Method Article

La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple In Situ La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados

DOI:

10.3791/55162

⸱

January 11th, 2017

 ,  , 
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo describe la utilidad de la hibridación in situ de fluorescencia múltiple (mFISH) y el cariotipo espectral (SKY) en la identificación de aberraciones estables intercromosómicas en las células de la médula ósea de ratones después de la exposición a la irradiación corporal total.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La radiación ionizante (IR) induce numerosas aberraciones cromosómicas estables e inestables. Las aberraciones inestables, en las que la morfología de los cromosomas se ve sustancialmente comprometida, pueden identificarse fácilmente mediante técnicas convencionales de tinción cromosómica. Sin embargo, la detección de aberraciones estables, que implican el intercambio o la translocación de materiales genéticos sin una modificación considerable en la morfología cromosómica, requiere sofisticadas técnicas de pintura cromosómica que se basan en la hibridación in situ de sondas de ADN marcadas con fluorescencia, una técnica de pintura cromosómica conocida popularmente como fluorescencia in situ hibridación (FISH). Las sondas FISH pueden ser específicas para cromosomas completos o subregiones precisas de cromosomas. El método no solo permite la visualización de aberraciones estables, sino que también puede permitir la detección de los cromosomas o secuencias específicas de ADN involucradas en la formación de una aberración en particular. Hay una variedad de técnicas de pintura cromosómica disponibles en citogenética; aquí se discuten dos métodos altamente sensibles, la hibridación in situ de fluorescencia múltiple (mFISH) y el cariotipo espectral (SKY), para identificar las aberraciones estables intercromosómicas que se forman en las células de la médula ósea de ratones después de la exposición a la irradiación corporal total. Aunque ambas técnicas se basan en sondas de ADN marcadas con fluorescencia, el método de detección y el proceso de adquisición de imágenes de las señales fluorescentes son diferentes. Estas dos técnicas se han utilizado en diversas áreas de investigación, como la biología de la radiación, la citogenética del cáncer, la biodosimetría de radiación retrospectiva, la citogenética clínica, la citogenética evolutiva y la citogenética comparativa.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los dos métodos más fiables para identificar las aberraciones estables intercromosómicas inducidas por radiación son la hibridación in situ de fluorescencia múltiple (mFISH), que permite pintar dos o más cromosomas simultáneamente, y el cariotipo espectral (SKY), que imparte un color distinto a cada par de cromosomas homólogos en el genoma. A diferencia de las aberraciones inestables, las aberraciones estables son persistentes en la naturaleza y pueden propagarse durante varias generaciones en poblaciones irradiadas1, y se consideran "firmas" moleculares críticas de lesiones citogenéticas inducidas por radiación2. Los estudios realizados por varios grupos han demostrado que las aberraciones estables están asociadas con la patogénesis y el desarrollo de una serie de enfermedades, incluido el cáncer3. Antes de la era de la pintura cromosómica (también conocida como citogenética molecular), la técnica convencional de bandas G era el único método para detectar aberraciones cromosómicas estables. Sin embargo, el anillamiento cromosómico es un desafío para los citogenetistas porque la resolución es limitada, la reproducibilidad es incierta, es un procedimiento laborioso y requiere citogenetistas altamente capacitados y experimentados parauna interpretación confiable de los datos. Además, la técnica clásica de bandas no permite la detección de reordenamientos cromosómicos complejos, que implican la interacción de tres o más roturas distribuidas entre dos o más cromosomas, un resultado común del daño por radiación. Las aberraciones complejas pueden persistir en los individuos muchos años después de la exposición a la radiación, lo que las hace útiles para la biodosimetría retrospectiva5. Por lo tanto, se requería un enfoque alternativo para superar las limitaciones de las técnicas convencionales de bandas para detectar reordenamientos cromosómicos estables.

A finales de la década de 1960, el trabajo pionero de Gall y Pardue (1969) sobre la hibridación molecular utilizando sondas de ácido nucleico marcadas con material radiactivo inició una nueva era en el campo de la citogenética, que permitió la detección de una secuencia específica de ADN en los cromosomas6. Sin embargo, el uso de sondas radiactivas para la hibridación molecular tenía varios inconvenientes: las sondas radiactivas son relativamente inestables, la actividad de la sonda depende de la desintegración radiactiva del isótopo utilizado, la hibridación lleva más tiempo, la resolución es limitada, las sondas son relativamente costosas y los materiales radiactivos son peligrosos para la salud. Por lo tanto, se hizo necesario desarrollar y diseñar sondas no radiactivas. La introducción de sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia en las décadas de 1980 y 1990 superó las limitaciones de las sondas radiactivas y mejoró en gran medida la seguridad, la sensibilidad y la especificidad de la técnica de hibridación7-10. Las sondas fluorescentes dan lugar a señales extremadamente brillantes cuando se observan bajo microscopios de fluorescencia equipados con los filtros de excitación y emisión adecuados. Cualquier pérdida, ganancia o reordenamiento de los cromosomas marcados con fluorescencia o de una parte del cromosoma es fácilmente identificable con esta técnica FISH.

El análisis de las aberraciones cromosómicas mediante la pintura FISH ha llevado a un notable progreso en la investigación citogenética a lo largo de los años. El diseño de sondas marcadas con fluorescencia para aplicaciones específicas que van desde sondas específicas de locus hasta sondas de pintura de cromosomas completos ha avanzado significativamente en el campo; Esto también ha facilitado la detección de reordenamientos submicroscópicos ("crípticos"), que no eran posibles mediante el bandeo cromosómico convencional. La pintura cromosómica de mFISH y SKY ha demostrado ser una herramienta valiosa para la identificación de reordenamientos intercromosómicos simples y complejos. Los principios básicos de ambas técnicas son similares, pero el método de detección y discriminación de la señal fluorescente después de la hibridación in situ y el proceso de adquisición de imágenes son diferentes. En mFISH, se capturan imágenes separadas de cada uno de los cuatro fluorocromos mediante el uso de filtros de microscopio de paso de banda estrecha; A continuación, se utiliza un software dedicado para combinar las imágenes. Mientras que en SKY, la adquisición de imágenes se basa en una combinación de microscopía de epifluorescencia, imágenes de dispositivos de carga acoplada y espectroscopía de Fourier, que permite la medición de todo el espectro de emisión con una sola exposición en todos los puntos de la imagen. Tanto en mFISH como en SKY, las imágenes monocromáticas se capturan de forma independiente, luego se fusionan y, finalmente, se asignan pseudocolores únicos a los cromosomas en imágenes monocromáticas en función del tinte específico adjunto a cada sonda de fluorocromo.

La contribución del análisis mFISH y SKY en el campo de la biología de la radiación es notable, particularmente para la estimación retrospectiva de la dosis de exposición humana a IR (biodosimetría de radiación)11-14, la evaluación del riesgo de carcinogénesis por radiación15, así como la detección y estimación del riesgo de cáncer secundario relacionado con la radioterapia16. Un estudio reciente en ratones ha demostrado que una técnica de pintura cromosómica basada en FISH es también una herramienta importante para evaluar la eficacia de la contramedida de radiación17. En el presente estudio, se ha demostrado el efecto de la exposición total a la radiación corporal en la inducción de aberraciones cromosómicas estables en las células de la médula ósea de ratones utilizando técnicas mFISH y SKY.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas. Todos los animales fueron alojados bajo animalario climatizado estándar a 20 ± 2 ° C con 10 - 15 ciclos por hora de aire fresco y libre acceso al alimento estándar para roedores y agua. A su llegada, los ratones se mantuvieron en cuarentena durante 1 semana y siempre con comida para roedores certificado.

La exposición 1.Radiation e in vivo detención de las células en metafase

  1. exponer los ratones anestesiados un-a 2 Gy de radiación en todo el cuerpo en una cámara de irradiación. Durante la irradiación, los ratones lugar en una cámara de retención con buena ventilación para asegurarse de que no se mueven libremente y recibir una dosis uniforme.
  2. Se inyectan 100 l de solución de colchicina 0,05% (cpolvo olchicine disuelto en calcio y magnesio libre de PBS) por vía intraperitoneal usando una aguja de 25 G adjunto con jeringa de 1 ml desechable. Evitar la inyección directamente en cualquier órgano.
  3. Dejar al animal en la jaula durante 2 h antes de la cosecha de células de médula ósea. Observar el animal para detectar cualquier signo de dolor o angustia.

2. Médula Ósea de la célula de la cosecha y Aislamiento de células mononucleares de médula ósea por centrifugación en gradiente de densidad

  1. La eutanasia a los ratones por asfixia con CO2.
  2. Pulverizar 70% de etanol en el dorsal y el lado ventral.
  3. Hacer una incisión de 2 cm en la piel abdominal con unas tijeras afiladas. Agarre la piel en cada lado de la incisión con pinzas romas y tire suavemente abrir los músculos abdominales.
  4. Cortar dos de las patas traseras con las tijeras y de inmediato colocarlos en PBS enfriado previamente con 4% de FBS.
  5. Limpiar cuidadosamente todos los músculos que se unen a la extremidad posterior con una hoja de afeitar y gasa de algodón vendaje agudo.
  6. Se separa la tibia del fémur. Recorte ambas puntas de cada hueso con una hoja de afeitar.
  7. Enjuague el contenido de la médula ósea con 3 ml de PBS (con 4% de FBS) utilizando una aguja de 23 G unida a una jeringa de 3 ml y recoger el contenido en un tubo de centrífuga de 15 mL. Pasar la suspensión de células al menos 10 veces a través de la aguja para hacer una suspensión de células individuales.
  8. superponer cuidadosamente la suspensión de células en un volumen igual de medio de separación de linfocitos (3 ml) sin perturbar la interfaz entre la suspensión de células y medio de separación de linfocitos. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a temperatura ambiente.
  9. Recoger cuidadosamente la capa leucocitaria sin molestar a las otras capas y la transferencia en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml.

3. Preparación de las propagaciones de metafases celulares

  1. Añadir 10 ml de PBS al tubo que contiene la capa leucocitaria.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
  3. Retirar con cuidado el sobrenadante. Luego romper tél célula de pellets, sacudiendo ligeramente y añadir 10 ml de PBS.
  4. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular, romper la pastilla, y añadir 4 ml de solución de cloruro de potasio 0,075 M hipotónica pre-calentado. Añadir gota a gota solución hipotónica con agitación constante suave.
  6. Se incuban las células durante 20 min a 37 ° C en una baño de agua.
  7. Después del tratamiento hipotónico añadir un volumen equivalente (4 ml) de fijador (metanol: ácido acético glacial, 3: 1 v / v) en el tubo de 15 ml y se mezcla suavemente invirtiendo el tubo.
  8. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.
  9. Romper el sedimento celular de la función tocar seguido de vórtice suave durante unos segundos y añadir 3 ml de solución de fijación gota a gota con agitación constante.
  10. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente y centrifugar a 400 xg durante 5 min.
  11. Eliminar el sobrenadante, romper el sedimento celular con gentLe tapping, y añadir 3 ml de fijador.
  12. Centrifugar a 400 g durante 5 min a temperatura ambiente, y se elimina el sobrenadante. Romper el sedimento celular con golpecitos suaves, frescos y añadir 3 ml de fijador.
  13. Repita el paso 3.12 dos veces más.
  14. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente, y eliminar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. A continuación, añadir 400 a 600 l fijador y mezclar bien con la pipeta.
  15. Caída de 30 l células fijadas sobre portaobjetos previamente limpiados y húmedas inclinadas en un ángulo de 45 ° y permitir que los portaobjetos se sequen al aire por completo durante la noche.

4. ratón cromosoma pintura de mFISH

  1. La desnaturalización de cromosomas
    1. Colocar la placa que contiene los diferenciales de células en metafase en 2x SSC durante 2 minutos a temperatura ambiente.
    2. Deshidratar la corredera por lavado de etanol de serie de 2 min cada uno en 70%, 80% y 100%. Incubar durante 60 minutos a 65 ° C.
    3. solución de desnaturalización 40 ml de precalentamiento (70% formamida / 2x SSDO; pH 7,0) a 70 ° C (± 2 ° C) en un tarro Coplin vidrio para 30 min. Desnaturalizar cromosomas incubando el portaobjetos en solución de desnaturalización pre-calentado por 1 - 1,5 min.
    4. Se detiene inmediatamente deslice en helado de etanol al 70% durante 2 min para detener el proceso de desnaturalización, así como para evitar que los cromosomas desnaturalizados de re-recocido. Entonces deshidratar por lavado con 80% de etanol durante 2 min. Repetir el lavado con etanol con etanol al 100% durante 2 min. Completamente seco el portaobjetos a temperatura ambiente.
  2. Desnaturalización e hibridación de la sonda de mezcla
    1. Centrifugar brevemente la mezcla de sonda suministrado por el fabricante, la transferencia de 10 l de mezcla de sonda en un 500 l complemento tubo de centrífuga de casquillo, y desnaturalizar por incubación a 80 ° C (± 2 ° C) en un baño de agua durante 7 minutos.
    2. Coloque el tubo de centrífuga con la mezcla de sonda en un baño de agua a 37 ° C durante 10 minutos.
    3. Aplicar la mezcla de sonda desnaturalizada en el portaobjetos con chromoso desnaturalizadaMES.
    4. cubrir cuidadosamente el área con una x 18 mm cubreobjetos de vidrio de 18 mm y eliminar las burbujas de aire visibles presionando suavemente la hoja de la cubierta se deslice. Sellar los cuatro lados de la hoja de la cubierta con cemento de goma y se incuba durante 12 h a 16 h en la oscuridad a 37 ° C en una cámara húmeda para la hibridación.
  3. Lavado post hibridación y detección
    1. Retirar con cuidado el cemento de caucho y la hoja de la cubierta.
    2. Colocar el portaobjetos en SSC 0,4x previamente calentada a 74 ° C (± 2 ° C) durante 5 min.
    3. diapositiva de lavado en solución de lavado II (4x SSC / 0,1% de Tween-20) durante 2 min.
    4. Colocar 20 l de anti-fade medio de montaje con DAPI de contraste (1,5 mg / ml) y cubrir con un cubreobjetos de vidrio. Presione suavemente el cubreobjetos con el tejido de laboratorio para eliminar las burbujas de aire y solución de montaje exceso. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas.
    5. Ver diapositivas utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros adecuados.

5. El cariotipo espectral (SKY) de cromosomas de ratón

  1. La desnaturalización de la sonda y el cromosoma
    1. Equilibrar diapositiva en 2x SSC a temperatura ambiente durante 2 minutos, sin agitar.
    2. Deshidratar diapositivas en una serie de etanol (70%, 80% y 100% de etanol) durante 2 min cada uno a temperatura ambiente. El aire seco de la corredera para eliminar el etanol por completo.
    3. solución caliente 40 ml de desnaturalización (70% de formamida / SSC 2x; pH 7,0) en un tarro Coplin vidrio para 30 min.
    4. Incubar portaobjetos en solución de desnaturalización pre-calentado por 1 a 1,5 min.
    5. Inmediatamente sumerja la diapositiva en helado de etanol 70% durante 2 min para detener el proceso de desnaturalización, así como para evitar que los cromosomas desnaturalizados de re-recocido.
    6. Deshidratar la diapositiva colocándolo en 80% de etanol durante 2 min y luego en 100% de etanol durante 2 min a temperatura ambiente.
    7. Desnaturalizar la sonda SKY (vial # 1, suministrado por el fabricante) en un baño de agua a 80 ° C (± 2 ºC)durante 7 minutos y, a continuación, colocar inmediatamente en un baño de agua diferentes establecido en 37 ° C durante 10 minutos.
  2. sonda de hibridación
    1. Añadir 10 l de sonda desnaturalizada SKY en los cromosomas desnaturalizados.
    2. Con cuidado, coloque un joven de 18 mm x 18 mm cubreobjetos de vidrio en la sonda cielo para que no queden burbujas de aire atrapadas bajo el cubreobjetos.
    3. Sellar los bordes del cubreobjetos con cemento de goma.
    4. Colocar el portaobjetos en una cámara a prueba de luz húmeda y se incuba en la oscuridad a 37 ° C durante 24 h a 36 h.
  3. Post-hibridación de lavado y detección por fluorescencia
    1. Retire el cemento de goma con mucho cuidado sin perturbar el cubreobjetos.
    2. Colocar el portaobjetos en la solución de lavado rápido precalentado (SSC 0,4x) a 72 ° C (± 2 ° C) durante 5 minutos con agitación constante. Sumergir diapositiva en solución de lavado III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) y se incuba durante 1 min con agitación.
    3. Opcional: Añadir 80 l de reactivo de bloqueo(Vial # 2 suministrada por el fabricante) a la zona de la hibridación, coloque una 24 mm x 60 mm cubreobjetos de plástico, y se incuba en la oscuridad a 37 ° C durante 30 min en una cámara humidificada.
    4. Retire con cuidado el cubreobjetos de plástico y lavar el portaobjetos con (45 ºC) solución de lavado precalentado durante 5 minutos III.
    5. Aplique 80 l de reactivo de tinción Cy5 (vial nº 3 suministrado por el fabricante), coloque una de 24 mm x 60 mm cubreobjetos de plástico, y se incuba a 37 ° C en la oscuridad durante 40 minutos en una cámara húmeda.
    6. Sumergir el portaobjetos en una jarra Coplin de vidrio que contiene precalentado (45 ° C) solución de lavado III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) y se incuba a 45 ° C en un baño de agua durante 2 minutos con agitación. Repita este paso de lavado 3 veces.
    7. Aplique 80 l de reactivo de tinción Cy5.5 (vial # 4 suministrado por el fabricante), coloque una de 24 mm x 60 mm cubreobjetos de plástico, y se incuba a 37 ° C en la oscuridad durante 40 minutos en una cámara húmeda.
    8. Lavar el portaobjetos 3 veces con pre-calentado (45 ºC) solución de lavado III.
    9. Mantenga la corredera en una posición inclinada contra una toalla de papel para drenar el exceso de líquido. Añadir 20 l de reactivo anti-fade DAPI (vial # 5 suministrado por el fabricante) y coloque un 24 mm x 60 mm cubreobjetos de vidrio sin introducir burbujas de aire. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y observar con un microscopio de epifluorescencia equipado para la captura de imágenes del cielo.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

la irradiación de todo el cuerpo causa una serie de aberraciones cromosómicas en las células de médula ósea de ratones irradiados. El protocolo actual está optimizado para detención de la mitosis in vivo de células de médula ósea después de exposición a la radiación, de la cosecha de células de médula ósea de las patas traseras de los ratones irradiados, el aislamiento de células mononucleares de médula ósea por centrifugación en gradiente de densidad, la preparación de los dife...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Varios pasos críticos determinan el éxito de mFISH y SKY. El primero y más importante paso es optimizar el tratamiento con colchicina para la detención mitótica en vivo de las células mononucleares de médula ósea. El tiempo de concentración de la colchicina y el tratamiento de forma individual o en conjunto determinan el índice mitótico, así como el cromosoma condensación de dos requisitos importantes para la pintura cromosoma eficaz. Un tiempo de tratamiento alta concentración de colchicina o más largo conduce...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por Arkansas Consorcio de Becas Espaciales y el Instituto Nacional de Investigación Biomédica Espacial a través de Aeronáutica y del Espacio Nacional, otorga NNX15AK32A (RP) y RE03701 (MH-J), y P20 GM109005 (MH-J), y la Administración de Veteranos de los Estados Unidos ( MH-J). Agradecemos a Christopher Fettes, Coordinador del Programa para el Departamento de Medio Ambiente y Salud Ocupacional de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas, por su asistencia editorial en la preparación del manuscrito.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FormamidaSigma-Aldrich221198-100ML
SSC Tampón 20× Reactivo deconcentrado Sigma-AldrichS6639-1L
SKY paraimágenes espectrales aplicadasFPRPR0030/M40
CAD - Kit de detección de anticuerpos concentradosImágenes espectrales aplicadasFPRPR0033
individuales personalizadas - 3 colores; Cromosoma 1 de ratón: Rojo, Cromosoma 2 de ratón: Verde, Cromosoma 3 de ratón: AquaApplied Spectral ImagingFPRPR0182/10
Cubreobjetos de vidrioFisher Scientific12-545B
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
Ácido clorhídrico, 37%, Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025 
Platos de tinción de vidrio Fisherbrand  con tapón de roscaFisher Scientific08-816
KaryoMAX Solución de cloruro de potasio Life Technologies10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopioFisher Scientific12-550-15
Colcemid en polvoFisher Scientific50-464-757 
Histopaco-1083 Sigma-Aldrich10831
Shepherd Mark I, modelo 25 137Cs irradiador J. L. Shepherd & AsociadosJeringa Modelo 484B
1 mLBD Biosciences647911
Alcohol Etílico, 200 GradosFisher ScientificMEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), sin Calcio y MagnesioFisher ScientificICN1860454
Suero Fetal BovinoFisher Scientific10-437-010
MetanolFisher ScientificA454SK-4
Ácido acético glacial
ZeissZeissAXIO Imager.Z2
laboratorio en ratones pinturas Microscopio Zeiss Zeiss de AC295320010 Fisher Scientific

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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