La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y In Situ Ligadura ensayo de proximidad

Resumen

Las interacciones proteína-proteína pueden ocurrir tanto en el núcleo como en el citoplasma de una célula. Para investigar estas interacciones, se aplica la coinmunoprecipitación tradicional y el ensayo moderno de ligadura de proximidad. En este estudio, comparamos estos dos métodos para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el núcleo y el citoplasma.

Resumen

Las interacciones proteína-proteína están involucradas en miles de procesos celulares y ocurren en un contexto espacial distinto. Tradicionalmente, la coinmunoprecipitación es una técnica popular para detectar interacciones proteína-proteína. El análisis de Western blot posterior es el método más común para visualizar proteínas coinmunoprecipitadas. Recientemente, el ensayo de ligadura de proximidad se ha convertido en una poderosa herramienta para visualizar las interacciones proteína-proteína in situ y brinda la posibilidad de cuantificar las interacciones proteína-proteína por este método. Al igual que la inmunocitoquímica convencional, la técnica de ensayo de ligadura de proximidad también se basa en la accesibilidad de los anticuerpos primarios a los antígenos, pero por el contrario, el ensayo de ligadura de proximidad detecta interacciones proteína-proteína con una técnica única que implica PCR de círculo rodante, mientras que la inmunocitoquímica convencional solo muestra la colocalización de proteínas.

El factor nuclear 90 (NF90) y la proteína 3 del motivo de unión al ARN (RBM3) han sido previamente demostrados como socios interactivos. Se localizan predominantemente en el núcleo, pero también migran al citoplasma y regulan las vías de señalización en el compartimento citoplasmático. Aquí, comparamos la interacción NF90-RBM3 tanto en el núcleo como en el citoplasma mediante coinmunoprecipitación y ensayo de ligadura de proximidad. Además, discutimos las ventajas y limitaciones de estas dos técnicas en la visualización de las interacciones proteína-proteína con respecto a la distribución espacial y las propiedades de las interacciones proteína-proteína.

Introducción

Factor nuclear 90 (NF90) es una proteína multi-isoforma con numerosas funciones, incluyendo la respuesta a la infección viral, la regulación de la interleucina-2 post-transcripción y la regulación de los genes miARN la biogénesis ^1-3. RBM3 es una proteína de unión al ARN, implicados en la traducción y miARN biogénesis y puede ser inducida por varios factores estresantes incluyendo hipotermia y la hipoxia ^4-6. Recientemente, hemos encontrado NF90 y RBM3 en un complejo de proteínas ^7. La interacción de NF90 y RBM3 es esencial para modular la actividad de la proteína quinasa ARN-como retículo endoplásmico quinasa (PERK) en respuesta a proteínas desplegadas ^7. Tanto NF90 y RBM3 se encuentran predominantemente en el núcleo, pero una pequeña proporción de NF90 y la lanzadera RBM3 en el citoplasma y se unen allí entre sí para funciones específicas, por ejemplo para regular la actividad PERK. Por lo tanto, es importante para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el compartimiento subcelular, lo que puede indicarsus diversos papeles en el compartimento respectivo.

Hace décadas, los dos híbridos de levadura (Y2H) fue desarrollado para detectar la interacción entre dos proteínas ^8. Sin embargo, debido a la construcción artificial de proteínas fusionadas, resultados falsos positivos han restringido la aplicación de este método. Durante mucho tiempo, co-inmunoprecipitación fue la principal técnica para analizar interacciones proteína-proteína, especialmente en condiciones endógenas ^9. Para analizar el complejo de proteínas co-inmunoprecipitó, Western blot es la técnica más conveniente, mientras que la espectrometría de masas se utiliza cuando se desean súper sensibilidad y precisión. En los últimos años, el ensayo de ligamiento por proximidad ha sido desarrollado como un nuevo método para detectar interacciones proteína-proteína en ambas células y tejidos in situ ^10,11.

A continuación, se comparó el método de co-inmunoprecipitación más popular y relativamente novedoso método de ensayo de ligamiento por proximidad en la captura de NF9interacción 0-RBM3 en fracciones subcelulares. También discutimos las ventajas y limitaciones de ambas técnicas.

Protocolo

1. Co-inmunoprecipitación

1. Seed HEK293 células a 2 x 10 ⁵ células por pocillo en una placa de 6 pocillos en 2 ml de modificación Medium (DMEM) suplemento de Eagle de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) .
2. Se cultivan las células durante 48 horas a 37 ° C con 5% de _CO2.
3. Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) tres veces. Las células de la cosecha por centrifugación a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
4. Preparación de las dosis nucleares y citoplasmáticos usando reactivos comerciales de extracción nucleares y citoplasmáticos. Siga las instrucciones del fabricante, con algunas modificaciones.
   1. Utilice 3 x 10 ⁶ células durante un experimento de co-inmunoprecipitación (aproximadamente con un 90% de confluencia de 3 pozos de una placa de 6 pocillos). Añadir 300 l solución fría citoplasmática de extracción (CER I) y agitar durante 15 segundos a la velocidad más alta.
   2. Incubar durante 30 minutos en hielo. Durante la incubación, vortex para 5 s cada 10 min.
   3. Añadir 16,5 l fría extracción citoplasmática solución II (CER II) y agitar durante 5 segundos y se incuba durante 5 minutos en hielo.
   4. Vortex durante 5 segundos y se centrifuga a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
   5. Transferir el sobrenadante (extracto citoplásmico) en un nuevo tubo de pre-enfriado, y se mantiene en hielo hasta su uso.
   6. Lavar sedimentos insolubles (núcleos que contienen) tres veces con PBS frío 1 ml cada vez pipeteando arriba y abajo cinco veces. Retirar PBS después de lavado.
   7. Añadir 150 l solución fría de extracción nuclear (NER) y agitar durante 15 segundos y se incuba 1 hora en hielo. Durante la incubación, vórtice durante 15 segundos y pipeta de 10 veces con una punta de 200 l cada 10 min.
   8. Vortex durante 15 s y se centrifuga a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
   9. Transferir el sobrenadante (extracto nuclear) en un nuevo tubo de pre-enfriado, se mantiene en hielo hasta su uso.
5. Sacar 10% del volumen de los extractos nucleares y citoplasmáticas cada uno como entradas.
6. UNdd PBS frío a los extractos restantes a un volumen final de 1 ml. Mantener en hielo hasta su uso.
   NOTA: Pre-limpieza no es esencial cuando se utilizan perlas magnéticas G-conjugado de proteína. Sin embargo, si el fondo es alto, llevar a cabo pre-compensación mediante la incubación de 40 proteínas l perlas de G-conjugados magnéticos (50% de lechada) y 1 ml diluidos lisado de esta etapa a 4 ° C durante 30 min en un rotador. sobrenadante separado (lisado pre-aclarado) a partir de perlas con rejilla magnética. Desechar las cuentas.
7. Para anticuerpo primario pareja con perlas magnéticas de proteína G-conjugados, incubar 40 l de proteína perlas magnéticas G-conjugados (50% de lechada) con anticuerpo 4 g de conejo policlonal anti-RBM3 o IgG de conejo (control negativo) en 200 l de PBS más tampón Tween 20 (PBST, 0,02% de Tween 20) a temperatura ambiente (RT) durante 40 min en un rotador.
8. cuentas y sobrenadante separado por anticuerpos acoplados con una cremallera magnética, y desechar el sobrenadante. Se lavan las perlas una vez con 200 l de PBST (0,02%).
9. Añadir 1ml diluyó lisados ​​(o si es necesario lisados, pre-limpiado) a las perlas, y se incuba en un rotador a 4 ° C durante la noche.
10. En el día siguiente, separar las perlas y el sobrenadante por una cremallera magnético, y descartar el sobrenadante. Lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBST (0,02%) para cada tubo a 4 ° C en un rotador con una velocidad fija de 20 rpm.
11. Eluir proteínas a partir de las perlas mediante la adición de tampón de muestra de 40 l (tampón de muestra 1x comercial y 50 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT)). Se calienta a 70 ° C durante 10 min. Girar hacia abajo y líquidos para la transferencia a un nuevo tubo de 1,5 ml.
12. Diluir lisados ​​de entrada en tampón de muestra (concentración final: tampón de muestra 1x comercial y DTT 50 mM) y se calienta a 70 ° C durante 10 min. entradas de carga y proteínas inmunoprecipitadas a partir de la última etapa de un prefabricado de gel de bis-Tris al 4-12%. El volumen de carga de cada pocillo no debe exceder de 20 l. Realizar electroforesis en tampón de desarrollo comercial 1x en hielo durante 35 min.
    NOTA: La carga nuclear y extracto citoplasmáticos en una relación de 1: 2 (V / V), que refleja la misma cantidad inicial de células.
13. proteínas de transferencia a una membrana de PVDF en tampón de transferencia comercial 1x a 30 V durante 2 horas a 4 ° C.
14. Bloquear la membrana con 5% de leche desnatada en PBST (0,1% de Tween 20) a TA durante 40 min en un agitador.
15. Incubar la membrana con anticuerpos primarios (tanto diluido en 1: 1000) en PBST (0,1%) a 4 ° C durante la noche.
16. Lavar 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente en un agitador.
17. Incubar la membrana con peroxidasa de rábano (HRP) conjugada anti-ratón o anti-conejo secundaria de anticuerpos (tanto diluido en 1: 5000) en PBST (0,1%) a temperatura ambiente durante 1 hr.
18. Lavar 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente en un agitador.
19. Utilizar 0,2 ml aumento de quimioluminiscencia (ECL) mezcla de sustrato por membrana cm ^2, incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Evitar toda la luz procedente de esta etapa en adelante, excepto las luces rojas.
20. Desechar el líquido y exponer a una película de rayos X en un cartucho de película. Desarrollar la película utilizando un pr automático de la películaocessing máquina.

2. La inmunocitoquímica y Proximidad ligadura Ensayo

1. Seed células HEK293 en 1.5 x 10 ⁴ células por cámara en diapositiva estucado por una 8-cámara de poli-D-lisina en 0,4 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y 100 U / ml Pen-Strep.
2. Se cultivan las células durante 48 horas a 37 ° C con 5% de _CO2.
3. Aspirar medio, y fijar las células con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 10 min a RT.
4. Aspirar PFA y lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBS por cámara.
5. Permeabilizar y las células de bloque con 0,5% Triton X-100 y 5% de suero normal de cabra (NGS) en PBS a temperatura ambiente durante 1 hr.
6. Incubar con anticuerpos primarios en 0,1% de Triton X-100 y 5% de NGS en PBS en un agitador a 4 ° C durante la noche. Diluir monoclonal de ratón anti-NF90 anticuerpo y anticuerpo policlonal de conejo anti-RBM3 1: 100 en PBS durante de doble tinción. Para el control negativo, independientemente omitir cualquiera de los dos anticuerpos primarios, y omitir ambos anticuerpos en un tercer control.
   NOTA: No utilice el bloqueo comercial y reactivos de dilución.
7. Lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBS por cámara.
8. Sin perjuicio de protocolos de ensayo de ligación de inmunocitoquímica o de proximidad
   1. La inmunocitoquímica
      1. Incubar con 1: 500 diluido fluorescente anti-ratón de colorante acoplado verde y anti-conejo anticuerpos secundarios acoplados a colorantes fluorescentes rojas a RT durante 1 hr. Evitar la luz de este paso adelante.
      2. núcleos contratinción con 4 ', 6-diamidin-2-fenilindol (DAPI) diluido 1: 5000 en PBS a temperatura ambiente durante 10 min.
      3. Lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBS por cámara.
      4. Retire las cámaras de la lámina de vidrio y seco. Montar con 250 μ, por diapositiva medio de montaje.
   2. ensayo de ligamiento por proximidad
      1. Preparar sondas de ensayo de ligadura de proximidad. Mezclar y diluir dos sondas de ensayo de proximidad ligadura (anti-ratón y anti-conejo secundaria de anticuerpos unidos con diferentes oligonucleótidos que pueden ligar los THáspera la adición de otros dos oligonucleótidos en solución de ligación) ambos 1: 5 en 0,1% de Triton X-100 y 5% de NGS en PBS, con un volumen total de 320 l para una diapositiva 8-cámara (aproximadamente 40 l por cm ²⁾ . Incubar a TA durante 20 min.
      2. Retire las cámaras de la lámina de vidrio y añadir las sondas diluidas. Incubar en una incubadora con humedad a 37 ° C durante 1 hr.
      3. Preparar la solución de ligación. Mezclar 8 l de ligasa, 64 l 5 x ligadura de valores y 248 l _{de H2O}
      4. Toque el líquido desde la diapositiva, y lavar 2 x 5 min en 1x tampón de lavado A (suministrado con el kit).
      5. Añadir solución de ligación y se incuba en un incubador de humedad a 37 ° C durante 30 min.
      6. Preparar la solución de amplificación. Mezclar 4 l polimerasa, 64 l de 5x amplificación de valores y 252 l _{de H2O} Evitar la luz de este paso adelante.
      7. Elimine el líquido de la diapositiva, y lavar 2 x 2 min en 1x tampón de lavado A.
      8. Añadir el amplificadorlification solución e incubar en una incubadora con humedad oscuridad a 37 ° C durante 100 minutos.
      9. Toque el líquido desde la diapositiva, y lavar 2 x 10 min en 1x tampón de lavado B (suministrado con el kit). Lavar durante 1 min en tampón de lavado 0,01x B.
      10. Secar el portaobjetos y montar con 250 l de un medio de montaje comercial (con DAPI) por portaobjetos.
9. Examine las señales fluorescentes bajo el microscopio utilizando una lente ocular 10X y 20X lente objetivo. Adquirir imágenes mediante una cámara CCD.

Resultados

La Figura 1 demuestra que NF90 y RBM3 son ambas proteínas nucleares y sólo una pequeña fracción está presente en el citoplasma. En particular, hay tres bandas distintas marcadas positivo para RBM3. El más pequeño justo debajo de 20 kDa refleja el tamaño correcto de RBM3 (el peso molecular predicho de RBM3 es 17 kDa). El origen de las otras dos bandas que queda por investigar. experimentos de co-inmunoprecipitación con RBM3 como la proteína cebo revelaron que las interacc...

Discusión

Hay varios beneficios, así como las deficiencias de ambos métodos. Como una técnica relativamente nueva, una ventaja obvia de ensayo de ligamiento por proximidad es la viabilidad de dilucidar las interacciones proteína-proteína a nivel de una sola célula en lugar de un lote de células heterogéneas. Las imágenes con alta resolución y magnitud (por ejemplo, mediante microscopio confocal) proporcionan la posibilidad para la cuantificación contando puntos fluorescentes individuales. En contraste, la combinación con...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
El águila modificada de Dulbecco' s Medio (DMEM)	Sigma	D6429	Alto contenido de glucosa 4.500 mg/L
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10270106
Penicilina-Estreptomicina (PenStrep)	BioConcept	4-01F00-H
NE-PER Reactivos de extracción nuclear y citoplasmática	Thermo Fisher Scientific	78833
1,4-Ditiotritol (DTT)	Carl Roth	6908.3
Dynabeads Protein	G Novex, Thermo Fisher Scientific	10003D
DRBP76 (NF90/NF110)	BD Transduction Laboratories	612154	uso 1:1.000 para WB y 1:100 para el anticuerpo ICC/PLA
RBM3	ProteinTech	14363-1-AP	uso 1:1.000 para WB y 1:100 para el anticuerpo ICC/PLA
Lamin A/C	Tecnología	de señalización celular#2032	use 1:1,000 para WB
anticuerpo anti-GAPDH	Abcam	ab8245	uso 1:1.000 para WB
conejo normal IgG	Santa Cruz	sc-2027
anti-conejo IgG, anticuerpo secundario ligado a HRP	Tecnología de señalización celular	#7074	uso 1:5,000 para WB
anti-ratón anti-ratón anticuerpo secundario HRP	Carl Roth	4759.1	uso 1:5.000 para WB
Sustrato secante Clarity Western ECL	Bio-Rad	#1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX
NuPAGE Tampón de muestra LDS (4x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP0007
NuPAGE MES SDS Tampón de ejecución (20x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP0002
Tampón de transferencia NuPAGE (20x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP00061
Amersham Hypond P 0.2 Membrana de PVDF	GE Healthcare Life Sciences	10600021
Poly-D-Lisina 8 pocillos Portaobjetos de cultivo	Corning BioCoat	354632
Paraformaldehído (PFA)	Sigma	P6148
Suero de cabra normal (NGS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	PCN5000
Cabra anti-ratón IgG (Anticuerpo H+L), Alexa Fluor 488 conjugado	Thermo Fisher Scientific	A-11001
Cabra anti-conejo IgG (Anticuerpo H+L), Alexa Fluor 568 conjugado	Thermo Fisher Scientific	A-11011
4′, 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)	Sigma	D9542
Duolink PLA sonda Anti-ratón PLUS	Sigma	DUO92001
Duolink PLA  sonda Anti-conejo MINUS	Sigma	DUO92005
Duolink Reactivos de detección Red	Sigma	DUO92008
Duolink Tampones de lavado Fluorescencia	Sigma	DUO82049
Duolink Medio de montaje con DAPI	Sigma	DUO82040
Mowiol 4-88	Sigma	81381
Microscopio	Olympus	AX-70
Cámara CCD	SPOT	INSIGHT 2MP Firewire
Película de rayos X Fujifilm		Super RX
Máquina de procesamiento de película	Fujifilm	FPM-100A