La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple In Situ La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados

Summary

El presente protocolo describe la utilidad de la hibridación in situ de fluorescencia múltiple (mFISH) y el cariotipo espectral (SKY) en la identificación de aberraciones estables intercromosómicas en las células de la médula ósea de ratones después de la exposición a la irradiación corporal total.

Abstract

La radiación ionizante (IR) induce numerosas aberraciones cromosómicas estables e inestables. Las aberraciones inestables, en las que la morfología de los cromosomas se ve sustancialmente comprometida, pueden identificarse fácilmente mediante técnicas convencionales de tinción cromosómica. Sin embargo, la detección de aberraciones estables, que implican el intercambio o la translocación de materiales genéticos sin una modificación considerable en la morfología cromosómica, requiere sofisticadas técnicas de pintura cromosómica que se basan en la hibridación in situ de sondas de ADN marcadas con fluorescencia, una técnica de pintura cromosómica conocida popularmente como fluorescencia in situ hibridación (FISH). Las sondas FISH pueden ser específicas para cromosomas completos o subregiones precisas de cromosomas. El método no solo permite la visualización de aberraciones estables, sino que también puede permitir la detección de los cromosomas o secuencias específicas de ADN involucradas en la formación de una aberración en particular. Hay una variedad de técnicas de pintura cromosómica disponibles en citogenética; aquí se discuten dos métodos altamente sensibles, la hibridación in situ de fluorescencia múltiple (mFISH) y el cariotipo espectral (SKY), para identificar las aberraciones estables intercromosómicas que se forman en las células de la médula ósea de ratones después de la exposición a la irradiación corporal total. Aunque ambas técnicas se basan en sondas de ADN marcadas con fluorescencia, el método de detección y el proceso de adquisición de imágenes de las señales fluorescentes son diferentes. Estas dos técnicas se han utilizado en diversas áreas de investigación, como la biología de la radiación, la citogenética del cáncer, la biodosimetría de radiación retrospectiva, la citogenética clínica, la citogenética evolutiva y la citogenética comparativa.

Introduction

Los dos métodos más fiables para identificar las aberraciones estables intercromosómicas inducidas por radiación son la hibridación in situ de fluorescencia múltiple (mFISH), que permite pintar dos o más cromosomas simultáneamente, y el cariotipo espectral (SKY), que imparte un color distinto a cada par de cromosomas homólogos en el genoma. A diferencia de las aberraciones inestables, las aberraciones estables son persistentes en la naturaleza y pueden propagarse durante varias generaciones en poblaciones irradiadas¹, y se consideran "firmas" moleculares críticas de lesiones citogenéticas inducidas por radiación². Los estudios realizados....

Protocol

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas. Todos los animales fueron alojados bajo animalario climatizado estándar a 20 ± 2 ° C con 10 - 15 ciclos por hora de aire fresco y libre acceso al alimento estándar para roedores y agua. A su llegada, los ratones se mantuvieron en cuarentena durante 1 semana y siempre con comida para roedores certificado.

Results

la irradiación de todo el cuerpo causa una serie de aberraciones cromosómicas en las células de médula ósea de ratones irradiados. El protocolo actual está optimizado para detención de la mitosis in vivo de células de médula ósea después de exposición a la radiación, de la cosecha de células de médula ósea de las patas traseras de los ratones irradiados, el aislamiento de células mononucleares de médula ósea por centrifugación en gradiente de densidad, la preparación de los dife.......

Discussion

Varios pasos críticos determinan el éxito de mFISH y SKY. El primero y más importante paso es optimizar el tratamiento con colchicina para la detención mitótica en vivo de las células mononucleares de médula ósea. El tiempo de concentración de la colchicina y el tratamiento de forma individual o en conjunto determinan el índice mitótico, así como el cromosoma condensación de dos requisitos importantes para la pintura cromosoma eficaz. Un tiempo de tratamiento alta concentración de colchicina o más largo conduce.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formamida	Sigma-Aldrich	221198-100ML
SSC Tampón 20× Reactivo de	concentrado Sigma-Aldrich	S6639-1L
SKY para	imágenes espectrales aplicadas	FPRPR0030/M40
CAD - Kit de detección de anticuerpos concentrados	Imágenes espectrales aplicadas	FPRPR0033
individuales personalizadas - 3 colores; Cromosoma 1 de ratón: Rojo, Cromosoma 2 de ratón: Verde, Cromosoma 3 de ratón: Aqua	Applied Spectral Imaging	FPRPR0182/10
Cubreobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-545B
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Ácido clorhídrico, 37%, Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025
Platos de tinción de vidrio Fisherbrand  con tapón de rosca	Fisher Scientific	08-816
KaryoMAX Solución de cloruro de potasio	Life Technologies	10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-550-15
Colcemid en polvo	Fisher Scientific	50-464-757
Histopaco-1083	Sigma-Aldrich	10831
Shepherd Mark I, modelo 25 137Cs irradiador J	. L. Shepherd & Asociados	Jeringa Modelo 484B
1 mL	BD Biosciences	647911
Alcohol Etílico, 200 Grados	Fisher Scientific	MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), sin Calcio y Magnesio	Fisher Scientific	ICN1860454
Suero Fetal Bovino	Fisher Scientific	10-437-010
Metanol	Fisher Scientific	A454SK-4
Ácido acético glacial
Zeiss	Zeiss	AXIO Imager.Z2