Summary
La reestenosis después de los procedimientos cardiovasculares (cirugía de bypass, angioplastia o stent) es un problema significativo que reduce la durabilidad de estos procedimientos. Una terapia ideal inhibiría la proliferación de células de músculo liso (VSMC) mientras promovía la regeneración del endotelio. Describimos un modelo para la evaluación simultánea de la proliferación VSMC y la función endotelial in vivo.
Abstract
La reconstrucción arterial, ya sea angioplastia o cirugía de derivación, implica un traumatismo iatrogénico que causa disrupción endotelial y proliferación de células de músculo liso vascular (VSMC). Los modelos murinos comunes estudian vasos pequeños tales como las arterias carótida y femoral. Aquí se describe un sistema in vivo en el que tanto la proliferación VSMC y la función de la barrera endotelial pueden ser evaluados simultáneamente en un vaso grande. Se estudió la respuesta aórtica infrarrenal a la lesión en C57BL / 6 ratones. La aorta se lesionó de la vena renal izquierda a la bifurcación aórtica por 30 trituraciones transmurales de 5 segundos de duración con un aplicador con punta de algodón. Los cambios morfológicos se evaluaron con histología convencional. El grosor de la pared de la aorta se midió desde la superficie luminal hasta la adventicia. EdU integración y contador tinción con DAPI y alfa-actina se utilizó para demostrar VSMC proliferación. La activación de ERK1 / 2, un moderador conocido de la formación de hiperplasia intimal, fue disuadidaExtraído por Western Blot. El efecto de la inflamación se determinó mediante inmunohistoquímica para células B, células T y macrófagos . Se visualizaron secciones frontales de endotelio con microscopía electrónica de barrido (SEM). La función de la barrera endotelial se determinó con tinción con Evans Blue. La lesión transmural resultó en un espesamiento de la pared aórtica. Esta lesión inducida por la proliferación VSMC, más prominentemente a los 3 días después de la lesión, y la activación temprana de ERK1 / 2 y disminución de p27 kip1 expresión. La lesión no resultó en aumento de células B, células T o infiltración de macrófagos en la pared del vaso. La lesión causó la desnudación parcial de las células endoteliales y la pérdida del contacto célula-célula. La lesión resultó en una pérdida significativa de la función de la barrera endotelial, que regresó a la línea de base después de siete días. El modelo transmural de lesión aórtica romana transmural proporciona un sistema eficiente para estudiar simultáneamente tanto la proliferación VSMC como la función de la barrera endotelial en un vaso grande.
Introduction
Restenosis Después de los procedimientos cardiovasculares (cirugía de bypass, angioplastia o stent) es un problema significativo que reduce la durabilidad de estos procedimientos. Todos los procedimientos de revascularización están plagados de reestenosis. Las estrategias actuales para prevenir la reestenosis (stents liberadores de fármacos y globos revestidos con fármacos) inhiben tanto la célula muscular lisa vascular (CMLV) como la proliferación de células endoteliales (EC). En consecuencia, estas intervenciones previenen la reestenosis mediada por VSMC, pero también previenen la regeneración del endotelio. Sin un endotelio intacto, se requiere que los pacientes estén en potentes agentes antiplaquetarios para disminuir el riesgo de trombosis in situ con riesgo de complicaciones hemorrágicas. Una terapia ideal inhibiría la proliferación de VSMC mientras que promovía la regeneración del endotelio. Por lo tanto, existe la necesidad de estudiar simultáneamente la proliferación VSMC y la función de barrera endotelial in vivo .
En la actualidad, hayModelos de ratón de restenosis 1 . Estos modelos incluyen la ligadura de la carótida y la lesión del hilo de la arteria femoral 2 . Los modelos aórticos incluyen la colocación del stent 3 , lesión por globo 4 y aloinjerto aórtico 5 . Todos los modelos actuales son limitados. La ligadura carotídea genera una lesión neoíntima mediada por flujo y no tiene lesión endotelial. Además, las arterias carótida y femoral tienen muchas capas de células plegadas menos que los vasos humanos, limitando su valor de traducción. La aorta del ratón, de aproximadamente 1,3 mm de diámetro, es el único vaso que se aproxima a una arteria humana (coronaria) clínicamente relevante (3).
A pesar del potencial de traslación de los modelos aórticos murinos de la enfermedad, los modelos actuales tienen limitaciones. Estos modelos requieren habilidades microquirúrgicas avanzadas y equipos especializados tales como globos de angioplastia y stents. Aquí presentamosUna técnica nueva y reproducible para inducir simultáneamente la proliferación de VSMC y alterar la función de la barrera endotelial.
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Protocol
Declaración de Ética: Los protocolos para el manejo de animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales (IACUC) de la Universidad de Maryland (protocolo número 0416009) y conducido de acuerdo con los estándares de AAALAC-International.
1. Procedimiento Quirúrgico
- Técnica Anestésica
- Esterilizar todos los instrumentos utilizados en la cirugía de supervivencia con esterilización a vapor a 121 ° C durante 30 min.
- Inducir la anestesia a través de un tanque de inducción con 100% de O 2 y 2,5% de isoflurano entregado a través de vaporizador de precisión. Después de la inducción, suspender el isoflurano y enjuagar la cámara con O 2 . Mantener la anestesia con 1,5-2% de isoflurano vía mascarilla y 1 L / min de O 2 por inhalación.
- Conecte la cámara de inducción y la máscara facial a un eliminador de carbón para adsorción de gases residuales para proteger al personal. Asegurar un plano anestésico adecuadoQue no hay respuesta a los estímulos nocivos (pinzamiento del dedo).
- Crear un campo operatorio que consiste en una bandeja quirúrgica con almohadilla isotérmica para proporcionar soporte térmico durante la cirugía. Una almohadilla isotérmica adicional proporcionará apoyo térmico a los animales en su jaula de recuperación.
- Preparación de Animales
- Lleve a cabo la siguiente investigación en ratones C57BL / 6 machos de 10-12 semanas de edad.
- Quitar el pelo en la superficie abdominal ventral del animal desde el esternón a la región inguinal con un agente depilatorio o una podadora eléctrica con una cuchilla número 40.
- En caso de agente depilatorio, aplicar este compuesto en el área quirúrgica durante 2-3 minutos y luego eliminarlo con algodón. Utilizamos un compuesto comercialmente disponible de hidróxido de calcio e hidróxido de sodio.
- Preparar el área sobre el hombro con alcohol al 70% e inyectar por vía subcutánea carprofeno (5 mg / kg) con una aguja calibre 25 o menor. EstaEl tratamiento proporcionará analgesia postoperatoria para el animal.
- Transferir el animal al campo quirúrgico y colocarlo en decúbito dorsal.
- Prepare el sitio quirúrgico frotando 8-12% de providone-yodo con un aplicador de algodón limpio o gasa de algodón. A continuación, enjuague la piel dos veces con alcohol al 70%.
- Coloque lubricante ocular en ambos ojos para reducir la incidencia de desecación corneal. Cubrir el sitio quirúrgico con un paño estéril.
- Técnica Operativa
- Realizar una incisión mediana de laparotomía abdominal de aproximadamente 2-2.5 cm de largo con un bisturí comenzando inmediatamente caudal el proceso xifoide y extendiéndose hacia la pelvis.
- Movilizar el intestino delgado y el duodeno y reflejar lateralmente a la derecha. Enrolle una tira de algodón estéril calibrado y empapado con solución salina estéril para inyección para permitir el embalaje de las vísceras para mejorar la exposición.
- Con el intestino delgado movilizado hacia el lado derecho delAbdomen, exponen el retroperitoneo y exponen la aorta abdominal de la vena renal izquierda a la bifurcación aórtica ( Figura 1 ).
- Con un aplicador estéril con punta de algodón, entregar 30 machos consecutivos, cada cinco segundos de duración.
- Retire el empaque y permita que las vísceras vuelvan a su posición nativa.
- Cerrar la fascia con una sutura de monofilamento absorbible 4-0 (polidioxanona). La piel se cierra con una sutura de monofilamento no absorbible 6-0 (nylon).
- Recuperación y atención después del procedimiento
- Después del procedimiento, coloque el animal en una jaula de recuperación con ropa de cama limpia en una almohadilla isotérmica para continuar el apoyo térmico hasta que el animal pueda moverse normalmente. No deje al animal desatendido hasta que demuestre la capacidad de mantener la decúbito esternal.
- Vigilar el animal cada hora durante las primeras 4 h después de la cirugía. Una vez que el animal está ambulando normalmente regreso T a la sala de cría asignada. El animal no se alojará en compañía de otro animal hasta que se haya recuperado completamente.
- Vigilar el animal dos veces al día durante las primeras 72 h después de la cirugía y al menos 3 veces a la semana después. El monitoreo incluye el pesaje del animal tres veces a la semana.
- Administrar carpofen (5 mg / kg) por vía subcutánea dos veces al día durante las primeras 72 h después de la cirugía.
2. Adquisición de tejidos
- Método de Eutanasia
- Eutanizar a los animales en puntos de tiempo predeterminados.
- Inducir la anestesia a través de un tanque de inducción con 100% de O 2 y 2,5% de isoflurano entregado a través de vaporizador de precisión.
- Para estudiar la integridad del endotelio, administre el tinte azul de Evans al animal.
NOTA: Evans Blue es un colorante azo cargado negativamente con una alta afinidad de unión para la albúmina y sólo puede manchar los vasos sanguíneos en ausencia de un endotelio intactoS = "xref"> 6. - Para los estudios de integridad endotelial, en el momento de la eutanasia, perfundir a los animales con 5 ml de colorante Evans Blue 0,3% seguido por 5 ml de PBS a presión fisiológica durante 5 min. El animal se mantiene en un plano quirúrgico de anestesia durante el procedimiento de perfusión.
- Para estudiar la integridad del endotelio, administre el tinte azul de Evans al animal.
- Después de lograr un plano anestésico profundo, abra el pecho con una esternotomía. Hacer una laceración en la aurícula derecha para permitir el drenaje de la sangre del animal y acceder al ventrículo izquierdo se accede con una aguja de 21 G e inyectar solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta que el efluente de la aurícula derecha sea claro.
- Después de la perfusión con PBS, entrar en el abdomen a través de una incisión de línea media.
- Una vez más, movilice el intestino delgado hacia el lado derecho del abdomen exponiendo la aorta infrarrenal, diseccione agudamente la aorta de los tejidos adyacentes y extráigala de la vena renal izquierda a la bifurcación aórtica.
- Almacenar la aorta extirpada en un 4% paraformalEhyde hasta que se produzca el procesamiento del tejido.
- Para los estudios de integridad endotelial, abrir la aorta longitudinalmente y fijarla a una lámina de cera exponiendo la totalidad de la superficie luminal 6 . Realizar una evaluación cualitativa de la integridad endotelial por el grado de tinción con colorante Evans Blue 6 .
- Para otros ensayos histológicos, corte transversalmente la aorta e incorpórela en los compuestos de temperatura óptima de corte (OCT) según lo determinado por el método histológico a utilizar 7 .
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Representative Results
Se seccionaron las secciones transversales aorta incrustadas en PTU y se tiñeron con hematoxilina y eosina luego se tiñeron con tinción de Verhoeff-Van Gieson (VVG) para identificar la lámina elástica interna y externa 7 . La lesión por aplastamiento indujo el espesamiento de la pared aórtica en comparación con las aortas de los animales tratados con un procedimiento simulado (laparotomía y movilización del intestino delgado solo). El grosor de la pared, evaluado por la distancia desde la adventicia al lumen, fue mayor tres días después de la lesión (42,2 ± 1,7 μm frente a 22,1 ± 1,1 μm para laparotomía sola) ( Figura 2A-B ). La lesión dio como resultado que las células tuvieran una apariencia más redondeada y un contorno irregular de la superficie luminal ( Figura 2C ).
El aumento del engrosamiento de la pared de la aorta lesionada está mediado, al menos en parte, por una proliferación aumentada de músculo liso vascular medialCle células. Para demostrar que el engrosamiento de la pared es debido a la proliferación aumentada en comparación con la hipertrofia celular, se utilizó un ensayo de proliferación de EdU. En este ensayo, el análogo de timidina 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) se administra intravenosamente al ratón 24 h antes de la eutanasia. EdU se incorpora en el ADN durante la síntesis. EdU se detecta mediante una reacción de clic (cicloadición de azida-alquino catalizada con cobre usando un colorante fluorescente verde) 8 . Los ratones Sham expuestos sólo a laparotomía no habían observado fluorescencia en ninguna capa de la aorta. Conversley, los ratones sometidos a lesión aórtica demostrado fluorescencia en los medios de comunicación y la íntima de la aorta ( Figura 3 ].
El espesamiento de la pared aórtica después de la lesión por aplastamiento activa las vías de señalización celular implicadas en la reestenosis en seres humanos. La proteína quinasa activada por mitógenos (MAP quinasa) ERK1 / 2 es uno de los principales mediadores de la formación de hiperplasia intimalEn respuesta a la estimulación de un mitógeno, ERK1 / 2 es fosforilado y activado 9 , 10 . Los datos de nuestro laboratorio también han demostrado que el inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina p27 kip1 disminuye en respuesta a los estímulos mitogénicos en la pared vascular 12 . Los ratones fueron sacrificados a 1, 3, 7 días y 1 mes después de la lesión de aplastamiento aórtico. Se aisló la aorta infrarrenal y se determinó la expresión de proteína de ERK1 / 2, fosfo-ERK1 / 2 (la forma activada de ERK1 / 2) y el inhibidor de cinasa dependiente de ciclina p27 kip1 mediante análisis de transferencia Western ( Figura 4A ). No se observó ningún cambio en la expresión total de la proteína ERK1 / 2 a lo largo del tiempo. Sin embargo, tres días después de la lesión, la expresión de fosfo-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) fue más de 200% mayor que la expresión de Pi-ERK1 / 2 basal. P27 kip1 expresión disminuyó en los primeros puntos de tiempo y alcanzó un nadir de aproximadamente el 20% de la línea de base siete días afLesión. La expresión de Pi-ERK1 / 2 y p27 kip1 se aproximó a los niveles basales un mes después de la lesión ( Figura 4B ). Por lo tanto, el espesamiento observado de la pared aórtica es al menos en parte debido al aumento de la proliferación medial.
El modelo de lesión aórtica permite la evaluación simultánea tanto de la proliferación del músculo liso medial como de la función de la barrera endotelial. Se utilizó microscopía electrónica de barrido (SEM) para caracterizar el efecto de la lesión por aplastamiento sobre la morfología del endotelio. La superficie luminal de la aorta está revestida por un endotelio confluente que evita la adhesión de células y moléculas sanguíneas ( Figura 5A , Barra de escala = 100 μm). En contraste, la lesión por aplastamiento produce disrupción de las células endoteliales y desnudación parcial del endotelio ( Figura 5B , Barra de escala = 100 mu m). Como se observa a mayor aumento, la disrupción del endotelio resulta en adhesiDe partículas consistentes en tamaño y forma con plaquetas. La adhesión de estas partículas ocurre a lo largo de toda la zona de lesión, y no se limita a las áreas de denudación gruesa observadas a menor aumento ( Figura 5C , Barra de escala = 50 μm). La morfología de la partícula adherente se observa mejor a mayor aumento. Estas partículas son consistentes con las plaquetas y la fibrina ( Figura 5D , escala bar = 10 μm).
Además de la morfología endotelial, la función de barrera del endotelio puede evaluarse con este modelo de lesión vascular. El colorante azo Evans Blue no puede permear el endotelio normal e intacto de la aorta murina. El daño a la función de barrera del endotelio permite la tinción de la membrana basal con Evans Blue. Los ratones tratados con una laparotomía sola (simulada) mantenían la función de barrera del endotelio y estas aortas eran blancas. La lesión por aplastamientoPérdida difusa de la función de la barrera endotelial y estas aortas manchadas de color azul oscuro. La intensidad de la tinción con Evans Blue se redujo tres días después de la lesión de aplastamiento, y la función de barrera completa se restableció la semana después de la lesión ( Figura 6A ]. La función de la barrera endotelial se puede cuantificar adicionalmente pesando las muestras y homogeneizando en un volumen de 10 veces la solución de ácido tricloroacético al 50%. La dilución del sobrenadante en etanol 4 veces permite la determinación de la intensidad de fluorescencia (excitación 620 nm y emisión 680 nm) como se describe por Aoki et al . 11 . La cantidad de Evans Blue eluída de la aorta infrarrenal fue tres veces mayor en las aortas inmediatamente después de la lesión en comparación con las aortas sometidas sólo a laparotomía (lesionado - Día 0). La aorta continuó teñiendo con Evans Blue a los tres días de la lesión, pero con menor intensidad que en el momento de la lesión, lo que sugiere una recuperación gradual de la función de la barrera endotelial. Una semana despuésLa lesión de la aorta tenía tinción equivalente como una aorta tratada con laparotomía sola ( Figura 6B ).
Figura 1: La lesión se crea por triturado brusco de la aorta de la vena renal izquierda a la bifurcación aórtica. Figura adaptada con permiso de Yu et al ., PLoS One 2015 12 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Lesión por aplastamiento induce espesamiento de la pared aórtica. ( A ) La lesión por aplastamiento indujo cambios morfológicos en la aorta. Las secciones representativas de 5 μm se tiñeron con VVG a 0ºC,1, 3 y 7 días después de la lesión. Barras de escala = 100 μm. ( B ) El grosor de la pared fue mayor 3 días después de la lesión, 42,2 ± 1,7 μm, y fue significativamente mayor que la aorta de los animales simulados expuestos a laparotomía sola, 22,1 ± 1,1 μm. La significación estadística se determinó con la prueba t de dos colas del estudiante. * Denota p <0,05, n = 3. ( C ) La lesión por aplastamiento indujo una apariencia redondeada de VSMC medianas (teñidas en verde para actina de músculo liso-α) y la orientación celular cambiante. Los núcleos se contrastaron con DAPI (Blue). Barras de escala = 10 μm. Los datos se presentan como medias y desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Lesión por aplastamiento induce proliferación celularRación en el muro aórtico. Los ratones fueron expuestos a la laparotomía sola (simulada) o laparotomía con lesión de aplastamiento aórtico. Se administró el análogo de timidina 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) 24 h antes de la eutanasia. EdU se incorpora en el ADN durante la síntesis. El EDU se detecta mediante una reacción de clic (cicloadición de azida-alquino catalizada con cobre usando colorante verde fluorescente). No había ningún EdU (verde) detectable en la pared aórtica de los animales simulados. En los animales sometidos a lesión por aplastamiento, EdU manchó prominentemente en los medios de la aorta y en un grado algo menor en la íntima. Las células de músculo liso vascular se identificaron mediante tinción con anticuerpo de actina de músculo liso-α (rojo). Este hallazgo sugiere que el espesamiento de pared observado observado en la Figura 2 se debe a un aumento en la proliferación celular. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figurmi.
Figura 4: La ruta de proteína quinasa activada por mitógeno (MAP quinasa) se activa en respuesta a lesión por aplastamiento. ( A ) La MAP quinasa ERK1 / 2 se fosforila cuando se activa y se asocia con hiperplasia intimal y reestenosis. Los ratones fueron sacrificados a 1, 3, 7 días y 1 mes después de la lesión de aplastamiento aórtico. El análisis de transferencia de Western se usó para evaluar la expresión de proteína de ERK1 / 2 total, fosfo-ERK1 / 2, y el inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p27 kip1 . La expresión de la proteína se normalizó a un animal simulado tratado con laparotomía sola. ( B ) No se observó ningún cambio en la expresión total de la proteína ERK1 / 2 a lo largo del tiempo. Sin embargo, tres días después de la lesión, la expresión de fosfo-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) fue más de 200% mayor que la expresión de Pi-ERK1 / 2 basal. P27 expresión kip1 disminuido en los primeros puntos de tiempo unD alcanzó un nadir de aproximadamente el 20% de la línea de base siete días después de la lesión. La expresión de Pi-ERK1 / 2 y p27 kip1 se aproximó a los niveles basales un mes después de la lesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Lesión por Aplastamiento Perturba las Células Endoteliales Aórticas. ( A ) Se utilizó microscopía electrónica de barrido (SEM) para caracterizar el efecto de la lesión por aplastamiento sobre la morfología del endotelio. La superficie luminal de la aorta normal está revestida por un endotelio confluente que evita la adhesión de células y moléculas de sangre. ( B ) La lesión por aplastamiento produce la disrupción de las células endoteliales y la desnudación parcial del endotelio. ( C ) Como se ve en mayor magnificaLa disrupción del endotelio resulta en la adhesión de partículas consistentes en tamaño y forma con plaquetas. La adhesión de estas partículas ocurre a lo largo de toda la zona de lesión, y no se limita a áreas de denudación gruesa observadas a menor aumento. ( D ) A mayor aumento, estas partículas son consistentes con las plaquetas y la fibrina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La lesión aórtica contundente permite la cuantificación de la función de barrera endotelial. ( A ) El daño a la función de barrera del endotelio permite la tinción de la membrana basal con colorante Evans Blue. Los ratones tratados con una laparotomía sola (simulada) mantuvieron la función de barrera del endotelio yEstas aortas eran blancas. La lesión por aplastamiento produjo una pérdida difusa de la función de la barrera endotelial y estas aortas se tiñeron de color azul oscuro. La intensidad de la tinción con Evans Blue se redujo tres días después de la lesión por aplastamiento, y la función de barrera completa se restableció la semana después de la lesión. ( B ) La unión de Evans Blue a la aorta infrarrenal se cuantificó eluyendo Evans Blue de la muestra y la cuantificación por intensidad de fluorescencia. Los datos se presentan como medias y desviaciones estándar. La mayor cantidad de Evans Blue se eluyó de la aorta inmediatamente después de la lesión por aplastamiento. En el momento de la lesión, la aorta se unió tres veces más Evans Blue que la aorta sometida a laparotomía sola. A medida que se dejaba que la aorta se recuperase, había menos unión al cabo de uno y tres días después de la lesión. Una semana después de la lesión, la aorta limitaba la misma cantidad de azul de Evans que las aortas sometidas a laparotomía sola. La significación estadística se determinó con la prueba t de dos colas del estudiante. DeNotas p <0,05, n = 3, NS denota no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos caracterizado los efectos de un modelo de lesión aórtica murina que resulta en hiperplasia medial y disfunción de la barrera endotelial. Desprendimiento parcial de la EC a lo largo de la aorta íntima acompañó a la pérdida de contacto célula-célula y la mejora de las protrusiones celulares. De manera correspondiente, la función de la barrera endotelial se deterioró significativamente, lo que estimuló las vías de señalización sensibles a mitógenos, dando lugar a la proliferación de VSMC y el engrosamiento de la pared del vaso. Los puntos fuertes de este modelo es que es técnicamente más fácil de aprender y ejecutar que otros modelos aórticos de la enfermedad y permite la evaluación simultánea de la respuesta proliferativa a la lesión y la función endotelial. El paso crítico en este protocolo es la lesión de aplastamiento real. La variabilidad en la extensión de la lesión por aplastamiento puede dar lugar a diversos grados de lesión y, por lo tanto, cantidades variables de proliferación de las células musculares lisas. Un paso que reduce esta variabilidad en nuestro laboratorio es tener uno sCientıfico, cegado al tratamiento o estado experimental, realiza todas las lesiones por aplastamiento.
Una limitación de este modelo es su generalización a los procesos de enfermedad humana clínicamente relevantes. A pesar de la temprana respuesta proliferativa robusta de las VSMC en este modelo, no modela los eventos tardíos de reestenosis, es decir, no se desarrolló neoíntima. La disminución de los mediadores inflamatorios como las citocinas podría regular este proceso. Este hallazgo podría ser debido a la rápida recuperación del endotelio de una lesión parcial. De forma similar a un modelo de lesión vascular previamente descrito en conejos 13 , la infiltración de células inmunes fue menor. En la presente investigación se evaluó el perfil de las citocinas inflamatorias de los animales simulados y animales lesión aórtica con la matriz de profiler. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en el perfil de citoquinas que explicaría la diferencia en la respuesta proliferativa entre animales simulados y lesionados (datosno mostrada). La lesión descrita en el presente informe está temporalmente limitada. Considerando que otros modelos de lesión aórtica y la hiperplasia de la íntima, como el modelo de angioplastia aórtica completamente desnuda el endotelio, el modelo actual sólo parcialmente denude la aorta. La desnudación completa del endotelio requiere mucho más tiempo para recuperarse y estos animales experimentan los efectos de la lesión durante un período de tiempo más largo.
Este modelo produce una respuesta rápida de VSMCs y ECs a la lesión permitiendo la cuantificación de cambios morfológicos y bioquímicos en una semana. Es más eficiente que otros modelos que toman 14-28 días antes de que el efecto de la intervención sea evidente. Este modelo utiliza la aorta murina que es el único vaso murino que se aproxima a un vaso humano clínicamente relevante. La ventaja significativa de esta técnica en comparación con otros modelos aórticos es que este modelo es relativamente fácil de aprender, y no requiere caro o difícil de obtener eqUipmento 2 , 3 , 4 , 5 . En conclusión, el modelo de lesión de aplastamiento aórtico murino proporciona una plataforma in vivo técnicamente sencilla, económica y eficiente para evaluar simultáneamente la respuesta de los VSMC y EC a la lesión vascular.
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Disclosures
Este trabajo fue financiado por el Departamento de Asuntos de Veteranos de Desarrollo de la Carrera de Premio (1IK2BX001553-01) (TSM) y la Vascular Cures EJ Wylie Scholarship (TSM).
Acknowledgments
Agradecemos a Hsia Ru-ching PhD, de la Facultad de Microscopía Electrónica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, por su apoyo técnico en el procesamiento de las muestras de microscopía electrónica de barrido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
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