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Artículo de método

El examen de los fenotipos de acogida en

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DOI:

10.3791/55170

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22 de febrero de 2017

 ,  ,  , 
1Biological Sciences, Sam Houston State University, 2Irma Lerma Rangel College of Pharmacy, Texas A&M University Health Science Center

En este artículo

Resumen

Este estudio implica métodos para revelar efectos en un modelo de acogida pescado siguientes alteración de la piel y el intestino comunidades microbioma composición por un antibiótico.

Resumen

La similitud del uso de antibióticos en medicina significa que es vital comprender las consecuencias resultantes para el huésped. Los antibióticos a menudo disminuyen la diversidad de la comunidad del microbioma huésped y alteran la composición de la comunidad microbiana. Muchas enfermedades, como la enterocolitis asociada a los antibióticos, la enfermedad inflamatoria intestinal y los trastornos metabólicos, se han relacionado con una microbiota alterada. La compleja interacción entre el huésped, el microbioma y los antibióticos necesita un modelo manejable para estudiar las interacciones entre el huésped y el microbioma. Nuestro pez vertebrado de agua dulce sirve como modelo útil para investigar los aspectos universales de la estructura y función del microbioma de la mucosa, así como para analizar los efectos consecuentes del huésped por la alteración de la comunidad microbiana. Los métodos incluyen desafíos del huésped, como la infección por un patógeno conocido de los peces, la exposición a microbios fecales o del suelo, el estrés osmótico, la toxicidad de los nitratos, el análisis del crecimiento y la medición de la motilidad intestinal. Estas técnicas demuestran un sistema modelo flexible y útil para la determinación rápida de los fenotipos del huésped.

Introducción

Se ha establecido que los antibióticos pueden alterar el microbioma humano que lleva a la disbiosis, lo que significa un desequilibrio comunidad microbiana. Alteración de la composición de la microbiota después de tratamientos con antibióticos se ha demostrado que disminuye la diversidad de la comunidad, reducir los miembros clave, y alterar el metabolismo de la comunidad, especialmente en el intestino 1, 2. Perturbación antibiótico de la microbioma intestinal puede reducir la resistencia a la colonización de Clostridium difficile 3, 4 y 5 de Salmonella.

Además, la interrupción de la microbiota se ha relacionado con el desarrollo de muchos síndromes y enfermedades en los seres humanos (por ejemplo, asociada a antibióticos enterocolitis, enfermedad inflamatoria del intestino, trastornos metabólicos, etc.). Los antibióticos también se aplican ampliamente en la agricultura como promotores del crecimiento enganado y aves de producción 6. El uso de estas herramientas de gran alcance no está exenta de efectos colaterales, lo cual es evidente en el rápido aumento de la resistencia a los antibióticos, así como los efectos de un microbioma perturbado tiene con su huésped habitado. Muchos estudios han demostrado que el amplio espectro uso de antibióticos tiene consecuencias de largo duraderas a la estructura y función de la microbiota, sin embargo, los efectos secundarios de un microbioma afectar la fisiología de acogida a los antibióticos alterado son sólo especulaciones que aún tienen que ser apoyados.

La interacción entre el huésped, la microbiota y antibióticos está lejos de ser entendido de una manera concisa. Por lo tanto, un modelo sencillo y más manejable es ventajoso para arrojar luz sobre el sistema de mamíferos de gran complejidad. las superficies mucosas de los seres humanos, incluyendo el intestino, albergan la mayor densidad y diversidad de microbios, y también los más íntimos interacciones microbio-huésped. El microbioma de la piel de la mucosa de las ofertas de pescado several ventajas como un sistema modelo. El teleósteos (peces óseos) es uno de los más antiguos linajes a divergir, en el sentido de que los teleósteos vertebrados tienen tanto innata y adquirida sistemas inmunológicos que han co-evolucionado una relación con las comunidades bacterianas comensales 7. Acciones piel de pescado muchas características con las superficies de tipo 1 de la mucosa de mamíferos, tales como las funciones fisiológicas, componentes de inmunidad, y la disposición de las células productoras de moco 8. La ubicación externa de la superficie de la mucosa de la piel de pescado ofrece un microbioma fácil de manipular experimentalmente y se muestra.

El mosquito, Gambusia affinis (G. affinis), es un pez de modelo que se ha utilizado en el pasado para el estudio de acoplamiento y toxicología 9, 10, 11. Dado el pequeño tamaño, abundancia de la población en la naturaleza como una especie invasora, m los costos de atención inimal, y la naturaleza robusta, hemos desarrollado G. affinis como modelo microbioma de la mucosa. Además, Gambusia comparten la fisiología de dar a luz a crías vivas con los mamíferos vivíparos, que es poco común en las especies de peces. Hemos completado el estudio más amplio en el momento de piel de pescado microbiota normal usando 16S perfiladora de Gambusia 12. Posteriores demostraron tres efectos negativos sobre el anfitrión siguientes alteración de la piel y el intestino microbiota usando un antibiótico de amplio espectro 13.

Cinco efectos diferentes se examinaron en los peces después de la exposición a los antibióticos. El beneficio anfitrión más bien establecida del microbioma es la exclusión competitiva de patógenos. El patógeno de peces Edwardsiella ictaluri es conocido por causar brotes de septicemia entérica en granjas comerciales de bagre 14. E. ictaluri también se ha demostrado para infectar letalmente pez cebraclass = "xref"> 15, 16 y 17 Gambusia. Un desafío con este patógeno de la columna de agua puede servir como una medida de la exclusión. Como comparación a la susceptibilidad a un patógeno individual, la supervivencia durante la exposición a una alta densidad de organismos mixtos también se llevó a cabo. Las heces y el suelo rico en materia orgánica se utilizaron como fuentes encontradas comúnmente de las comunidades microbianas.

Otra función establecida la comunidad bacteriana intestinal es realiza el procesamiento de nutrientes y la energía de la cosecha, lo que afecta a la absorción nutricional general para el anfitrión. Como una medición bruta de la nutrición, el peso corporal de pescado se comparó antes y después de un mes de ser alimentados con una dieta estándar. pescado tratado con antibióticos como un promedio perdieron peso mientras que los peces de control en promedio aumentó de peso durante el mes. El mecanismo de esta falta de aumento de peso no está claro. Un posible factor que contribuye es el tiempo de tránsito de los alimentos en el intestino. Un moti GIdad método fue adaptado de pez cebra (Adam Rich, SUNY Brockport, comunicación personal) para determinar el tiempo de tránsito. Aún no se ha determinado si los peces tratados con antibióticos tienen un tiempo de tránsito alterada.

Un desafío común experimentado en el medio natural por todos los organismos, especialmente el pescado, es el estrés osmótico. Gambusia se ha demostrado que adaptarse rápidamente cuando está estresado de forma aguda en altas concentraciones de salinidad 18. Sorprendentemente, los peces con un microbioma antibióticos alterado exhibido redujo la supervivencia a una tensión elevada de sal. El mecanismo para este nuevo fenotipo está bajo investigación. Otra estrés común en animales acuáticos, especialmente en acuarios, es formas tóxicas de nitrógeno (amoníaco, nitrato, nitrito y). Survival contra nitrato no fue significativamente diferente entre los peces tratados con antibióticos y control. Los métodos presentados en este manuscrito se pueden utilizar con Gambusia o modelo de pescado similares organismos, tales como cebrapescado y medaka, para medir fenotipos en los peces después de la manipulación experimental.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo bajo la aprobación de protocolos IACUC, contados 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01, y 14-04-17-1018-3-01.

1. Recogida de Animales, manejo y cuidado ético

  1. Recoger Gambusiaaffinis desde el sitio de campo (guía de identificación en http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) utilizando una pequeña red de inmersión y el lugar en 19 cubos L. Utilice la inspección visual para identificar las especies.
  2. peces descanso para 1 - 2 d en un cubo con agua del estanque. A continuación, transferir el pescado en 76 o 189 tanques L acuarios llenos de agua el agua del grifo mitad estanque / medio a 25 ° C, aireadas con una piedra de aire burbujeante. Use una pequeña red de inmersión durante la manipulación de pescado que no se perturbe mínimamente su microbioma de la piel.
    NOTA: la densidad de peces no debe ser superior a 20 peces / 38 litros de agua del acuario. Los peces se aclimataron al acuario durante al menos 5 d antes de la experimentación.
  3. Alimentar a los peces en un régimen diario con 5 mg de alimento de la escama por pez. Hold peces con un / 12 h oscuridad ciclo de 12 h de luz.

2. La exposición inicial con antibióticos para todos los experimentos

  1. Dibujo Todos los peces de cada experimento desde el mismo acuario, colocar en dos grupos separados (tratado: expuestos a los antibióticos y el control: no expuesta) en 19 cubos L. Los datos previos recogidos muestran que los peces en el mismo acuario han homogeneizado microbioma de la piel que tienen poca variación en la composición de la comunidad. 12
  2. Durante los experimentos, mantener a los peces en 2 l de agua del estanque artificial (APW; 0,33 g / l de CaCl2, 0,33 g / l MgSO4, 0,19 g / l de NaHCO3) que se esteriliza en autoclave antes de su uso.
  3. Preparar la solución de antibiótico rifampicina mediante la adición de 50 mg / ml en sulfóxido de dimetilo (DMSO). La rifampicina es un antibiótico de representante de amplio espectro que es no tóxico para los peces. En los seres humanos y los ratones, se distribuye bien en los tejidos.
  4. De la población de rifampicina administrar una finalconcentración de 25 mg / ml en 2 L de APW para exposición a los antibióticos del grupo de peces tratados durante 3 días. Tenga en cuenta que después de 3 d, la piel cultivables número de bacterias vuelven similar a la de piel de pescado tratado previamente.
  5. En paralelo, mantener un grupo de peces no tratadas en APW y dar una cantidad equivalente de DMSO (0,5 ml por L de APW) en la columna de agua para actuar como un grupo de control.
  6. Como experimentos están destinados a medir los efectos de un microbioma antibióticos alterado en fenotipos de pescado, con el fin de evitar los efectos directamente desde el propio antibiótico, tras la exposición de tres días de antibióticos (o control) período, pescado transferencia en un cubo con 2 L de APW fresco.
    1. Use un período de descanso de 10 horas por lo que el antibiótico se elimina por los cuerpos de los peces. Base este tiempo de eliminación en experimentos donde los peces fueron expuestos a 25 mg / ml de antibiótico durante tres días. La eutanasia a los peces cortando con tijeras la médula espinal seguido de descabello, a continuación, homogeneizar todo el cuerpo utilizando un triturador de tejidos.
    2. Determinar la presencia de antibióticos mediante la colocación de 50 l de esta suspensión después de 0,2 micras de filtrado en el centro de una placa de Petri agar. Hacer un agujero para esta suspensión pulsando un revés de la punta de la pipeta 200 l estéril en el agar, que absorbe un pequeño tapón.
    3. Usar placas de agar con 20 ml volumen medido de agar nutriente, y se extendió uniformemente usando un hisopo de algodón con un organismo indicador, Bacillus subtilis, que es sensible a la rifampicina. Obtener el B. subtilis de un agar nutritivo se incubaron a 25 ° CO / N y con un hisopo de algodón para obtener una colonia. La observación de una zona de inhibición después de la incubación durante la noche a 25 ° C indica la presencia de antibióticos en los tejidos de los peces.

3. Extracción de Microbiome

  1. Extraer una muestra microbioma piel de la epidermis de las mucosas exteriores mediante la colocación de los peces en un tubo estéril cónico de 15 ml llena con 2 ml de PBST estéril (Na 137 mMCl, fosfato 10 mM, 0,1% de Tween-20, pH 7,4) y solución de agitación en vórtex a un ajuste de 10 durante 1 min con 10 s incrementos de pausa. El detergente y la sal en el tampón promueve incluso la dispersión de bacterias en solución. Resultados comparables se encontraron con solución salina al 0,85% pero bajan los recuentos bacterianos con agua pura.
  2. Transferir el pescado del tubo cónico a un cubo de recuperación. La letalidad de la extracción de la piel suele ser inferior al 10%. O bien, analizar la suspensión bacteriana en el tubo inmediatamente después de la extracción o sedimentar las bacterias de un centrifugado de 2 minutos en una centrífuga a temperatura ambiente a 15.000 xg y se almacena a -80 ° C para su posterior análisis.
    NOTA: Toda la cultura y los análisis bioquímicos son inmediatos; ADN o la extracción de proteínas pueden ser de las muestras congeladas.
  3. Para obtener una muestra microbioma intestinal, en primer lugar el pescado en una placa de Petri estéril. La eutanasia a los peces mediante corte de la médula espinal cervical directamente detrás de la cabeza con unas tijeras quirúrgicas, seguido de descabelloY, a continuación desinfectar externamente el cuerpo con 70% de etanol toallitas.
  4. Después de la disección, eliminar todo el intestino por el corte después de la esófago y antes del ano.
  5. Cortar el intestino en pequeñas secciones de 1 - 2 mm de longitud y colocar todas las secciones en dos ml de solución de PBST en un tubo cónico. Después de agitación durante 1 min, eliminar el sobrenadante a otro tubo limpio (tomar la precaución de no elaborar las secciones intestinales).
    NOTA: El sobrenadante contiene las bacterias intestinales extraídos que, o bien se pueden utilizar para los análisis directos o sedimentaron por el método anterior mencionado para muestras de piel.

4. Modelo de infección Preparación y Baño de un patógeno específico

  1. Obtener una cepa infecciosa de Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) y mantener la cultura se almacena a -80 ° C. La cepa 93 - 146 utilizada en este estudio, aislado de un pez gato infectado, se obtuvo de Mark Lawrence, Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Mississippi.
  2. Streak E. ictaluri social en un selectivos y diferenciales medios llamados medios de E. ictaluri (EIM) de agar de 19 a cultivar las bacterias e incubar durante 2 días a 27 ° C.
  3. Transferir una colonia aislada pura a partir del cultivo e inocular un matraz de 150 ml que contenía 40 ml de caldo nutriente (NB; 5 g / L de peptona, 4 g / L de extracto de carne). Colocar el frasco en un agitador ajustado a 150 rpm durante 2 días a 27 ° C.
  4. Después de la incubación, se diluye una muestra de la cultura en PBST a una lectura espectrómetro de 0,2 OD a 650 nm para calibrar cultivo de E. ictaluri para volúmenes de dosis infecciosas deseados.
  5. Siguiente transferencia tanto tratados (después de 3 días de exposición a antibióticos) y grupos de peces no tratados en las tazas de plástico individuales que contienen 130 ml de agua fresca estanque artificial, o APW comprende alrededor de 10 h para la eliminación del fármaco a partir de tejidos de peces.
  6. Luego de ambos grupos, transferir de nuevo cada pez a botes de plástico de 8 onzas que contienen 130 ml de APW limpia.
  7. Dé a cada pescado que contiene una dosis letal de 2,8 x 10 6 UFC / ml de cultivo de E. ictaluri en el APW (baño modelo de infección) y guardar en un 27 ° C incubadora durante 24 h.
  8. Después del baño ictaluri E., la transferencia de peces de forma individual en nuevos vasos con 130 ml de APW.
  9. Después de la sustitución del agua, ficha mortalidad de los peces durante la duración de una semana. Los peces no se alimentan durante este período. En contraste con el pez gato, Gambusia no muestran signos externos de infección, por lo tanto, es esencial usar la letalidad como criterio de valoración experimental.

5. polimicrobiana Challenge con las heces y del suelo

  1. Tratamiento de las heces
    1. Obtener heces humanas frescas de un sujeto voluntario sano que no ha recibido antibióticos en las dos semanas anteriores, el uso de guantes estériles y un tubo cónico estéril de 50 ml.
    2. Tras la recogida, recoger la materia fecal en una bolsa de plástico estéril y luego transferir a una estéril de 15 ml conical tubo. Crear una concentración de stock de la suspensión de heces con PBST hasta alcanzar una solución madre de 500 - 800 mg / ml. Esta mezcla espesa es la mejor manera de transferir un archivo con un 1 ml o punta de pipeta de plástico más grande que se ha cortado en la parte inferior con unas tijeras estériles para que la abertura es mayor.
    3. Después de la exposición a antibióticos inicial de grupos de peces no tratados tratados y de control, separar en vasos de plástico individuales que contienen la suspensión fecal a concentraciones finales de o bien 15 mg / ml o 10 mg / mL en APW con un volumen total de 130 mL. Almacenar vasos en una incubadora a 25 ° C.
    4. Registro de mortalidad de los peces durante la exposición fecal por una estrecha observación durante 2 d.
  2. Tratamiento de suelos
    1. Recoge 1 - 2 kg de tierra vegetal rica orgánica (debe contener la mayor densidad y diversidad de microbios) de aproximadamente 7 - 15 cm en profundidad y colocar en un recipiente de plástico limpio. Tenga en cuenta que el suelo debe ser utilizado dentro de los dos días consecutivos a la toma.
    2. Terriblectly después de período de exposición inicial, separar los dos grupos de antibiótico tratado y el pescado sin tratar en vasos de plástico individuales que contienen 18,2 g de suelo en 130 ml de APW. Mezclar el suelo en el pozo de agua con la mano antes de añadir el pescado. La mayor parte de las partículas no suspenden y se quedan en el fondo de la copa.
    3. Exponer a los peces con una duración de 3 días a 25 ° C y grabar cualquier mortalidad.

6. Desafío estrés osmótico

  1. Después del tratamiento, seguido de un período de descanso de 10 h como se describió anteriormente, individualizar los peces en las tazas separados que contienen NaCl a 17,5 mg / ml (300 mM) en 150 ml de APW. Este es un medio de la salinidad del agua de mar típica, que no es completamente letal (<50%) para el control de los peces, pero es fuertemente estresante, lo que requiere la osmorregulación eficaz.
  2. Observar si se produce la mortalidad de peces sobre una duración de 36 h.

7. Toxicidad del nitrato Challenge

  1. pescado debe descansar por un período de 10 horas después de exposiciones a los antibióticosUre, y el pescado, entonces separada en copas individuales que contienen una concentración de nitrato de sodio de cualquiera de 10 mg / ml (118 mM) o 17,5 mg / ml (206 mM) en 130 ml de APW.
  2. Registro de mortalidad durante 4 d de dosis baja y 1 d para alta dosis.

8. Análisis de crecimiento de los peces individualizada o agrupada

  1. Completado 3 d exposición a antibióticos o control periodo como grupos en cubos.
  2. Para individual, llenar de 8 onzas vasos de plástico con 150 ml cada APW, transferir un pez determinado en la taza y registrar el peso corporal total para la evaluación inicial.
    1. Repita este procedimiento para todos los peces en ambos grupos tratados y no tratados. Use vasos de plástico blanco en lugar de vasos de plástico claras porque los peces no va a comer cuando en los vasos transparentes.
  3. Alimentar a los peces todos los días con la dieta estándar de dos gránulos por los peces. Los sedimentos se utiliza en lugar de escamas debido pelets tienen una baja varianza en la masa individuo (3,53 ± 0,42 mg cada una, o% de variación 8), resulting en el pescado recibir cantidades similares de alimentos. Controlar el consumo mediante el registro visual gránulos sin comer. Las tasas de consumo eran por lo general por encima del 80%.
  4. Al final de cada semana durante 4 semanas, determinar el peso de pescado. Preparar una nueva taza con APW fresca, colocar en una balanza, y luego registrar el peso. A continuación, se vierte un pez en una red de inmersión de la copa original y transferir a la nueva taza, que luego se pesa de nuevo. Los peces no son manejados para evitar el estrés.
  5. Para grupos, colocar 2 l de APW en un cubo de 19 L y tarar la balanza. Mantener a los peces juntos en ambos grupos cuando se transfieren a nuevos cubos APW a continuación, registrar el peso total del grupo. Registro de peso grupo de pescado a la semana durante un período de tiempo mes mediante la transferencia a un nuevo cubo.

9. El tiempo de tránsito intestinal

  1. Utilice 70 kDa dextrano aniónica marcada con fluoresceína. El dextrano no se digiere de manera significativa, y es demasiado grande para ser absorbido a través de la capa de intestino, así el paso medirá el tiempo de tránsito a través del intestino.dextrano marcado se incorpora en alimento para peces.
  2. En un tubo estéril de 1,7 ml, añadir 360 l de agua desionizada estéril y 52 mg de gelatina (solución al 13%), y colocar el tubo en un bloque de calor a 60 ° C hasta que se derrita la gelatina y se haya disuelto completamente.
    1. Moler las escamas de peces de colores de alimentos a un polvo fino utilizando un mortero y una mano de mortero, y añadir 40 mg de este polvo al tubo, junto con 20 l de aceite de pescado. Después de mezclar, añadir 1,6 mg de FITC-dextrano.
  3. Dispensar la mezcla de líquido caliente en 20 l cae sobre Parafilm sobre la mesa de laboratorio, y dejar que se enfríe y solidifique rápidamente. Las gotas se pueden almacenar durante un máximo de 4 d antes de que sean demasiado difícil para los peces para comer. Tienda gotas en el refrigerador colocando el Parafilm en medio de una placa de Petri, que se flotó a continuación en agua estéril dentro de un contenedor de plástico sellado, lo que mantiene las gotas humidificado.
  4. Justo antes de la alimentación, trimestre cae en secciones usando una hoja de afeitar. Aclimatarse a los peces a la Styrovasos de espuma de forma individual para 2 días sin alimentación (Nota: sólo se utilizaron los peces de control no expuestos). Coloque cuatro cuartas partes de la comida en la taza con el pescado, y observar los peces durante 30 minutos para indicar la cantidad de piezas de los alimentos que comen cada uno.
  5. Para comenzar el período de seguimiento, transferir los peces de forma individual en las tazas con 80 ml de APW utilizando una red de inmersión. Cada 2 horas, remover suavemente el APW a mano, y luego tomar una muestra y tienda de 1 ml en un tubo etiquetado 1,7 ml a 4 ° C. Tomar muestras durante 36 h.
  6. fluorescencia Record, con una espectrofotómetro de fluorescencia, de todas las muestras al mismo tiempo después de la finalización del ensayo. Coloque el entero 1 ml de muestra en una cubeta, y registrar la fluorescencia medida usando excitación a 495 nm y emisión a 520 nm.

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Resultados

Un diagrama esquemático general del sistema experimental usado para estudiar los efectos de acogida de pescado de la exposición a antibióticos 13 está representado en la figura 1A, e incluye la técnica para la extracción de la piel (Figura 1B) y el intestino (Figura 1C) microbiomas de los peces. Tres días fue seleccionado como el período de antibióticos de la exposición anterior, porque los datos revela que mientr...

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Discusión

Algunos retos requieren un período de descanso en APW limpia después del tratamiento con antibióticos para que el fármaco se haya agotado en tejidos de peces. Si se omite el periodo de descanso después presencia de antibióticos puede confundir los resultados, especialmente cuando el ensayo implica la exposición a las bacterias. Con el fin de examinar los efectos de una composición microbioma alterada sin grandes cambios en el número total de microbios en el host, los experimentos preliminares composición microbioma moni...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este proyecto fue parcialmente financiado por un premio FAST (Faculty and Student Team) a TPP y JMC de EURECA (Centro para Mejorar las Experiencias de Investigación de Pregrado y Actividades Creativas) en la Universidad Estatal Sam Houston.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RifampicinaCalbiochem557303-1GM
Nitrato de sodioSigmaAldrich S5506
Dextrano aniónico de 70 kDa marcado con fluoresceínaThermoFisher ScientificD1823
Tabletas de solución salina tamponada con fosfato (PBS) LasCalbiochem6500-OPse disuelven en agua para producir PBS
tabletas

Referencias

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