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Artículo de método

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

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DOI:

10.3791/55160

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6 de enero de 2017

 , 
1Department of Cell and Development Biology, Vanderbilt University Medical School

En este artículo

Resumen

Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 - 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.

Resumen

protocolos de islotes de aislamiento a base de perfusión de grandes páncreas de mamíferos están bien establecidos. Tales protocolos se llevan a cabo fácilmente en muchos laboratorios, debido al gran tamaño del conducto pancreático que permite la inyección de colagenasa listo y la perfusión tisular subsiguiente. En contraste, el aislamiento de los islotes de páncreas pequeña, como la de los ratones recién nacidos, es un reto porque la perfusión no se puede lograr fácilmente en la pequeña páncreas. Aquí se describe un procedimiento sencillo detallada que recupera un número sustancial de los islotes de ratones recién nacidos con asistencia visual. Recién diseccionado páncreas entero se digirió con 0,5 mg / ml de colagenasa IV disuelto en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) a 37 ° C, en tubos de microcentrífuga. Los tubos se intervenidos con regularidad para ayudar a la dispersión del tejido. Cuando la mayor parte del tejido se dispersó a pequeños grupos alrededor de 1 mm, los lisados ​​se lavaron de tres a cuatro veces con medios de cultivo con 10% de suero bovino fetal (FBS). racimos de islotes,desprovisto de tejidos acinares reconocibles, a continuación, se pueden recuperar bajo disección estereoscopio. Este método recupera 20 - 80 pequeño a islotes de gran tamaño por el páncreas de ratón recién nacido. Estos islotes son adecuados para los ensayos de aguas abajo más concebibles, incluyendo la secreción de insulina, la expresión génica, y la cultura. Un ejemplo de ensayo de secreción de insulina se presenta para validar el proceso de aislamiento. Los antecedentes genéticos y el grado de digestión son los factores más importantes que determinan el rendimiento. Se prefiere solución de colagenasa recién hecha con alta actividad, ya que ayuda en el aislamiento endocrino-exocrino. La presencia de cationes [calcio (Ca2 +) y magnesio (Mg 2+)] en todas las soluciones y suero fetal bovino en el lavado / medios de picking son necesarios para un buen rendimiento de islotes con integridad adecuada. Un microscopio de disección con un buen contraste y la ampliación también ayudará.

Introducción

El aislamiento de los islotes pancreáticos puros es esencial para analizar la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) de las células beta y para el trasplante de islotes de donantes cadavéricos 1-3. También es necesario establecer la expresión génica endocrina en las células de los islotes 4, 5. Para ello, se han establecido protocolos detallados que permiten el aislamiento de los islotes pancreáticos del páncreas grande (6 y referencias en ellos). Estos métodos se basan en la perfusión enzimática para disociar los tejidos acinares de los islotes, junto con la separación en gradiente y la selección manual. Por lo tanto, el aislamiento de los islotes del páncreas grande se puede realizar fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Por otro lado, no existe un protocolo detallado paso a paso que permita el aislamiento de los islotes del páncreas que son demasiado pequeños para perfundirlos.

Estudiar la expresión génica y la función de los islotes neonatales es importante. Los islotes neonatos tienen propiedades diferentes a las de los adultos en la secreción de insulina y en la capacidad de proliferación 7, 8. Sin embargo, aislar los islotes de los animales recién nacidos, especialmente de los ratones, es un desafío debido al pequeño tamaño del páncreas recién nacido. El tamaño impide el proceso de perfusión habitual cuando la colagenasa se inyecta a través del conducto pancreático. De hecho, varios trabajos han presentado estudios en esta línea, con procedimientos de aislamiento enzimáticos o no asistidos por enzimas 7, 9, 10. Sin embargo, se carece de una descripción detallada del proceso de aislamiento de los islotes con ayuda visual 7, 9, lo que dificulta que la mayoría de los investigadores realicen estudios similares.

Hemos explorado varias condiciones diferentes que producen islotes de alta calidad de ratones neonatos. Aquí presentamos un protocolo que se espera ayude a los investigadores a conocer los detalles clave en el proceso de aislamiento de los islotes. Este protocolo es aplicable al páncreas de ratón hasta las dos semanas de edad, después de lo cual se puede realizar la perfusión para el aislamiento rutinario de los islotes. Los islotes se pueden utilizar directamente para la secreción de insulina y los ensayos de expresión génica.

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Protocolo

el uso de animales sigue los procedimientos especificados en el protocolo M / 11/181 aprobada por la Vanderbilt Institucional Cuidado de Animales y el empleo de Gu. ratones CD1 o CBA / Bl6 fueron adquiridos de proveedores comerciales y se cruzaron en las instalaciones de animales de Vanderbilt para obtener ratones recién nacidos.

1. Preparación de los ratones, las soluciones concentradas y equipo

  1. Por la cruz del ratón: configurar una cruz ratón y registrar las fechas de taponamiento para ayudar a la planificación experimental. ratones CD1 por lo general dan a luz alrededor del día 19 después del apareamiento. Uso CD1 o CBA / Bl6 cruces para obtener CD1 o CBA / Bl6 neonatos, respectivamente. Intercrosses entre las dos líneas utilizan hembras y machos CD1 CBA / Bl6.
  2. Para el caldo de colagenasa: se pesan 200 mg de colagenasa tipo IV con un equilibrio de alta precisión. Transferir a un tubo de centrífuga de 50 ml. Disolver en 40 ml de HBSS con Ca 2 + / Mg2 + (1,26 y 0,5 mM, respectivamente) para hacer una solución de 5 mg / mL.
    1. Permitir a la colagenasadisuelva durante ~ 30 min con agitación suave. Alícuota y mantener la solución congelada en -20 ° C como acciones, que permanece activo durante al menos un año.
  3. Autoclave para esterilizar varios pares de pinzas, tijeras y consejos P20 para la disección y la recolección de los islotes.
  4. Para la glucosa stock 1 M: se pesan 9 g de glucosa en un tubo de centrífuga de 50 ml, añadir 50 ml de medio RPMI 1640 para disolver la glucosa. Tenga en 4 ° C hasta su uso, pero no más de 6 meses.

2. Soluciones de Trabajo

NOTA: El día de aislamiento de islotes, preparar los siguientes reactivos.

  1. Para la solución de trabajo de colagenasa tipo IV: descongelación y se diluye colagenasa de valores en hielo. Prescindir de 0,15 ml de stock en cada tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Añadir 1,35 ml de HBSS con Ca2 + / Mg2 +. Invierta el tubo 5 veces. Deja en hielo durante 15 min.
    1. Girar a alta velocidad durante 3 minutos en una microcentrífuga. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Deja en hielo hasta su uso. Desechar el tubo con los restos insolubles.
  2. Para una completa medios RPMI 1640: añadir 2,5 ml de glucosa 1 M, 50 ml de FBS inactivado por calor, y 5 ml de stock 100x pen-strep en 500 ml de RPMI 1640. Deja en hielo hasta su uso.

3. Aislamiento de páncreas y la digestión

  1. La eutanasia a los recién nacidos con isoflurano, seguido por decapitación de acuerdo a los protocolos aprobados.
  2. Coloque el ratón con el vientre hacia arriba. Rociar con 70% de etanol para la esterilización.
  3. Levantar la piel del vientre con pinzas y cortar las capas de piel y músculo longitudinalmente a lo largo de la línea media con un par de tijeras, de la zona genital a la caja torácica. Esto abre la cavidad abdominal para exponer todos los órganos internos.
  4. Transferencia de todos los órganos internos a una placa de 100 cm con un par de pinzas. Busque el páncreas, que es un órgano dispersa con una porción dorsal que se pega al estómago y el bazo y una porción ventral que se aferra al duodeno 11.
  5. Añadir HBSS en el plato para sumergir los órganos. En la solución, los tejidos pancreáticos ya no se aferran al duodeno, estómago, o el bazo. Es fácilmente reconocible bajo un microscopio de disección debido a su típico color blanco. Use un par de pinzas para pelar los tejidos pancreáticos lejos de tejido y transferencia que rodea a una nueva placa de 60 mm con HBSS.
  6. Cortar cada páncreas con una tijera en trozos de menos de 5 mm a través de cualquier dimensión. Transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Hasta cinco páncreas (menores de P7) pueden ser digeridos en un solo tubo. Para los ratones P8-P16, utilizar un tubo por el páncreas.
  7. Añadir 0,5 - solución de trabajo de 1 ml de colagenasa a cada tubo (0,2 ml para cada páncreas P1-P7 Use 0,5 ml para cada páncreas P8-P16.). Deje el tubo en una incubadora a 37 ° para un máximo de 15 min. Invierta el tubo dos veces cada minuto.
  8. Después de ~ 5 min, toque el tubo para supervisar el estado de la digestión del tejido pancreático. Continuar el proceso de digestión hasta que la mayor parte del páncreasel tejido aparece como racimos de células fragmentadas, con un diámetro <2 mm. El lisado aparecerá nublado, lo cual es debido a la autolisis de las células acinares normales.

4. Lavado lisado

  1. Girar el lisado a 500 xg durante 10 s en una microcentrífuga. Eliminar la capa sobrenadante con un Pipetman P1,000. El sobrenadante debería aparecer turbia pero desprovisto de grupos de células. No utilice aspiración, que puede aspirar rápidamente lejos los fragmentos de tejido en la parte inferior debido a la presencia de algo de ADN pegajoso.
  2. Añadir 1 ml de RPMI 1640 completo. Toque en el tubo suavemente para resuspender el lisado fragmentada. Invertir arriba y hacia abajo 10 veces. Repita el paso 4.1.
  3. Repita el paso 4.2 dos veces más o hasta que el sobrenadante aparece clara. Vuelva a suspender fragmentos de páncreas lavados en 1 ml de RPMI 1640 completo de los medios.

5. aislamiento Islet

NOTA: Para un pequeño número de páncreas, directa la recolección manual de la siguiente manera (5.1) se puede utilizar para el aislador del isloteación. Para un gran número de páncreas (> 6), se prefiere el método descrito en 5.2.

  1. la recolección manual directa:
    1. Transferir el lisado de la etapa 4.3 a un plato de 60 mm. Añadir 5 mL RPMI completo 1640. Poner bajo un microscopio de disección.
    2. Configurar la iluminación de campo brillante en el microscopio. Ajustar la intensidad de la luz a ~ 50% de la potencia máxima. Bajo esta condición, islotes aparecen como conglomerados ligeramente de color rosa, mientras que las células acinares racimos de forma irregular como oscuros (Figura 1A). Se recomienda una magnificación de 50X ~ (que combina la potencia del objetivo y el ocular) para ofrecer la mejor manera de islotes visualización y la abertura de la punta de la pipeta para recoger de forma simultánea.
    3. Recoger islotes con una punta de pipeta P20 evitando al mismo tiempo las agrupaciones acinares. Fracciones dispensar islotes-enriquecidos a una nueva placa de 60 mm con RPMI completo los medios de comunicación (Figura 1B).
    4. Repita el proceso de la recolección manual dos veces más. Deja islotes puros en una nueva 60mm placa con 4 medios RPMI completo mL (Figura 1C).
  2. centrifugación en gradiente:
    1. Preparar un tubo de centrífuga de 15 ml que se carga con 2 ml polisucrosa y diatrizoato de sodio a una densidad de 1,077 g / ml. Deje el tubo en hielo hasta su uso.
    2. Transferir la suspensión de la etapa 4.3 en la parte superior de la solución de diatrizoato polisucrosa y sodio con una pipeta Pasteur. No moleste a la capa inferior. Los tejidos de hasta 10 recién nacido o 2 P17 páncreas se pueden cargar en cada tubo de 15 mL.
    3. Girar el tubo a ~ 600 xg en un rotor basculante durante 15 min a 4 ° C. Usar una configuración de freno desactivado.
    4. Después de la centrifugación, la transferencia de los medios de comunicación y las capas de interfase (tenga en cuenta que, en condiciones ideales de funcionamiento, los islotes se encuentran en la interfase entre los medios de comunicación y la cultura polisucrosa después de la centrifugación) en un nuevo tubo de 15 ml. Añadir 10 ml de medio, mezclar suavemente pero a fondo.
    5. Centrifugar la fracción enriquecida en los islotesa 300 xg durante 5 min. Retire el medio de lavado. Repetir el lavado una vez más con medio RPMI completo. Volver a suspender las pellas en 4 ml de los medios de comunicación, que contiene en su mayoría islotes y conductos (Figura 1D).
    6. Recoger a mano los islotes como se indica en la sección 5.1.

6. Los ensayos GSIS en islotes aislados

  1. Incubar los islotes de la etapa 5.1.4 en medio RPMI completo durante 2 h en un incubador de cultivo de tejidos 37 °.
  2. Utilizar una pipeta para eliminar RPMI con un microscopio de disección. Añadir 3 ml de solución KRB con 2,8 mM de glucosa a la placa 3. Agitar 10 veces para lavar los islotes. Retire soluciones KRB.
    1. Repetir el proceso de lavado una vez. Incubar los islotes con 3 ml de solución KRB a 37 ° C durante 1 h en una incubadora.
  3. Alícuota 1 ml de KRB a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Pre-calentar la población de KRB y la placa a 37 ° C en una incubadora.
  4. Lavar los islotes dos veces con KRB pre-calentado como en 6.2. Transfer 10 islotes a cada pocillo de las placas pre-calentado. Incubar en una incubadora a 37ºC.
  5. Después de 45 min, retirar 50 l de sobrenadante. Este contiene la solución de insulina secretada bajo de glucosa basal.
  6. Añadir 32 l de glucosa 500 mM. Agitar la placa 20 veces para mezclar la solución. Incubar en una incubadora a 37ºC. Agitar la placa 5 veces, una vez cada 5 minutos.
  7. Después de 45 min, retirar 50 l sobrenadante. Esta es la insulina secretada bajo alta glucosa.
  8. Transferir todos los islotes a un tubo de 1,5 ml. Congelar en -20 ° C durante 30 min. Descongelar a temperatura ambiente durante 5 min. Repetir el proceso de congelación y descongelación.
  9. Añadir 0,5 ml de 70% de etanol con HCl 20 mM. Dejar toda la noche. Esta es la insulina que queda en los islotes.
  10. Usar ELISA convencional para someter a ensayo los niveles de insulina, se ha descrito previamente 3.

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Resultados

En condiciones óptimas, el método presentado puede rendimiento del 20 - 80 islotes de cada pequeño páncreas de ratón. Este número depende de los antecedentes genéticos, la edad de los ratones, y el tamaño de los islotes que debe recuperarse. Entre los de uso común, CD1 fuera criado y / 6J de pura raza C57BL producen menos islotes con un tamaño más pequeño que los híbridos entre CD1 y C57BL / 6 o comercial B6CBAF1 / J ratones hacen. Mano directa recogiendo generalmente dio un menor número...

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Discusión

A continuación, ofrecemos un protocolo paso a paso en el aislamiento de los islotes del páncreas que son demasiado pequeños para la perfusión convencional. Se espera para producir islotes listos para todos los estudios basados en los islotes como la purificación de las células beta, análisis de expresión génica, la maduración de las células beta de los islotes, la proliferación, las respuestas de estrés celular, la supervivencia celular, el metabolismo y mantenimiento funcional GSIS, etc. Esta será, a lo mejor ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia por el trabajo descrito.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por una subvención del NIDDK (DK065949 para GG). Agradecemos a la Dra. Brenda M. Jarvis y Jeff Duryea Jr. por leer el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Colagenasa Tipo IVSigma Aldrich, St Louis, MOC5138
1x HBSS con Ca2+/Mg2+Mediatech/Cellgro, Manassas, VAMT21020CVSi se obtiene HBSS sin Ca2+/Mg2+, se puede añadir CaCl2 y MgSO4 a 1,26 y 0,5 mM, respectivamente.
RPMI 1640 sin glucosaThermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA11879-020La glucosa debe agregarse a niveles específicos para no interferir con el uso posterior de los islotes. 
GlucosaSigma Aldrich, San Luis, MOG-7021 
Solución de polisacarosa y diatrizato de sodioSigma Aldrich, St Louis, MOHistopaque-10771
EstereoscopioCarl-Zeiss, Oberkochen, AlemaniaEstereoscopio Stemi2000
Leica, Wetzlar, AlemaniaMicrocentrífuga Leica M165
Eppendorf, Hauppauge, NYCentrífuga 5417C
CentrífugaEppendorf, Hauppauge, NYCentrífuga 5810R
Tubos centrífugos de 15 mlVWR, Radnor, PA89039-666
Tubos centrífugos de 50 mlVWR, Radnor, PA89039-658
Balanza de precisiónVWR, Radnor, PAVWR-225AC
Tubos de microfugaVWR, Radnor, PA87003-294
Pipetman P1000Fisher Scientific,  Waltham, MAF123602
Pipetman P20Fisher Scientific,  Waltham, MAF123600
plato de 100 x 15 mmVWR, Radnor, PA25384-088
Plato de 60 x 15 mmVWR, Radnor, PA25384-168
Placas de 12 pocillosVWR, Radnor, PA665-180
TijeraFine Scientific Tools, Foster City, CA14080-11
PinzasFine Scientific Tools, Foster City, CA5708-5
Ratones CD1 CharlesRiver Laboratories, Wilminton, MA CD-1
C57BL/6JEl laboratorio Jackson, Farmington, CT C57BL/6J
B6CBAF1/JEl laboratorio Jackson, Farmington, CT B6CBAF1/J

Referencias

  1. Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
  2. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
  3. Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
  4. Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
  5. Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
  6. London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
  7. Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
  8. Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
  9. Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
  10. Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
  11. Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445(2015).
  12. White, J., White, D. C. Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , C.R.C. Press. (1997).
  13. Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
  14. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).

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