Este protocolo describe un ensayo para medir la función de CFTR y las respuestas de los moduladores de CFTR en tejido cultivado de sujetos con fibrosis quística (FQ). Los organoides intestinales derivados de la biopsia se hinchan de forma impulsada por el AMPc, una respuesta que es defectuosa (o muy reducida) en los organoides de la FQ y que puede restaurarse mediante la exposición a los moduladores de CFTR.
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Artículo de método
Inducida por la forskolina Hinchazón en organoides intestinal: Una
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Resumen
Resumen
Los fármacos moduladores del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) recientemente desarrollados corrigen la expresión superficial y/o la función del canal CFTR mutante en sujetos con fibrosis quística (FQ). La identificación de los sujetos que pueden beneficiarse de estos fármacos es difícil debido a la gran heterogeneidad de las mutaciones de CFTR, así como a otros factores desconocidos que contribuyen a la eficacia individual de los fármacos. Aquí, describimos un ensayo simple y relativamente rápido para medir la función y la respuesta individuales de CFTR a los moduladores de CFTR in vitro. Los organoides epiteliales tridimensionales (3D) se cultivan a partir de biopsias rectales en medio organoide estándar. Una vez establecidos, los organoides pueden ser bio-almacenados para análisis futuros. Para el ensayo, se siembran entre 30 y 80 organoides en placas de 96 pocillos en la matriz de la membrana basal y luego se exponen a fármacos. Un día después, los organoides se tiñen con verde calceína y la hinchazón inducida por forskolina se controla mediante microscopía confocal de células vivas a 37 °C. La hinchazón inducida por forskolina es totalmente dependiente de CFTR y es lo suficientemente sensible y precisa como para permitir la discriminación entre las respuestas a los fármacos de individuos con mutaciones de CFTR diferentes e incluso idénticas. Las respuestas de hinchamiento in vitro se correlacionan con la respuesta clínica al tratamiento. Este ensayo proporciona un enfoque rentable para la identificación de individuos sensibles a los fármacos, independientemente de sus mutaciones en CFTR. También puede ser fundamental en el desarrollo de futuros moduladores CFTR.
Introducción
CF está causada por mutaciones en el gen de la fibrosis quística regulador de la conductancia transmembrana (CFTR) que codifica un canal de aniones epitelial. CF afecta a aproximadamente 85.000 personas en todo el mundo 1. Más de 2.000 mutaciones CFTR se han identificado ( www.genet.sickkids.on.ca ). Esta diversidad explica parcialmente un amplio espectro de fenotipos de la enfermedad observados ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Seis clases de mutaciones CFTR se definen en función de su efecto sobre la expr....
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Protocolo
Toda la experimentación utilizando tejidos humanos descritos en este documento fue aprobado por el comité de ética de la Universidad del Centro Médico de Utrecht (UMCU; TcBio # 14-008). El consentimiento informado para la recogida de tejidos, generación, almacenamiento y uso de los organoides se obtuvo de los pacientes en el Hospital -UMCU (WKZ) Wilhelmina niños.
| Equipo | Consumible | Herramientas |
| Campana de flujo laminar | 15 y 50 ml tubos cónicos | Zeiss LS.... |
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Resultados
La figura 1A muestra un aislamiento fresca representante de criptas incrustados en BMM. Las criptas son de una biopsia de colon de un sujeto CF. Por lo general, un organoide se genera a partir de cada cripta (Figura 1A - C). Debido a la disfunción de la CFTR, la mayoría de los organoides de colon CF no son quística, sino más bien son compactos y con proyecciones y injertos (Figura 2A - 2B). Sin embargo, .......
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Discusión
A continuación, ofrecemos un protocolo completo para la generación, la expansión, la congelación, descongelación y de organoides colorrectal humano. Si bien hemos establecido culturas organoides humanos alguna vez hace 17 años, que a veces ha sido difícil establecer la tecnología en otros laboratorios sin la formación práctica. Anticipamos que estos protocolos se sustituya dicha formación.
Wnt-3A-medio condicionado es uno de los reactivos más importantes para tener éx.......
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Divulgaciones
Hans Clevers es un inventor de patentes para el cultivo de organoides y el ensayo de hinchazón inducida por forskolina. Jeffrey M Beekman es un inventor de una patente para el ensayo de hinchazón inducida por forskolina. Sylvia F Boj y Robert Vries son empleados de la Fundación Hubrecht Organoid Technology (HUB), que posee la licencia exclusiva de la tecnología Organoid. De lo contrario, los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el programa HIT-CF de los holandeses CF fundación (CNSF), ZonMW (40-00812-98-14103), el Fondo de Investigación del Hospital Infantil Wilhelmina y CZ, y Zilverenkruis / Achmea. Nos gustaría dar las gracias a S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, y G. Berkers (Departamento de Neumología Pediátrica, el Hospital de Niños Wilhelmina, UMC Utrecht), y RHJ Houwen (Departamento de Gastroenterología Pediátrica, Wilhelmina hospital de niños, UMC Utrecht) para acercarse a los pacientes y obtener las biopsias para la generación de un CF Biobanco.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco avanzado' s Águilas Modificadas Medio con Mezcla de Nutrientes F-12 Jamones (Ad-DF) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | almacenado a 4 ° C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | almacenado a 4 & grados; C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | almacenado a 4 & grados; C |
| Penicilina/estreptomicina | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | almacenado a -20 ° C |
| placa de cultivo de 96 pocillos | Cellstar | #655180 | |
| placa de cultivo de 24 pocillos | Cellstar | #662160 | |
| placa de cultivo de 6 pocillos | Cellstar | #657160 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | almacenado a 4 & grados; C |
| Dulbecco' s Águilas Modificadas Medium (DMEM) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | para la producción de medios acondicionados Wnt-3A. Almacenado a 4 ° C |
| Suero fetal bovino (FBS) | Bovogen | #SFBS LOTE # 11113 | para la producción de medio acondicionado Wnt-3A. Almacenado a -20 ° C |
| L Wnt3A línea celular | ATCC | #CRL-2647 | para la producción de medios de condición Wnt-3A. |
| Plásmidos TOP/FOP | Millipore | #17-285 | Para medir la actividad |
| de Wnt pTK-Renilla | Promega | #E2241 | Para medir la actividad de Wnt |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | Para medir la actividad de Wnt |
| Sistema de ensayo reportero de luciferasa dual | Promega | #E1910 | Para medir la actividad de Wnt |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | para Wnt-3A Selección de línea celular |
| B27 suplemento | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | almacenado a -20 ° C |
| N-acetilcisteína | Sigma Aldrich | #A9165-5G | almacenado a -20 ° C |
| Nicotinamida | Sigma Aldrich | #N0636 | almacenado a -20 ° C |
| Factor de crecimiento epitelial humano (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | almacenado a -20 ° C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | almacenado a -20 ° C |
| TGFb tipo I Inhibidor del receptor (A83-01) | Tocris | #2939 | almacenado a -20 ° C |
| Y-27632 diclorhidrato (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | almacenado a -20 ° C |
| p38 Inhibidor de MAPK (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | almacenado a -20 ° C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | almacenado a -20 ° C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | almacenado a -20 ° C |
| R-espondina 3 humana (hRspo-3) | R& D Systems | #3500-RS/CF | almacenado a -20 ° C |
| Vancomicina | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | almacenado a -20 ° C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | almacenado a -20 ° C |
| Ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Almacenado a 4 & grados; C |
| Matrigel | Corning | #354230 | almacenado a -80 ° C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | para tripsinizar organoides para congelar |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium Life | Technologies: Gibco | #12648010 | para congelar |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | almacenado a -20 ° C |
| Forskolin | R& D Systems | #1099-50 mg | almacenado a -80 ° C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | almacenado a -80 ° C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | almacenado a -80 ° C |
| Nombre de los reactivos/Material | Disolvente | Concentración de stock | Concentración final |
| GlutaMax | 200 mM | 2 mM | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicilina/Estreptomicina | 10K U/ml 10K µ g/ml | 100 U/ml 100 y micro; g/ml | |
| de Zeocin | 100 mg/ml | 125 y micro; g/ml | |
| de suplemento B27 | 100x | 1x | |
| N-acetilcisteína | MiliQ H2O | 500 mM | |
| Nicotinamida | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Factor de crecimiento epitelial humano (hEGF) | DPBS 0,1% BSA 0,5 | mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µ M | 10 nM |
| Inhibidor del receptor TGFb tipo I (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 diclorhidrato (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 y micro; M |
| p38 Inhibidor de MAPK (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 y micro; M |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 y micro; g/ml | |
| Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µ g/ml | 100 ng/ml |
| R-espondina humana 3 (hRspo-3) | varía por lote | 300 ng/ml | |
| Vancomicina | 10 mg/ml | 50 y micro; g/ml | |
| Gentamicina | 10 mg/ml | 50 y micro; g/ml | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | MiliQ H2O | 0,5 M | 2 mM |
| Calceína | DMSO | 10 µ g/ml | 3,3 ng/ml |
| Forskolina | DMSO | 10 mM | variable |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |
Referencias
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- ....
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Reimpresiones y permisos
