Un sensor basado en aptámero para no quelado de gadolinio (III)

Resumen

Se describe el uso de moléculas de polidesoxinucleótidos (aptámero de 44 meros) para detectar iones de gadolinio (III) no quelados en una solución acuosa. La presencia del ion se detecta a través de un aumento en la emisión de fluorescencia del sensor.

Resumen

Se demuestra un método para determinar la presencia de ion gadolinio trivalente no quelado (Gd³⁺) en solución acuosa. Gd³⁺ a menudo está presente en muestras de agentes de contraste a base de gadolinio como resultado de reacciones incompletas entre el ligando y el ion, o como un producto de disociación. Dado que el ion es tóxico, su detección es de vital importancia. En este trabajo, se describe el diseño y el uso de un sensor basado en aptámero (sensor Gd) para Gd³⁺. El sensor produce un cambio de fluorescencia en respuesta al aumento de las concentraciones del ion y tiene un límite de detección en el rango nanomolar (~100 nM con una relación señal-ruido de 3). El ensayo puede ejecutarse en un tampón acuoso a pH ambiente (~7 - 7,4) en una microplaca de 384 pocillos. El sensor es relativamente poco reactivo hacia otros iones metálicos fisiológicamente relevantes, como los iones de sodio, potasio y calcio, aunque no es específico para Gd³⁺ sobre otros lantánidos trivalentes como el europio (III) y el terbio (III). Sin embargo, los lantánidos no se encuentran comúnmente en los agentes de contraste o en los sistemas biológicos, por lo que el sensor puede usarse para determinar selectivamente Gd³⁺ no quelado en condiciones acuosas.

Introducción

La creciente importancia de la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) en el diagnóstico clínico, que está limitado por la sensibilidad inherente de la técnica, ha dado como resultado el rápido crecimiento de la investigación en el desarrollo de nuevos agentes de contraste a base de gadolinio (GBCAs) ^1. GBCAs son moléculas que se administran para mejorar la calidad de la imagen, y por lo general tienen la estructura química de un ion trivalente de gadolinio (Gd ³⁺⁾ coordinado a un ligando polidentado. Esta formación de complejos es de importancia crítica que no quelado Gd ³⁺ es tóxico; se ha implicado en el desarrollo de fibrosis sistémica nefrogénica en algunos pacientes con enfermedad renal o insuficiencia ^2. En consecuencia, la detección del ion libre acuosa es fundamental para garantizar la seguridad de GBCAs. La presencia de no quelado Gd ³⁺ en soluciones GBCA a menudo es el resultado de una reacción incompleta entre el ligando y el de iones, la disociación del complejo, o displacement por otros cationes metálicos biológicos ^3.

Entre las diversas técnicas que actualmente se utilizan para determinar la presencia de Di-s ^3+, aquellos que dependen de cromatografía y / o rango más alto espectrometría en términos de versatilidad y aplicabilidad ^4. Entre sus puntos fuertes son de alta sensibilidad y precisión, la capacidad de analizar diversas matrices de muestra (incluyendo suero humano ^5, la orina y el pelo ^6, aguas residuales ^7, y formulaciones de agentes de contraste ^8), y la cuantificación simultánea de múltiples complejos de Gd ^{+ 3} (un listado de los estudios anteriores a 2013 se describe en una revisión exhaustiva por Telgmann et al.) ^4. El único inconveniente es que varios de estos métodos requieren instrumentaciones (como la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente) ⁴ que algunos laboratorios no pueden tener acceso a. En el contexto de descubrimiento novedoso GBCA en la investigación y los niveles de prueba de concepto, arbasado en el método espectroscópico elatively más conveniente, rápida y rentable (tales como absorción UV-Vis o fluorescencia) puede servir como una alternativa valiosa. Con estas aplicaciones en mente, un sensor basado en aptámero fluorescente para acuosa Gd ^{3 + 9} fue desarrollado.

El aptámero (Gd-aptámero) es una larga molécula de ADN de una sola hebra 44-base con una secuencia específica de bases que se aisló a través del proceso de evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) ^9. Para adaptar el aptámero en un sensor fluorescente, un fluoróforo está unido al terminal 5 'de la hebra, que después se hibridó con una hebra de temple (QS) a través de 13 bases complementarias (Figura 1). El QS está marcado con una molécula extintor oscuro en el extremo 3 '. En ausencia de Gd ^{3 +,} el sensor (Gd-sensor), compuesto por una relación molar 1: 2 de Gd-aptámero y QS, respectivamente, tendrán mínima emisión de fluorescencia debido to transferencia de energía desde el fluoróforo al extintor. La adición de acuoso Gd ³⁺ desplazará al QS del Gd-aptámero, resultando en un aumento de la emisión de fluorescencia.

La Figura 1. El sensor (Gd-sensor) que consiste en el largo aptámero 44-base (Gd-aptámero) etiquetadas con fluoresceína (un fluoróforo) y el filamento 13-base largo de temple (QS) etiquetadas con DABCYL (un extintor oscuro) . En ausencia de no quelado Gd ^3+, la fluorescencia del sensor es mínimo. Con la adición de Gd ^3+, el desplazamiento de la QS se produce y se observa un aumento en la emisión de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Hay en la actualidad, un método basado en la espectroscopia de uso general para detectaring ³⁺ acuosa Di-s. Este ensayo utiliza el anaranjado de xilenol molécula, que se somete a un cambio en la longitud de onda de absorción máxima 433 a 573 nm sobre la quelación con el ion ^10. La relación de estos máximos dos absorbancia se puede utilizar para cuantificar la cantidad de no quelado Gd ^3+. El sensor de aptámero es una alternativa (también puede ser complementaria) con el ensayo de naranja de xilenol, como los dos métodos tienen diferentes condiciones de reacción (tales como el pH y la composición de las soluciones tampón se utiliza), selectividades de destino, los rangos lineales de cuantificación, y las modalidades de detección ^9.

Protocolo

NOTA: agua de calidad de biología molecular se utiliza en todas las preparaciones de tampón y de solución. Todos los tubos de microcentrífuga desechables (y PCR) y puntas de pipeta son DNasa y RNasa libre. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) para todos los productos químicos antes de su uso. Se recomienda el uso de equipo de protección personal (EPP) apropiado.

1. Preparación de los aptámeros de archivo Soluciones

1. Compra 2 hebras de polidesoxinucleótido comercialmente. Ordenar ambas cadenas con la purificación mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
   MODALIDAD 1 (Gd-aptámero):
   5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   Capítulo 2 (QS):
   5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
2. Disolver cada hebra en agua para hacer 100 mM de soluciones madre individuales del Gd-aptámero y el QS.
3. Almacenar estas soluciones a -20 ° C. Las soluciones son estables hasta la fecha, durante 3 años.
4. Para minimizar Freezciclos de e-descongelación, almacenar las soluciones madre en 10 alícuotas.

2. Preparación de la 2x Gd-sensor Solution

1. Preparar el tampón de ensayo (HEPES 20 mM, 2 mM _MgCl2, NaCl 150 mM, KCl 5 mM). Ajustar el pH a ~ 7,4 con NaOH y HCl, y filtrar a través de filtros estériles desechables botella superiores a los 0,2 micras membrana de PES. Almacenar en frascos estériles. Si se filtra y se almacena adecuadamente (a temperatura ambiente), el tampón es estable hasta el momento, por 2 años.
2. Diluir 1 l de la solución de Gd-aptámero de la (del paso 1.2) y 2 l de la solución madre de QS (de la etapa 1.2) en 497 l de tampón de ensayo. Mezclar bien usando un vórtice. Sus concentraciones en la solución de Gd-sensor 2x son 200 nM y 400 nM, respectivamente.
   Nota: El volumen de la solución de Gd-sensor 2x preparado en este paso es de 500 l, que es suficiente para poner a prueba 6 - 7 concentraciones variables de Gd ³⁺ para la curva de calibración y las soluciones de agentes de contraste(paso 3). Cada muestra dará a pocillos duplicados de una placa de 384 pocillos.
   1. Ajustar el volumen de la solución de Gd-sensor 2x de acuerdo con el número de soluciones de Gd ³⁺ que tiene que ser probado.
3. Transferir la solución de Gd-sensor de 2x en 9 tubos de PCR, con 50 l en cada tubo. Colocar los tubos en un termociclador.
4. Ajuste el programa en el ciclador térmico para calentar la solución en los tubos a 95 ° C, mantener durante 5 min, y luego enfriar lentamente las soluciones a 25 ° C durante ~ 15 min (a razón de ~ 0,05-0,1 ° C / s). El ciclo de calentamiento y enfriamiento es asegurar la hibridación óptima entre el Di-s-aptámero y el QS. resultados de la hibridación parciales en temple incompleta y un fondo más alta de fluorescencia del sensor. Si un termociclador no está disponible, llevar a cabo este procedimiento utilizando un baño de agua caliente en su lugar.
5. Una vez enfriado a 25 ° C, utilizar inmediatamente la solución, o mantener en el termociclador (hasta alrededor de 2 h) hasta que esté listo para serusado. Cuando se utiliza un baño de agua para el calentamiento, dejar los tubos en el baño como el agua se enfría lentamente a temperatura ambiente.

3. La construcción de la curva de calibración de fluorescencia y detectar la presencia de no quelado Gd ³⁺ en una solución de agente de contraste Gd

1. Disolver GdCl ₃ sólido en el tampón de ensayo (el mismo tampón que en el paso 2.1).
2. A través de dilución en serie, preparar 100 l cada uno de 6 diferentes soluciones Gd ³⁺ en tubos de microcentrífuga a doble de las concentraciones finales deseadas para la curva de calibración (2x soluciones).
   1. Por ejemplo, para construir una calibración para 0 (sólo tampón sin GdCl _3), 50, 100, 200, 400, y 800 nM de Gd ^3+, preparar soluciones que contienen 0, 100, 200, 400, 800, y 1600 nM del ión. Asegúrese de que siempre incluyen el "blanco" con 0 nM Gd ^{3 +} como control negativo.
3. Se disuelve el agente de contraste para ser pruebaed en el tampón de ensayo. Preparar 2 o 3 concentraciones diferentes de las soluciones de agentes de contraste a través de dilución en serie.
   NOTA: Prueba de 3 concentraciones diferentes de la solución de agente de contraste se recomienda. Esto es para asegurar que estas concentraciones están dentro del rango lineal. Si las muestras analizadas no muestran una relación lineal, reducen las concentraciones del agente de contraste utilizado.
4. Tomar los tubos de PCR que contienen la solución 2x ​​Di-s-sensor desde el paso 2.5 del termociclador.
5. Añadir 50 l de cada solución de Gd ³⁺ desde el paso 3.2 en 6 de los 9 tubos de PCR que contienen la solución 2x Di-s-sensor. Mezclar pipeteando arriba y abajo. Cada tubo de PCR contiene ahora la concentración deseada de Gd ³⁺ a ensayar, 100 nM Gd-aptámero, y 200 QS nm.
6. Para los tubos de PCR restantes que contienen la solución de Gd-sensor de 2x, se añaden 50 l de las soluciones de agentes de contraste desde el paso 3.3. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces.
7. Se incuban las soluciones en los tubos de PCR para alrededor de 5 min a temperatura ambiente. Pueden dejarse reposar durante hasta 30 minutos.
8. Transferir 45 l de cada tubo en una placa de 384 pocillos. Cada tubo de PCR dará pocillos duplicados.
9. Registrar la fluorescencia de cada pocillo en un lector de placas. El fluoróforo (FAM) utilizado en el diseño de Gd-sensor tiene máximos de excitación y emisión de 495 y 520 nm, respectivamente, como se indica en el sitio web del proveedor. Elija longitudes de onda de excitación y emisión apropiados o filtros en función de si el lector de placas es monochromator- o basado en filtro.
10. Trazar la gráfica de la fluorescencia en unidades arbitrarias de fluorescencia (AFU) frente a la concentración de Gd ^3+.
11. Hacer el gráfico como factor de cambio de fluorescencia frente a la concentración de Gd ^3+. Calcular el factor de cambio de fluorescencia dividiendo el AFU de cada concentración por el AFU de la solución "en blanco" (con 0 nM de Gd ^3+). El pliegue del cambio de fluorescencia permitirá la normalization de los resultados, en caso de que la pantalla AFU algunos periódica (diferentes días, etc.) variaciones.
12. Comparación de la emisión de fluorescencia de la solución que contiene el agente de contraste y el "en blanco", que es la solución que contiene 0 nM GdCl ₃ (sólo tampón).
    NOTA: una mayor fluorescencia de la solución GBCA implica la presencia de no quelado Gd ^3+, que pueden requerir una purificación adicional del agente de contraste. La cantidad de presente no quelado Gd ³⁺ se puede estimar utilizando la curva de calibración construida en el paso 3.10 o 3.11.

Resultados

Un cambio de fluorescencia típico de la solución de Gd-sensor en presencia de no quelado Gd ³⁺ se muestra en la Figura 2. La emisión puede ser trazado como el pliegue del cambio de fluorescencia (Figura 2A) o de la lectura de fluorescencia en bruto (Figura 2B) en unidades arbitrarias (AFU). Ambas parcelas producen curvas de calibración muy similares con un rango lineal para las concentraciones de Gd ³⁺ por debajo de...

Discusión

Usando el Gd-sensor basado en aptámero, un aumento en la emisión de fluorescencia que es proporcional a la concentración de Gd no quelado ³⁺ se observa. Para minimizar la cantidad de muestra utilizada, el ensayo se puede ejecutar en una microplaca de 384 pocillos con un volumen total de la muestra de 45 l por pocillo. En este diseño, la elección de fluoresceína (FAM) y DABCYL (Dab) se basa principalmente en el coste de los reactivos; para modificar la longitud de onda de emisión, una pareja diferente de fluor...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Gd-aptámero	IDTDNA	Secuencia de entrada y modificación del fluoróforo en la forma de pedido	Se puede utilizar un fluoróforo con una longitud de onda de emisión diferente. El aptámero también se puede pedir a otra empresa.
Filamento de enfriamiento	IDTDNA	Secuencia de entrada y modificación del enfriador en la forma de pedido	Se puede utilizar un enfriador diferente para una transferencia de energía óptima desde el fluoróforo. El aptámero también se puede pedir a otra empresa.
		de grado de biología molecular	Ningún fabricante específico, tanto con DEPC como sin DEPC funcionan igual
de bien Cloruro de gadolinio (III) anhidro	Strem	936416
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Cloruro de magnesio anhidro	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Cloruro de sodio	Acros Organics
Cloruro de potasio	Fisher Scientific	P333-500
Hidróxido de sodio, pellets	Fisher Scientific	BP359
Ácido clorhídrico	Fisher Scientific	SA49	Tóxico y corrosivo
Placas de poliestireno NBS de fondo plano negro de brida baja de 384 pocillos	Placas Corning	3575	que son adecuadas para fluorescencia lectura.
Filtro estéril desechable para biberones Nalgene Rapid-Flow	Thermo Scientific	5680020	La tapa de la botella está equipada con una membrana PES de 0,2 micras
Frascos estériles desechables de 250 ml	430281	Corning Se puede utilizar un frasco más grande o más pequeño
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL Sin			fabricante específico, siempre que estén libres de ADNasa y ARNasa
Tubos de PCR de			0,2 mLNingún fabricante específico, siempre que estén libres de ADNasa y ARNasa
Micropipetas			Ningún fabricante específico
Puntas de pipeta (sin filtro) de tamaños apropiados			Ningún fabricante específico, siempre que estén libres de ADNasa y ARNasa
EquipmentLector de
placas	Biotek Synergy H1		Los lectores de placas de otros fabricantes funcionarían igual de bien