Las interacciones proteína-proteína pueden ocurrir tanto en el núcleo como en el citoplasma de una célula. Para investigar estas interacciones, se aplica la coinmunoprecipitación tradicional y el ensayo moderno de ligadura de proximidad. En este estudio, comparamos estos dos métodos para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el núcleo y el citoplasma.
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Artículo de método
La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y
En este artículo
Resumen
Resumen
Las interacciones proteína-proteína están involucradas en miles de procesos celulares y ocurren en un contexto espacial distinto. Tradicionalmente, la coinmunoprecipitación es una técnica popular para detectar interacciones proteína-proteína. El análisis de Western blot posterior es el método más común para visualizar proteínas coinmunoprecipitadas. Recientemente, el ensayo de ligadura de proximidad se ha convertido en una poderosa herramienta para visualizar las interacciones proteína-proteína in situ y brinda la posibilidad de cuantificar las interacciones proteína-proteína por este método. Al igual que la inmunocitoquímica convencional, la técnica de ensayo de ligadura de proximidad también se basa en la accesibilidad de los anticuerpos primarios a los antígenos, pero por el contrario, el ensayo de ligadura de proximidad detecta interacciones proteína-proteína con una técnica única que implica PCR de círculo rodante, mientras que la inmunocitoquímica convencional solo muestra la colocalización de proteínas.
El factor nuclear 90 (NF90) y la proteína 3 del motivo de unión al ARN (RBM3) han sido previamente demostrados como socios interactivos. Se localizan predominantemente en el núcleo, pero también migran al citoplasma y regulan las vías de señalización en el compartimento citoplasmático. Aquí, comparamos la interacción NF90-RBM3 tanto en el núcleo como en el citoplasma mediante coinmunoprecipitación y ensayo de ligadura de proximidad. Además, discutimos las ventajas y limitaciones de estas dos técnicas en la visualización de las interacciones proteína-proteína con respecto a la distribución espacial y las propiedades de las interacciones proteína-proteína.
Introducción
Factor nuclear 90 (NF90) es una proteína multi-isoforma con numerosas funciones, incluyendo la respuesta a la infección viral, la regulación de la interleucina-2 post-transcripción y la regulación de los genes miARN la biogénesis 1-3. RBM3 es una proteína de unión al ARN, implicados en la traducción y miARN biogénesis y puede ser inducida por varios factores estresantes incluyendo hipotermia y la hipoxia 4-6. Recientemente, hemos encontrado NF90 y RBM3 en un complejo de proteínas 7. La interacción de NF90 y RBM3 es esencial para modular la actividad de la proteína quinasa ARN-como retículo endoplásmico quinasa (PERK) en respuesta a pr....
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Protocolo
1. Co-inmunoprecipitación
- Seed HEK293 células a 2 x 10 5 células por pocillo en una placa de 6 pocillos en 2 ml de modificación Medium (DMEM) suplemento de Eagle de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) .
- Se cultivan las células durante 48 horas a 37 ° C con 5% de CO2.
- Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) tres veces. Las células de la cosecha por centrifugación a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Preparación de las dosis nucleares y citoplasmáticos usando reactivos comerciales de extracción nucleares y citoplasmátic....
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Resultados
La Figura 1 demuestra que NF90 y RBM3 son ambas proteínas nucleares y sólo una pequeña fracción está presente en el citoplasma. En particular, hay tres bandas distintas marcadas positivo para RBM3. El más pequeño justo debajo de 20 kDa refleja el tamaño correcto de RBM3 (el peso molecular predicho de RBM3 es 17 kDa). El origen de las otras dos bandas que queda por investigar. experimentos de co-inmunoprecipitación con RBM3 como la proteína cebo revelaron que las interacc.......
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Discusión
Hay varios beneficios, así como las deficiencias de ambos métodos. Como una técnica relativamente nueva, una ventaja obvia de ensayo de ligamiento por proximidad es la viabilidad de dilucidar las interacciones proteína-proteína a nivel de una sola célula en lugar de un lote de células heterogéneas. Las imágenes con alta resolución y magnitud (por ejemplo, mediante microscopio confocal) proporcionan la posibilidad para la cuantificación contando puntos fluorescentes individuales. En contraste, la combinación con.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (SNSF, 31003A_163305).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| El águila modificada de Dulbecco' s Medio (DMEM) | Sigma | D6429 | Alto contenido de glucosa 4.500 mg/L |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicilina-Estreptomicina (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Reactivos de extracción nuclear y citoplasmática | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Ditiotritol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein | G Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) | BD Transduction Laboratories | 612154 | uso 1:1.000 para WB y 1:100 para el anticuerpo ICC/PLA |
| RBM3 | ProteinTech | 14363-1-AP | uso 1:1.000 para WB y 1:100 para el anticuerpo ICC/PLA |
| Lamin A/C | Tecnología | de señalización celular#2032 | use 1:1,000 para WB |
| anticuerpo anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | uso 1:1.000 para WB |
| conejo normal IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-conejo IgG, anticuerpo secundario ligado a HRP | Tecnología de señalización celular | #7074 | uso 1:5,000 para WB |
| anti-ratón anti-ratón anticuerpo secundario HRP | Carl Roth | 4759.1 | uso 1:5.000 para WB |
| Sustrato secante Clarity Western ECL | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE Tampón de muestra LDS (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Tampón de ejecución (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| Tampón de transferencia NuPAGE (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 Membrana de PVDF | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lisina 8 pocillos Portaobjetos de cultivo | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehído (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Suero de cabra normal (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Cabra anti-ratón IgG (Anticuerpo H+L), Alexa Fluor 488 conjugado | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cabra anti-conejo IgG (Anticuerpo H+L), Alexa Fluor 568 conjugado | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA sonda Anti-ratón PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA sonda Anti-conejo MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Reactivos de detección Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Tampones de lavado Fluorescencia | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Medio de montaje con DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscopio | Olympus | AX-70 | |
| Cámara CCD | SPOT | INSIGHT 2MP Firewire | |
| Película de rayos X Fujifilm | Super RX | ||
| Máquina de procesamiento de película | Fujifilm | FPM-100A |
Referencias
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization....
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Reimpresiones y permisos
