобного фактора роста (ИФР) в течение по крайней мере трех дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры выполняются в соответствии с Руководством животных Университета штата Алабама в Бирмингеме.
1. Дифференциация hiPSCs в hiPSC-CMs
- Покрывают лунки 6-луночного планшета с предварительно охлажденный фактора роста сниженном желатиновой белковой смеси при 4 ° С в течение ночи. Аспирируйте желеобразную смесь белка перед использованием. Семя hiPSCs на предварительно покрытых пластинами и культуры клеток (1 × 10 5 клеток на лунку) в 5% CO 2 и 37 ° C в mTeSR1 среде добавки с ингибитором ROCK 10 мкМ.
- Обновите среду ежедневно до тех пор, пока клетки не достигают 90% слияния; Затем, добавить фактора роста-уменьшенную желеобразную смесь белка в среде (0,5 мг желатиновой смеси белка на 6-луночный планшет, 2 мл среды на лунку), и культуру клеток в течение 5% CO 2 и 37 ° С еще два дня.
- Для замены среды, аккуратно высасывают среду из чашек Петри с помощью вакуума свне касаясь клетки, и добавить новую среду с помощью пипетки передачи.
- Инициирование дифференциацию путем замены среды с RPMI1640, дополненной фактором роста пониженным желеобразную смесь белка, B27 без инсулина, и 100 нг / мл активин А; культивирования клеток в 5% CO 2 и 37 ° С в течение 24 ч.
- Заменить среду с RPMI1640, который дополнен B27 без инсулина, 10 нг / мл белка костного морфогенетического 4 (BMP-4), и 10 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF); культивирования клеток в 5% CO 2 и 37 ° С в течение 96 часов.
- Заменить среду с RPMI1640 , дополненную В27 и продолжают культивирования клеток в 5% CO 2 и 37 ° С; обновить среду каждые 3 дня.
- Отметим, кластеры заражения клеток под микроскопом ~ 3 дня после начала дифференцировки. Сбор кластеров ~ 7 дней после того, как первые наблюдения за сокращениями и промойте их в Hanks сбалансированным солевым раствором,
- Диссоциировать кластерные-клеток в пластине путем выдержки их в термостате в Hanks-буфере, содержащем 100 ед / мл коллагеназы IV в течение 10 мин при 37 ° С при осторожном встряхивании; Затем, добавьте 0,25% трипсина в этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 5 мин.
- Нейтрализовать раствор фермента с 10% фетальной телячьей сыворотки в среде RPMI / B27 среды, а затем клетки вновь суспендируют в среде RPMI / B27 среды.
- Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Культуры клеток на 10 см чашки на 5% CO 2 и 37 ° С в течение не менее 3 ч, что позволит некардиомиоцитов клеткам прилипать к поверхности культуры блюдо.
- Сбор клеточной суспензии, которая содержит hiPSC-КМВ, и поддержания клеток (около 1 × 10 6 клеток на 10 см блюдо) при культивировании их на желатиновой смеси белков -покрытие поверхности.
2. Дифференциация hiPSCs в hiPSC-КЭ
- Диссоциируют население hiPSC на отдельные клетки путем инкубирования тысEM с хелатирующим агентом , в 5% CO 2 и 37 ° С в течение 5 мин. Передача клетки в центрифужную пробирку 15 мл свежей среды, содержащей mTeSR1.
- Спин вниз клетки при 200 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в среде, дополненной mTeSR1 с ингибитором ROCK 10 мкМ. Определить плотность клеток с помощью гемоцитометра.
- Добавить 250 мкл 20 NIH ед / мл раствора тромбина в одну лунку 24-луночного планшета.
- Добавляют 1 х 10 6 hiPSCs до 250 мкл 12,5 мг / мл раствора фибриногена. И добавьте 250 мкл клеточного раствора, содержащего фибриноген с тромбином нагруженных хорошо. Заметим, смесь затвердевает с образованием hiPSC-содержащей фибрин эшафот в течение мин.
- Перенесите затвердевший клеток, содержащих каркасы в лунки 6-луночного планшета с покровным стеклом щипцов, и инициируют дифференцировку культивированием подмости на 2 мл среды EBM2 дополненной 2% B27 без инсулина, активин-А (50 нг / мл), и ВМР-4 (25 нг / мл) в течение 24 ч при 5% CO
- Замените среду, осторожно высасывая старую среду с помощью вакуума, не касаясь клетки. Добавить новый EBM2 среду, дополненную B27 без инсулина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF, 50 нг / мл), эритропоэтин (ЭПО, 100 нг / мл) и трансформирующий фактор роста бета 1 (TGF 1, 10 нг / мл) и культуры каркасы на 5% CO 2 и 37 ° C в течение 48 часов.
- Обновите среду и культуру каркасах на 5% CO 2 и 37 ° С в течение еще 48 часов; Затем, освободить клетки от эшафота добавлением 200 U коллагеназы IV (100 ед / мл) в среде.
- Спин вниз клетки после того, как они будут освобождены. Заменить среду с 2 мл среды EGM2-MV, дополненной 2% B27, VEGF-A (50 нг / мл) и SB-431542 (10 мкМ); обновить среду каждые два дня.
- Примерно через 10 дней (то есть, на ~ 14 день после того, как дифференцировка было начато), диссоциируют клеток с 100 ед / мл коллагеназы IV, изолируют чIPSC-КЭ из популяции дифференцированных клеток с помощью проточной цитометрии анализа для экспрессии EC-специфических белков - маркеров (например, CD31, CD144) 3.
- Разверните изолированные hiPSC-ECs с помощью установленного протокола 3.
3. Дифференциация hiPSCs в hiPSC-SMCs
- Семя hiPSCs на тарелки , которые были покрыты желатиновой белковой смеси, и культуры клеток в mTeSR1 среде на уровне 5% CO 2 и 37 ° C, с ежедневными средними изменениями, до конфлюэнтного (~ 2 дня).
- Инициирование дифференцировки в мезодермальный-линии дифференцировки клеток при культивировании клеток с CHIR99021 (5 мкМ) и BMP-4 (10 нг / мл) в среде RPMI1640, и 2% B27 плюс инсулина в течение 3-х дней.
- Для получения hiPSC-СМЦ с преимущественно синтетическим фенотипа:
- Культуры клеток с VEGF-A (25 нг / мл), фактора бета роста фибробластов (FGFβ, 5 нг / мл) в RPMI1640 меня DIUM, и 2% B27 минус инсулин в 5% CO 2 и 37 ° С в течение 4 дней.
- Культуры клеток в VEGF-A (25 нг / мл), FGFβ (5 нг / мл) в среде RPMI1640, и 2% В27 плюс инсулин в 5% CO 2 и 37 ° C в течение 2-х дней.
- Культуры клеток в тромбоцитарный фактор роста бета (PDGFβ, 10 нг / мл), TGF - beta (3 нг / мл) в RPMI1640, и 2% B27 плюс инсулина на уровне 5% CO 2 и 37 ° C в течение 4-х дней.
- Для получения hiPSC-СМЦ с преимущественно сократительной фенотипа:
- Культуры клеток в течение 4 дней с VEGF-A (25 нг / мл) и FGFβ (5 нг / мл) в RPMI 1640 и 2% В27 минус инсулина.
- Культуры клеток в течение 7 дней с PDGFβ (5 нг / мл) и TGF-beta (2,5 нг / мл) в RPMI1640 и 2% B27 плюс инсулина.
- Очищают конечные популяции hiPSC-SMC культивированием клеток в лактат (4 мМ) RPMI1640, содержащей метаболическую среду в течение ~ 6 дней.
- Тепло оливковое масло до 45 ° С в водяной бане.
- Тепло 5 мл 10% раствора желатина до 50 ° С.
- Добавить желатин в оливковое масло, перемешать, а затем быстро охлаждают до 5 ° С путем добавления льда на водяной бане.
- Двадцать пять минут позже, добавьте охлажденную (4 ° С) ацетон в оливковом масле, чтобы вызвать образование микросфер.
- Поддерживать температуру на уровне 5 ° С в течение 1 ч; Затем, собирают микросферы, мыть их 5 раз с помощью предварительно охлажденного ацетона, чтобы удалить оливковое масло, и дайте им высохнуть на воздухе при температуре 4 ° С.
- Ресуспендируют микросфер в растворе 70% этанола и 0,25% глутаральдегида в течение ночи при температуре 4 ° С, чтобы вызвать образование поперечных связей, а затем нейтрализуют смесь с помощью 100 мМ глицина.
- Нагрузка ИФР в микросферы путем смешивания 5 мг микросферы с 15 мкл дистиллированной H 2 O , содержащей 5 мкг ИФР и 0,1% бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин.
5. Создание повязкой на месте повреждения и инъекционное клеток
- Приостановить hiPSC производный CMs (2 млн), SMCS (1 миллион) и ECs (1 миллион) вместе в 1 мл Minimum Essential Medium (MEM).
- Приостановка 5 мг микросфер в 1 мл раствора фибриногена (25 мг / мл).
- Заполните один шприц с клеточным раствором , содержащим, еще один шприц с раствором фибриногена / микросферы, а третий шприц с 1 мл раствора тромбина (80 единиц NIH / мл, с добавлением 2 мкл 400 мМ CaCl 2 и 200 мМ ε-аминокапроновая кислота).
- Хирургически вызывают инфаркт миокарда в свином сердце через лигирования левой передней нисходящей коронарной артерии , как описано выше 2.
Примечание: Короче говоря, женский Yorkshire свиней (~ 13 кг, 45 дней возраста) седатированы с внутримышечной инъекцией Telazol / ксилазин (4,4 мг / кг), и интубацию под общим наркозом с изофлуран (0,5-5%). А 4 - й Intercostal торакотомии выполняется и левой передней нисходящей коронарной артерии подвергается. Коронарной артерии окклюзии с помощью лигатуры в течение 60 мин, а затем лигатуру удаляется. Непосредственная электрическая дефибрилляция выполняется в случае фибрилляция желудочков. - Поместите стерильную пластиковое кольцо (~ 2,5 см) на эпикарда инфарктом области свиного сердца, а затем одновременно вводят микросферы / фибриногена и тромбина решения в кольцо.
- Дайте смеси затвердеть (~ 30 сек), а затем вставить иглу клеток, содержащих шприца через затвердевшей смеси в инфарктом миокарда и вводят клетки. Закройте мышечные слои, подкожные ткани и стенки грудной клетки с 3-0 или 2-0 Monocryl швом в зависимости от размера животного. Бупренорфин 0,01-0,02 мг / кг внутримышечной инъекции через каждые 8 ч будет использоваться для контроля боли в течение первых 3-х дней после операции.
- Оценка функции сердца с использованием сердечного магнитного резонансатомография (МРТ) перед хирургической процедуры, через неделю и через четыре недели после хирургической процедуры 2, 3, 4. После заключительных исследований МРТ, принести в жертву животное и обрабатывать их сердца для гистологического и молекулярного анализа 2, 3, 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Характеристика дифференцированной hiPSC-КМВ, -ECs и -SMCs
Дифференциальная емкость hiPSCs оценивали 2, 3, 4. Проточная цитометрия анализ экспрессии кардиального тропонина Т (cTnT) свидетельствуют о том , что чистота конечного hiPSC-СМ населения может превышать 90% (рисунок 1A, 1B, панель B1). Почти все клетки выражены медленную тяжелой цепи миозина (Фигура 1В, панель А1), α-саркомера актин (рисунок 1В, панель А2), в то время как примерно 25% выразили 2v изоформы легкой цепи миозина (MLC2v) (рис 1B, панель В2), который был обнаружен только в желудочковой системы управления контентом 4. Эффективность протокола hiPSC-EC дифференциации (т.е. процент от CD31 + клеток) была субстанциLLY выше , когда выступал с hiPSCs от линии захватами (45,6%, рис 1C, панель C2) , чем с PCBC16iPS клетками (31,3%, рис 1C, панель D2); популяции чистоты> 95% были достигнуты с помощью селекции для экспрессии CD31, и> 90% из отобранных клеток продолжали выражать CD31 или CD144 на срок до 4 недель при культивировании в среде EGM2-MV (без FBS), дополненной В27, VEGF, и SB431542 (рис 1D) 3. Более 94% очищенного hiPSC-SMCs выражается актин гладких мышц (SMA), но синтетический hiPSC-SMCs чаще , чем сократительной hiPSC-SMCs выразить коллаген 1, коннексин 43 или виментин (рис 1E). Миграция и пролиферация способность hiPSC-SMCs оценивали 4. Синтетические hiPSC-SMCs были также более перелетных и пролиферативная , чем сократительной hiPSC-SMCs (рис 1F, панели I И II), в то время как сократительные SMCs контракт сильнее яРеакция на лечение карбахола (Рисунок 1F, панелей III, IV и V).
Рост-фактор-релиз из желатиновых микросферы
Измерения ELISA на IGF-1 уровня в среде из культивируемых, не содержащих клеток пятен показали , что фактор роста был выпущен из микросфер в течение периода , по меньшей мере , 3 -х дней (фиг.2А) 2. Анализы проводили путем загрузки 5 мг ИФР-содержащих микросферы с 5 мкг ИФР-1. Пластырь был сгенерирован смешением микросфер с 1 мл раствора фибриногена и 1 мл тромбина. Пластырь культивировали в 2 мл MEM. Один мл среды собирали и замещают 1 мл свежей MEM каждый день (Фигура 2В). Данные были представлены в виде среднего значения ± SEM.
Наблюдения с ИК-травмы Модель
2. В общей сложности 6 миллионов hiPSC-КМВ, -ECs и -SMCs (2 млн каждого типа клеток) вводили непосредственно в травмированной ткани миокарда. Для животных в клетке + Patch группы, патч состоит из фибрина и ИФР-1, содержащей микросферы, был создан более в месте повреждения перед инъекцией, в то время как животные в группе клеток обрабатывали в той же дозе, но без клеточной пластыря; оба препарата были удержаны от животных в группе MI. Через четыре недели после травмы и лечения, 9% клеток , доставленных животных в клетке + Patch группе были сохранены и продолжали выживать в месте введения, по сравнению с только 4% клеток вводили животным в группе CELL (рис 3A). Лечение с обеих клеток и патч, но не с одним только клетками, также associзначительное улучшение знаний в области измерения сердечной функции и размера инфаркта (рис 3B).
Рисунок 1: Разграничение hiPSCs в кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и клетки гладкой мускулатуры. Кардиомиоциты дифференцировка и чистота hiPSC-CMs оценивали с помощью проточной цитометрии (А) и гистологии с различными кардиомаркеров (В). Эндотелиальный дифференциация hiPSC определяли с помощью проточной цитометрии (C). Поддержание эндотелиальной фенотипа hiPSC-КЭ оценивали с помощью анализа экспрессии CD31 и CD144 на 2 -х , 3, и 4 -х недель после очистки с помощью проточной цитометрии (D). Гладкомышечных клеток дифференциация hiPSC измеряли с помощью различных маркеров (E). И миграцией и пролиферацией потенциалсинтетические клетки гладких мышц против сократительных клеток гладких мышц , полученных из hiPSCs оценивали (F). Ядра контрастно с DAPI в иммунофлуоресцентного окрашивания. Шкала бар = 100 мкм в (В) и 200 мкм (E и F). Миграция и пролиферация способность синтетического hiPSC-SMCs оценивали (F, панель I и II). И сокращение сократительных SMCs в ответ на лечение карбахола оценивали (F, панель III-V). * Р <0,05, синтетический hiPSC-SMCs против сократительной hiPSC-SMCs. А и В были модифицированы из Е. L и др. 2. C и D были модифицированы с Чжан S и др. 3. E и F были изменены из Yang L, и др. 4. Данные были представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). Сравнение между двумя группами оценивали с помощью Т-теста Стьюдента, и сравнение между несколькими группами оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа. р <0,05 рассматривалась знау него перебор. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Высвобождение факторов роста с микросферами. Был синтезирован ИФР-содержащие микросферы (А). Релиз ИФР-1 из микросфер измеряли при 1, 3, 5 и 7 дней после того, как они были синтезированы (B). Шкала бар = 200 мкм. Панель А была изменена с Е. Л., и др. 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Оценка эффективности клеточной терапии с hiPSC-производными trilineage челлевая сторона Общий показатель приживления для населения трех клеток оценивали через 4 недели после трансплантации клеток (A). Сердечный функции (как указано фракции выброса) и размер инфаркта оценивали с помощью МРТ сердца через 1 и 4 недели после трансплантации клеток (B). * Р <0,05 по сравнению с ИМ; #p <0,05 по сравнению с патч. А и Б были изменены из Е. Л., и др. 2. Данные были представлены в виде среднего значения ± SEM. Были проанализированы Сравнения между группами по значимости с односторонним ANOVA. р <0,05 считается значительным. Результаты были определены как значимые с помощью ANOVA были переосмыслены с коррекцией Тьюки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Повышение доходности / Чистота hiPSC-CMs
Обычные протоколы для дифференциации человеческих стволовых клеток в CMs часто ограничены низким выходом и чистотой; например, только 35-66% ЭСК-CMs получают путем разделения перколла и формирования сердечной тела выражается медленную тяжелой цепи миозина или cTnT 6. Чистота дифференцированных популяций hiPSC-CM может быть существенно увеличена путем выбора для экспрессии гена - репортера , который был связан с промотором СМ-специфический белок 7, 8, 9, но этот метод обязательно требует использования генетически модифицированных клетки, которые менее желательны, особенно для клинических исследований. С протоколом, представленной здесь, 68% от hiPSC-CMs выразил cTnT, и чистота была впоследствии увеличена до> 90% через микро-рассечение и без генетических перед металлизацией манипуляций или одного-клетка выбор. Общий выход составил ~ 3-5 млн hiPSC-CMs на лунку.
Повышение доходности / Устойчивость hiPSC-КЭ
Два наиболее часто используемые протоколы дифференцировки hiPSC-ЕС основаны на совместном культивировании с мышиными клетками стромы 10, 11 и формирования эмбрионального тела 12, 13. Тем не менее, метод сокультивирования может привести к загрязнению ксеногенного с мышиным-линии дифференцировки клеток или белков 10, и лишь на ~ 15% или менее от клеток , полученных с помощью метода эмбриональной тел допускают фенотип EC 10, 12, 13. Протокол дифференциации hiPSC-ЕС, представленный здесь устраняет риск загрязнения ксеногенного и может быть до 3-х раз более эффективным, чем методы, которые используют эмбриональные органы (в зависимости от используемого hiPSC линия). Furthermруда, после очистки с помощью селекции для экспрессии CD31, ~ 90% от hiPSC-КЭ поддерживали фенотип EC по крайней мере 4 недели в пробирке, по сравнению с всего за две недели , когда hiPSC-КЭ производятся с помощью обычных протоколов дифференцировки 12.
Фенотипическая Спецификация hiPSC-SMCs
Фенотип из SMC (или популяция SMCs), пожалуй, лучше всего можно описать как баланс между преимущественно сократительных и синтетическими характеристиками, что может привести к существенным различиям в морфологии, экспрессии маркеров и активности. Таким образом, полезность hiPSC-SMCs для конкретного применения может зависеть от того, какой конкретно фенотип генерируется. Дифференциации и очистки протоколов hiPSC-SMC, представленные здесь, являются первыми, чтобы производить преимущественно сократительные или синтетические популяции SMC, которые являются ~ 95% чистого всего за 2-3 недели, а риск заражения ксеногенного минимальна, поскольку процедуры не RequIRE использование фидерных клеток.
Улучшение приживления Темп трансплантированных клеток
Одной из основных проблем , препятствующих эффективной клеточной терапии , как полагают, чрезвычайно низкое количество вводимых клеток, которые привиты миокардом 14, 15, 16, 17. Цитокины , такие как IGF-1 может улучшить приживление, позволяя клеткам лучше противостоять токсическим микросреду в ишемизированных тканей 18, 19, 20, но высокие давления , индуцируемые при сжатии может сжать клетки через траекторией иглы и в периферическом кровотоке. Таким образом, значительно более высокая скорость приживления достигается путем введения в клетки через фибрина патч ИФР-1-содержащий, что более чем в 2 раза больше, чем скорость наблюдается, когда Сэмудоза электронной клеток вводили без пластыря, вероятно, можно отнести как к Цитопротекторное эффектам IGF-1 и к самому пластыря, который образовался физический барьер, который предотвратил клетки от выбрасываемых в эпикардиального пространство.
Критические шаги
Для обеспечения плюрипотентности клеток HIPS, необходимо проверить кариотип линии hiPSC до дифференциации, определяют экспрессию маркеров плюрипотентности (Nanog, SSEA1 и Oct4, и др.), И подтвердить их способность образования тератомы , Предлагается повторно проверить их плюрипотентности, когда hiPSC линии были пассировать в течение более 10 поколений. Статус недифференцированной hiPSC также имеет решающее значение для правильной дифференциации. Для того, чтобы обеспечить статус hiPSC до начала дифференцировки, рекомендуется: 1) использовать свежую среду (менее двух недель), и обновить среду ежедневно до начала hiPSC differentiatиона; 2) уменьшить время ферментативного расщепления (менее 5 мин), и осторожно пипеткой вверх и вниз клетки, чтобы предотвратить ненужное повреждение клеток; 3) replate клеток при плотности 1 × 10 5 клеток на лунку 6-луночного планшета; 4) всегда держать клетки в 37 ° С и 5% CO 2 инкубаторе, и избежать сохранения клеток из инкубатора в течение более 15 мин.
Ограничения техники
Основной недостаток нашего метода для объединения инъекционные hiPSC полученных кардиомиоциты и введение патч является требование к операции открытой грудной клетке; Таким образом, этот подход вряд ли будет непосредственно переводимые в клинической практике, за исключением в качестве дополнительной терапии для пациентов, которые проходят параллельную коронарной хирургии реваскуляризации. Более широкое клиническое применение потребует разработки практического и минимально инвазивной способ доставки, такие как endoscope- и основанного на применении катетера подход, который может получить доступсердце через живот и диафрагму. Кроме того, одна из наиболее важных проблем безопасности , связанных с клеточной терапии сердечной является развитие аритмогенных осложнений, и когда обезьяны обрабатывали интрамиокардиальной инъекций 1 млрд чЭСК происхождения КМВ, все четыре животных развилась спонтанных аритмий 21. Тем не менее, мы не наблюдали никаких признаков аритмогенных осложнений , когда 10 миллионов hiPSC полученных CMs вводили в сердца свиней с ИК - 2 травмы, возможно , потому , что доза клеток была в 100 раз меньше.
Будущие приложения или направления
Иммунное отторжение, вероятно, играет важную роль для низкой скорости передачи приживление. Cas система CRISPR / редактирование ген может позволить исследователям создать линию "универсальным донором" hiPSCs путем выбивают (KO) главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I и класса II. В hiPSC MHC-KO, полученные клетки и ткани могут чпр существенно более высокие показатели приживления. Как улучшить методы, приживление ставки, вероятно, возрастет. В определенный момент увеличения размера трансплантата, большой лоскут ожидается увеличение arrhythmogenicity сердца реципиента. Снижение трансплантатов, связанных arrhythmogenicity может быть достигнуто за счет использования клеток с увеличением экспрессии белков ответвительные разрыв по технологии редактирования гена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никто.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
