Artículo de método

Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas

DOI:

10.3791/55219

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25 de febrero de 2017

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1Laboratory of Pathology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Experimental Transplantation and Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute

En este artículo

Resumen

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Describimos un método para clasificar células individuales de mamíferos y cuantificar la expresión de hasta 96 genes diana de interés en cada célula. Este método incluye el uso de estándares internos de qPCR para permitir la estimación de recuentos absolutos de transcripciones.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las mediciones de la expresión génica de poblaciones masivas de células pueden oscurecer la considerable variación transcriptómica de las células individuales dentro de esas poblaciones. Las mediciones de la expresión génica de una sola célula pueden ayudar a evaluar el papel del ruido en la expresión génica, identificar correlaciones en la expresión de pares de genes y revelar subpoblaciones de células que responden de manera diferente a un estímulo. En este trabajo describimos un procedimiento para medir la expresión de hasta 96 genes en células individuales de mamífero aisladas de una población en cultivo de tejidos. Las células se clasifican en tampón de lisis mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), y las especies de ARNm de interés se transcriben y amplifican de forma inversa. A continuación, se mide la expresión génica utilizando una máquina de PCR microfluídica en tiempo real, que realiza hasta 96 ensayos de qPCR en hasta 96 muestras a la vez. También describimos la generación y el uso de patrones de amplicón de PCR para permitir la estimación del número absoluto de cada transcripción. En comparación con otros métodos de medición de la expresión génica en células individuales, este enfoque permite la cuantificación de transcripciones más distintas que el ARN FISH a un costo menor que el ARN-Seq.

Introducción

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Las células individuales en una población pueden mostrar respuestas muy diferentes a un estímulo fisiológico uniforme 1, 2, 3, 4. La variación genética de las células en una población es un mecanismo para esta variedad de respuestas, pero también hay varios factores no genéticos que pueden aumentar la variabilidad de respuestas, incluso en una población clonal de células. Por ejemplo, los niveles de proteínas individuales y otras moléculas de señalización importantes pueden variar sobre una base de celda por celda, dando lugar a la variación en los perfiles de expresión de genes aguas abajo. Además, la activación de genes puede ocurrir en ráfagas de corta duración de las transcripciones de 5, 6 que puede estar limitado a un número relativamente pequeño de las transcripciones por ráfaga 7, 8, 9. Talestocasticidad en la activación de genes puede contribuir en gran medida a la variabilidad en las respuestas biológicas y puede proporcionar una ventaja selectiva en los microorganismos 10 y en células de mamíferos 1, 2 de responder a un estímulo fisiológico. Debido a ambas fuentes genéticos y no genéticos de variación, el perfil de expresión génica de cualquier célula dada en respuesta a un estímulo puede diferir en gran medida de perfil de expresión génica medio obtenido de la medición de la respuesta a granel. La determinación de la medida en la que las células individuales muestran variabilidad en la respuesta a un estímulo requiere de técnicas para el aislamiento de células individuales, la medición de los niveles de expresión de los transcritos de interés, y el análisis computacional de los datos de expresión resultantes.

Existen varios enfoques para ensayar la expresión génica en células individuales, que cubren una amplia gama de costos, número de transcripciones sondeó, yexactitud de la cuantificación. Por ejemplo, una sola célula RNA-Seq ofrece una amplia profundidad de la cobertura transcripción y la capacidad de cuantificar miles de distintas transcripciones de los genes más altamente expresado en las células individuales; sin embargo, el costo asociado con tal profundidad de secuenciación puede ser prohibitivo, aunque los costos continúan disminuyendo. Por el contrario, una sola molécula de ARN hibridación in situ fluorescente (FISH smRNA) ofrece una cuantificación precisa de las transcripciones para incluso bajo la expresión de genes a un costo razonable por gen de interés; sin embargo, sólo un pequeño número de genes diana puede ensayarse en una célula dada por este enfoque. ensayos basados ​​en PCR cuantitativa, que se describe en este protocolo, proporcionan un término medio entre estas técnicas. Estos ensayos emplean una máquina de PCR en tiempo real de microfluidos para cuantificar hasta 96 transcripciones de interés en un momento en hasta 96 células. Si bien cada uno de los métodos antes mencionados tiene los costos de hardware necesarios, el costo de cualquier ensayo qPCR individuo es relativamentebajo. Este protocolo es una adaptación de uno sugerido por el fabricante de una máquina de PCR en tiempo real de microfluidos (Protocolo de ADP 41, Fluidigm). Para habilitar la estimación del número absoluto de cada una transcripción en un enfoque basado en la PCR, hemos ampliado el protocolo para hacer uso de los controles internos de los amplicones del gen diana preparados que se pueden utilizar a través de múltiples experimentos.

Como ejemplo de esta técnica, la cuantificación de la expresión de genes regulados por la p53 supresor de tumores en células MCF-7 de carcinoma de mama humano se describe 11. Las células se expusieron a un agente químico que induce ADN de doble filamento se rompe. Estudios anteriores han demostrado que la respuesta de p53 al ADN doble filamento se rompe exhibe una gran cantidad de heterogeneidad en las células individuales, tanto en términos de los niveles de p53 12 y en la activación de genes diana distintas 11. Además, p53 regula la expresión de más de 100bien caracterizado los genes diana implicados en numerosas vías aguas abajo, incluyendo la detención del ciclo celular, la apoptosis, la senescencia y 13, 14. Puesto que la respuesta mediada por p53 en cada celda es complejo y variable, el análisis de los beneficios del sistema a partir de un enfoque en el que cerca de 100 genes diana se puede probar de forma simultánea en las células individuales, como la que se describe a continuación. Con ligeras modificaciones (tales como métodos alternativos para el aislamiento de células individuales y la lisis), el protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar una amplia gama de tipos de células de mamíferos, transcripciones, y las respuestas celulares.

Con una preparación previa adecuada, una ronda de clasificación de células y medida de la expresión génica puede llevarse a cabo de acuerdo con este protocolo en un período de tres días. El siguiente calendario se sugiere: por adelantado, seleccionar las transcripciones de interés, identificar y validar los pares de cebadores que amplifican el ADNc a partir de los transcrIPTS, y preparar las normas y las mezclas de iniciadores que utilizan estos cebadores. En el Día 1, después del tratamiento de células, la cosecha y ordenar las células, lleve a cabo la transcripción inversa y la amplificación de la diana específica y el tratamiento de las muestras con una exonucleasa para eliminar los cebadores no incorporados. En el día 2, lleve a cabo el control de calidad en células clasificadas utilizando qPCR. Por último, el día 3, medir la expresión génica en las células clasificadas utilizando microfluidos qPCR. La Figura 1 resume los pasos involucrados.

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Protocolo

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1. Preparación anticipada

  1. Seleccione hasta 96 genes de interés, cuya expresión será medido.
    NOTA: Por lo menos uno de estos genes debería ser un "gen de mantenimiento", como ACTB o GAPDH, que se sabe que se expresa a un nivel relativamente alto y constante en las condiciones utilizadas en el experimento. Este gen se utiliza para identificar los pozos según positivamente (paso 8.1) y muestras amplificadas (paso 10.1).
    NOTA: Para el experimento de ejemplo, bien caracterizado, blanco directo de p53 con una variedad de funciones conocidas 11, 14 y GAPDH como se seleccionó un control de limpieza. Por favor, véase la referencia 11 para la lista completa de los genes diana y secuencias de los cebadores utilizados en este estudio.
  2. Identificar posibles pares de cebadores específicos para los genes de interés (por ejemplo, el uso de la literatura científica o una herramienta de diseño de la cartilla como Primer-BLAST) 15. Tener la imprimacións sintetizado y mantenerlas a una concentración madre de 100 mM en agua libre de nucleasa.
    NOTA: Estos cebadores deben ser de 15-25 bases de longitud; producir un amplicón 90-130 pares de bases (pb) de largo; abarcar una juntura exón, si existe, para reducir la posibilidad de amplificar el ADN genómico; tienen temperaturas de fusión de 60 ± 1 ° C; y tienen estructura secundaria mínima 16. Estos cebadores se pueden usar para la transcripción inversa de primera, amplificar ADNc a partir de las transcripciones de interés, y medir la expresión de genes en el ADN qPCR basadas en colorante de unión.
  3. Validar los cebadores.
    1. En primer lugar, obtener ADNc a partir de las células de interés. RNA de la cosecha de las células usando un kit de ARN de recolección según las instrucciones del fabricante o métodos de biología molecular convencionales 17. Reverse-transcribir el ARN en ADNc usando un kit de transcripción inversa con hexámeros aleatorios de acuerdo con las instrucciones del fabricante o metho estándarDS 17.
    2. Para cada par de cebadores, configurar qPCR con el ADN vinculante tinte mezcla maestra, adelante y atrás primers, y el cDNA de la etapa anterior, siguiendo las recomendaciones del fabricante mezcla maestra para condiciones de reacción sugeridas. Ejecutar estas reacciones en una máquina de PCR en tiempo real utilizando un protocolo de ciclos térmicos recomendado por el fabricante mezcla maestra que incluye la adquisición de la curva de fusión.
    3. Después de la qPCR, ejecute las muestras de ADN amplificados en un gel de agarosa al 2% w / v y visualizar el ADN a través de un colorante de intercalación de ADN siguiendo un protocolo estándar 17.
    4. Determinar la eficacia de el par de cebadores mediante la construcción de una curva estándar a partir de diluciones en serie de cDNA (realizada en el paso 1.3.1) de acuerdo con un protocolo estándar 16.
      NOTA: Un buen par de cebadores dará lugar a una curva de fusión con un pico único, bien definido y una sola banda en la ubicación esperada en el gel 16, hasta class = "xref"> 17 (Figura 2). Si la curva de fusión tiene varios picos o un "hombro", o si el gel tiene múltiples bandas o un frotis, los cebadores se amplifica una secuencia desviado. Rediseño cualquier cebadores que se han observado para amplificar secuencias de fuera de objetivo y repetir los pasos de validación anteriores según sea necesario. Un buen par de cebadores también tendrá una eficiencia de 90 a 110%, con R 2 ≥0.985 para la curva estándar 16; rediseñar los cebadores para las que la eficiencia o R 2 quedan fuera de estos rangos.
  4. Preparar los estándares de ADN amplificados se purificaron.
    1. Para cada par de cebadores validado:
      1. Amplificar la región de interés a partir de ADNc utilizando una ADN polimerasa de alta fidelidad de acuerdo con las recomendaciones del fabricante de la polimerasa para el cebador y la plantilla de ADN concentraciones, condiciones de reacción y las condiciones de los ciclos de PCR, o mediante un protocolo de PCR estándar"xref"> 17.
      2. Ejecutar el ADNc amplificado en un gel de agarosa al 2% w / v y visualizar la banda con un colorante intercalante de ADN 17. Escindir la banda que representa el amplicón usando una hoja de afeitar limpia y colocar la pieza de gel en un tubo de microcentrífuga.
      3. Se purificó el amplicón del gel usando un procedimiento de extracción en gel estándar, tal como una extracción a base de agarasa 17 o un kit de extracción de gel spin-columna, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      4. Medir la concentración de amplicón utilizando un kit de cuantificación de ADNds basado en la fluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Divida la concentración de dsDNA medida por el peso molecular conocido de la amplificación basada en la secuencia del amplicón para obtener el número de moléculas de amplicón por l.
      5. En un tubo de 2,0 ml de unión bajo microcentrífuga, añadir 2 l de amplicón purificada hasta un volumen de tampón de suspensión de ADN de tal manera que la concentración final de amplicon es de 5 x 10 8 moléculas / l.
    2. Cuando se han purificado todos los amplificados, se combinan 18 l de cada amplicón purificado en un tubo de 2,0 ml de unión bajo microcentrífuga. Añadir tampón de suspensión de ADN para hacer un volumen total de 1.800 l; Por lo tanto, la concentración de cada amplicón es de 5 x 10 6 moléculas / l.
      NOTA: Esta mezcla, que contiene los amplicones de ADNc de todos los genes de interés en cantidades equimolares conocidos, servirá como un estándar en una sola célula de qPCR.
    3. Vortex esta norma "5E6" a fondo, centrifugado durante 10 segundos a 2.000 xg, y se dividen en 20 ml de alícuotas en tubos de PCR bajo vinculante. Almacenar las alícuotas a -80 ° C.
  5. Preparar la mezcla de cebador de amplificación diana específica (STA) (10x).
    1. En un tubo cónico de 15 ml, mezclar 25 l de cada cebador 100 mM de valores (hasta 192). Añadir tampón de suspensión de ADN para hacer un volumen total de 5.000 l.
      Nota laconcentración de cada cebador en esta mezcla es 500 nM. Cada placa de células clasificadas utilizará 105,6 l de esta mezcla de cebadores para cebar la transcripción inversa y la amplificación de la diana específica. El volumen de imprimación mezcla dada aquí es suficiente para hacer que las placas 45 para ordenar. Es recomendable hacer un gran volumen suficiente de mezcla de cebadores de modo que sólo hay que hacer una vez; escalar los volúmenes según sea necesario.
    2. Mezclar bien con un vórtex, se dividen en 110 ml de alícuotas y almacenar las alícuotas a -20 ° C.
  6. Preparar las mezclas de ensayo, una para cada par de cebadores, para su uso en qPCR basado en chip microfluídico.
    1. En cada pocillo de una placa de 96 pocillos PCR, se combinan 3,0 l de cebador directo 100 mM para un gen dado, 3,0 l de la 100 M cebador inverso correspondiente, 24,0 l de tampón de suspensión de ADN y 30.0 l de reactivo de carga de ensayo 2x .
    2. Vortex esta placa, centrifugado durante 10 segundos a 500 xg, y se almacena a -20 ° C.
  7. Crear dos programas de ciclo térmico: RTSTA (transcripción y amplificación de la diana específica inversa; Tabla 1) y ExoI (tratamiento con exonucleasa I; Tabla 2).

2. Tratamiento

  1. Placa de las células de mamífero en un plato de cultivo de tejido de tal manera que van a crecer hasta la confluencia deseada en el momento del tratamiento, dependiendo de las condiciones del estudio experimental. Para el ejemplo presentado en este estudio, la placa 4 x 10 5 células MCF-7 p53-Venus 18 por placa de 6 cm en medio RPMI con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 250 ng / ml de anfotericina B. se incuban las células durante dos días a 37 ° C con 5% de CO 2 hasta que alcanzan el 50% de confluencia.
  2. Tratar las células para establecer la condición de interés basado en el estudio experimental. Para el ejemplo presentado en este estudio, se incuban las células p53-Venus MCF-7 con 400 ng / ml neocarzinoestatina durante 3 h, 8,5 h, 14 h, o 24 horas.

3. Preparación de lisis búfer para la clasificación de células

NOTA: Realización de una sola placa de tampón de lisis dura aproximadamente 1 hora. Es recomendable hacer y placas de tipo múltiple, como la clasificación de células puede ser ineficiente y producir muchos pozos sin células detectable.

  1. Limpiar el banco, pipetas, bastidor de tubo de, los titulares de frío placa de PCR, y los guantes con una solución descontaminante de ADN en preparación para la PCR.
  2. Diluir el inhibidor de RNasa a 2,64 U / l mediante la adición de inhibidor de RNAsa de stock libre de nucleasa de agua en un tubo de 1,5 ml.
    NOTA: Esto permite inhibidor de RNasa que se añade al tampón de lisis sin pipetear volúmenes de sub-l.
  3. Hacer tampón de lisis para las células mediante la combinación de los componentes enumerados en la Tabla 3.
  4. Transferir 92,4 l de tampón de lisis para las células en un tubo separado; este será el tampón de lisis para los estándares de amplicón.
  5. usando low vinculante puntas de pipeta y tubos de microcentrífuga, preparar 200 l y 500 l de ADN de E. coli diluido a 3,1 pg / l y 6,2 pg / l, respectivamente, con tampón de suspensión de ADN.
  6. Añadir 184,8 l de / l de ADN de E. coli 3,1 pg al tampón de lisis para las células.
    NOTA: El ADN portador coli E. sirve para ampliar el alcance de las posibilidades de unión del cebador no específica y por lo tanto reducir la probabilidad de que la dimerización de cebadores dará lugar a un producto de PCR.
  7. Preparar normas.
    1. Etiquetar seis tubos de microcentrífuga bajo vinculante como 5E5, 5E4, ... 5e0.
    2. Añadir 90 l de tampón de suspensión de ADN al tubo "5E5".
    3. Añadir 90 l de / l de ADN de E. coli 6,2 pg a cada uno de los otros cinco tubos. Mantenga todos los tubos en hielo.
      NOTA: La incorporación de ADN portador en las normas hace que la masa total de ADN en los pocillos estándar comparable a la de los pozos 1 de células; esto reduce el probability que la concentración de los estándares se verá afectada por la unión del ADN a tubos o puntas de pipeta.
    4. Tomar una alícuota de la norma "5E6" (5 x 10 6 moléculas / l de cada uno de amplificación, preparado en el paso 1.4) de almacenamiento. brevemente Vortex y centrifugar brevemente (5 segundos a 500 xg) para asegurar que el líquido está en el fondo del tubo.
    5. Con una punta de pipeta de baja vinculante, añadir 10 l de estándar 5E6 al tubo "5E5". Vórtice brevemente, giro (5 seg a 500 xg), y poner de nuevo el tubo en hielo.
    6. Pipeta de 10 l del tubo "5E5" en el tubo "5E4". Vórtice brevemente, giro (5 seg a 500 xg), y volver a poner en hielo.
    7. Repetir estas diluciones en serie, con cada tubo de recibir 10 l desde el tubo anterior, hasta que todos los tubos tienen una dilución de estándar.
  8. Preparar una fila de 12 tubos de PCR con tapas. Distribuir 67 l de tampón de lisis "célula" a cada tubo. Tapan los tubos y centrifugar brevemente (5seg a 500 x g) si es necesario.
  9. Usando una pipeta de 12 canales, distribuir 9 l de tampón de lisis "célula" de la fila de tubos de PCR en cada pocillo de las primeras 7 filas de una placa de PCR (Figura 3).
  10. Distribuir 7 l de tampón de lisis "estándar" a cada pocillo de la última fila de la placa (Figura 3).
  11. Utilizando puntas de pipeta bajo vinculante, añadir 2 l de estándar a cada pocillo de la fila inferior según el mapa de la placa (Figura 3).
    NOTA: 2 l de 5 x 10 0 moléculas / l cantidades estándar hasta 10 moléculas, etc.
  12. Añadir 2 l de / l de ADN de E. coli 3,1 pg en los pocillos 10 de células y 100 de células; añadir 2 l de / l de ADN de E. coli 6,2 pg en los pocillos sin células.
    NOTA: Cada 1 de células, 10 células, y 100 de células bien tiene 6,2 pg de ADN de E. coli, la aproximación de la masa de ADN genómico en una sola célula humana. Cada pocillo estándar y no-célula tiene 12,4 pg of E. coli ADN, por un valor aproximado de dos células humanas.
  13. Sellar la placa mediante un sellado térmico estéril, centrifugado durante 5 segundos a 500 xg, y se almacena a 4 ° C hasta que las células están listas para la clasificación.

4. Configuración Clasificador Celular

  1. Programar el clasificador de células activadas por fluorescencia para ordenar en una placa de 96 pocillos según el mapa de la placa (Figura 3); no hay células deben clasificarse en los pocillos H1-H11 H8 o-H12.
  2. Compruebe que el clasificador de células es bien dirigido para la clasificación en una placa de PCR.
    1. Ajuste el ángulo de la corriente de clase al mínimo posible; esta configuración aumenta la probabilidad de que las células se clasifican en las partes inferiores de los pozos en lugar de golpear los lados.
    2. Para apuntar la máquina, sellar una placa de PCR vacía y utilizar la corriente de prueba a las gotas de "Ordenar" de PBS en el sello de la placa de vacío, de acuerdo con las instrucciones de la máquina 19; las gotas deben aterrizar en el the superficie de la junta en una posición por encima del centro del pozo. Para obtener los mejores resultados, verificar el objetivo a través de la longitud y la anchura de la placa.
    3. Si las gotas no aterrizan en la posición correcta, hacerlos desaparecer de la superficie de la junta, volver a calibrar el clasificador de células de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la máquina, y repetir hasta que las gotas en la corriente especie se depositan correctamente.

5. celular de cosecha y clasificación

  1. Trypsinize las células de forma adecuada en la línea celular. Por ejemplo, para células MCF-7, aspirar el medio de las células, enjuagar las células con 1 ml de 0,05% de tripsina, y se incuban las células con 2 ml de tripsina al 0,05% durante 5 minutos a 37 ° C y 5% de CO 2 .
  2. Añadir 8 ml de medio de cultivo celular a las células tratadas con tripsina y transferir los 10 ml de suspensión celular a un tubo de 15 ml. Se centrifuga durante 4 minutos a 400 x g.
  3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en PBS + 2% de FBS.
    NOTA: Un volumen más pequeño se concentra la resuspensión de las células y facilita la clasificación de células; un volumen de resuspensión 500 l funciona bien para un plato de 6 cm de células a 50% de confluencia.
  4. Transferir la suspensión celular a un 5 ml de citometría de flujo de tubo, de pipeteado a través de un filtro de 40 micras para eliminar grupos de células.
  5. Centrifugar la placa de tampón de lisis a 400 xg durante 30 segundos a 4 ° C antes de la clasificación de las células para asegurar que el líquido está en el fondo de los pocillos.
  6. Introducir el tubo con la suspensión de células en el clasificador de células. Abrir el sello en la placa de tampón de lisis y ordenar cuidadosamente las células de interés en la placa según el mapa de la placa y siguiendo las instrucciones del fabricante clasificador celular 19. Para asegurar que las células individuales se clasifican en la máxima pureza, haga funcionar la máquina en el modo de "célula única" y el uso de citometría de flujo estándar compuerta basado en dispersión frontal y lateral 19.
    NOTA: En elexperimento de ejemplo, puerta de las células basadas en la fluorescencia de p53 de Venus para aislar el 15% más brillante de las células individuales 11.
  7. Sellar la placa con un nuevo, sello térmico estéril y se centrifuga a 400 xg durante 1 min a 4 ° C. Colocar la placa en el termociclador y ejecute el programa RTSTA (véase el paso 1.7).
    NOTA: Se realiza la transcripción inversa del ARNm de las células clasificadas y luego amplifica el cDNA de las transcripciones de interés.

6. Tratamiento con exonucleasa

  1. Mezclar diluida exonucleasa I mediante la combinación de los componentes enumerados en la Tabla 4. Preparar una fila de 12 tubos de PCR con tapas. Distribuir 30,5 l de exonucleasa I diluido en cada tubo. Tapan los tubos y girar brevemente (5 segundos a 500 xg) para asegurar que el líquido está en la parte inferior del tubo.
  2. Una vez finalizada la RTSTA, girar la placa de la muestra durante 5 segundos a 500 x g. Con una pipeta de 12 canales, distribuir 3,6 l de exonucleasa diluidaI en cada pocillo de la placa.
  3. Sellar la placa con un sello térmico estéril y brevemente giro (5 seg a 500 xg). Colocar la placa en el termociclador y ejecute el programa Exoi (véase el paso 1.7).
    Nota: Este paso se degrada cualquier cebadores restantes después de amplificación de la diana específica de forma que no interfieran con futuro PCR.

7. La dilución de la muestra

  1. Cuando se termina el tratamiento con exonucleasa, añadir 32,4 l de tampón TE a cada pocillo de la placa de muestra; este es un punto de parada opcional, y las muestras se pueden almacenar a -20 ° C durante varios días.

8. Ordenar control de calidad utilizando qPCR

NOTA: Debido a la clasificación de células no es perfectamente eficiente, este paso es necesario para identificar qué pocillos de la placa ordenada recibieron en realidad una célula. Estas muestras se pueden utilizar para el análisis adicional.

  1. Medir la expresión de los genes de limpieza en cada muestra por qPCR.
  2. Preparar 900 l de ADN vinculante tinte qPCR mezcla maestra para 96 ​​reacciones de acuerdo con el protocolo utilizando cebadores del fabricante de la polimerasa para uno de los genes de limpieza seleccionados en el paso 1.1; las concentraciones exactas de tampón de reacción, polimerasa, cebadores, etc. para esta reacción dependerá de la polimerasa específica que se utiliza.
  3. Distribuir 9 l de mezcla maestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos PCR. Añadir 1 l de muestra de la placa de muestra al pocillo correspondiente de la placa de PCR.
  4. Ejecutar la placa en una máquina de PCR en tiempo real utilizando un protocolo de ciclos térmicos sugerido por el fabricante o de las mezclas siguiendo un protocolo estándar de 20.
  • Analizar los datos qPCR 20; un ejemplo de qPCR datos de las medidas de control de calidad ordenar que figuran a continuación se muestra en la Figura 4.
    1. Compruebe que las mediciones de los pozos sin células muestran un nivel bajo (fondo)de la expresión génica o ninguna expresión en absoluto.
    2. Verificar que las mediciones de los pozos 1 de células se dividen claramente en dos grupos: las muestras positivas con alta expresión de gen y las muestras negativas con niveles de fondo de expresión o ninguna expresión en todo, similar a los pozos no en células.
      NOTA: Las muestras con alta expresión de genes representan células clasificadas reales; aquellos con la expresión de fondo deben ser excluidos de los nuevos análisis.
    3. Verificar que las mediciones de los pocillos 10 de células y 100 de células reflejan la expresión de genes más alta que en los pocillos 1 de células positivas, lo que permite la posibilidad de que la clasificación ineficiente podría causar esos pozos tengan menor número de células que se desee.
    4. Verificar que las mediciones de los pocillos estándar se distribuyen uniformemente en el espacio logarítmico (es decir, que los valores de C T se distribuyen de manera uniforme).
  • Después de la identificación de todas las muestras de 1 célula positiva, realizar un mapa de la placa "Muestra de Mezclas" mapear positiva 1-cell muestras a una nueva placa de 96 pocillos. Incluirá ocho pozos para las normas en este mapa plato. Vea la Figura 5 para un ejemplo.

    • 9. El uso de la expresión genética de Medición de microfluidos qPCR

    NOTA: Por cada paso de esta sección, una pipeta sólo a la primera parada para minimizar la formación de burbujas en los reactivos.

    1. Abrir una fila de 8 tubos PCR. Si hay varias placas de muestras, abrir una segunda fila de 8 tubos PCR y etiquetar los tubos 1-8. Esta fila será para poner en común las normas de varios platos.
    2. En un tubo de 1,5 ml, mezclar 360 l de ADN vinculante tinte qPCR mezcla maestra con 36 l de ADN reactivo carga de la muestra colorante de unión. vórtice brevemente y centrifugado durante 10 segundos a 2.000 x g. Divida esta mezcla (396 l) en la fila sin etiqueta de 8 tubos PCR, la colocación de 48 l en cada tubo.
    3. Usando una pipeta de 8 canales, distribuir 3,3 l de la mezcla de reactivos de carga mezcla maestra / muestra en cada pocillode una nueva placa de 96 pocillos PCR. Etiqueta este plato, "Muestra de las mezclas."
    4. Para cada placa de PCR de muestras:
      1. Vortex la placa durante 10 segundos y centrifugado durante 10 segundos a 500 x g. Retire la tapa y transferir 2,7 l de cada muestra de 1 célula positiva a su correspondiente bien en la Muestra Se mezcla la placa de la célula 1 pozos indicados en el mapa plato.
      2. Si sólo hay una placa de muestras, transferir 2,7 l de cada estándar amplificado a su correspondiente bien sobre la muestra se mezcla placa de acuerdo con el mapa de placa.
      3. Si hay varias placas de muestras, transferir 2,7 l de cada estándar amplificado a su posición correspondiente en la fila con la etiqueta de tubos de PCR. Añadir las normas de la corriente de placa de muestras a cualquier punto de vista que ya están allí. Sellar la placa de muestras cuando se hace uso de una película de sellado.
    5. Si hay varias placas de muestras:
      1. Vórtice de la fila de tubos de PCR que contienen las normas para10 seg y centrifugado durante 10 segundos a 2.000 x g. Transferir 2,7 l de cada tubo de las normas de mezcla en el pocillo correspondiente de la muestra se mezcla placa de acuerdo con el mapa de placa.
    6. Cargar los pozos NTC con 2,7 l de agua libre de nucleasa donde se indica en el mapa plato. Sellar la Muestra Mezclas plato y se almacena a 4 ° C hasta que se necesite.
    7. Pelar la pegatina de la parte inferior de un nuevo chip de microfluidos qPCR. Usando una jeringa de fluido de la línea de control con la tapa en pie, empujar hacia abajo cada resorte acumulador para aflojarlo, e inyectar cada acumulador con 150-200 l de fluido de la línea de control.
    8. Insertar el chip en la máquina de carga y ejecutar el script "Prime". Esto se lleva a ~ 20 min.
    9. Cuando el cebado se hace, vórtice y de girar los platos de mezclas de ensayo (preparado en el paso 1.6) y mezclas de muestra.
    10. Usando una pipeta de 8 canales, transferir 4,5 l de cada mezcla de ensayo en el lado izquierdo del chip qPCR microfluídico de acuerdo con el diagrama de la g> Figura 6. Pipeta con mucho cuidado para evitar la creación de burbujas de aire en la parte inferior de los pocillos. Cuando haya terminado, sellar la placa de mezclas de ensayo y se almacena a -20 ° C para su uso futuro.
    11. Transferir 4,5 l de cada mezcla de muestra en el lado derecho del chip qPCR microfluídico de acuerdo con la Figura 6. Insertar el chip en la máquina de carga y ejecutar el script "Cargar Mix". Esto se lleva a ~ 90 min.
    12. Encienda la máquina de PCR en tiempo real de microfluidos, inicie el software de recogida de datos, y encender la lámpara para que se caliente. Esto se lleva a ~ 20 min.
    13. Cuando se realiza la secuencia de comandos de la mezcla de carga, verificar que no hay líneas de todo el chip esto indicaría un problema de carga. Retirar con cuidado cualquier partícula de polvo desde el chip usando cinta adhesiva o cinta de laboratorio. Insertar el chip en la máquina de PCR en tiempo real de microfluidos y ejecutar la secuencia de recogida de datos. Utilice el software de análisis para examinar los resultados y exportar los datos para su posterior análisis.
    _TITLE "> 10. Análisis de Datos
    1. Retire las mediciones para las que las curvas de amplificación qPCR muestran baja calidad (es decir, para los que las curvas no se parecen a la curva de amplificación sigmoidal estándar) 20.
    2. Extraer muestras con más de 30 de mala calidad o cero mediciones o para los que la expresión de genes housekeeping (véase el paso 1.1) es mucho menor que la mayoría de las otras muestras (Figura 7).
    3. Para cada gen, estimar la ubicación del pico de fusión correcta como la mediana de las localizaciones de pico de fusión de cada muestra. Si la medición tiene un pico de fusión situada a más de 1 ° C respecto a la mediana, eliminar esa medición de la consideración 20.
    4. Para cada gen, crear una curva estándar para estimar el recuento de ARNm en cada muestra utilizando un lenguaje de hoja de cálculo o de secuencias de comandos 20.
      NOTA: Las normas de este experimento se componen de 10, 100, 1.000 o 10.000 moléculasde ADN de doble cadena correspondiente a cada transcrito de interés. Si la transcripción inversa eran perfectamente eficiente, las normas que correspondería a 20, 200, 2.000, y 20.000 moléculas de mRNA, ya que ARNm y ADNc son de cadena sencilla. En la práctica, este no es el caso, por lo que expresan las mediciones como una estimación en unidades de moléculas × E RT, donde E RT es la eficiencia de la transcripción reversa.
      1. Para cada pocillo estándar, identificar m, el número de moléculas de ssDNA (dos veces el número de moléculas de ADN de doble cadena) antes de la amplificación (por ejemplo, 20, 200 moléculas de moléculas, etc.).
      2. Para cada pozo estándar, identificar el valor t C de 20 qPCR.
      3. Con los valores de m y C t, realizar una regresión lineal usando la siguiente ecuación para generar una curva estándar con los parámetros a y b para cada gen, y encontrar el valor R 2 como unan indicador de la bondad del ajuste:
        figure-protocol-1
      4. A partir de la curva estándar, calcular la eficiencia de la PCR para cada gen E:
        figure-protocol-2
        NOTA: Un valor de E mucho mayor que 1.0 (por ejemplo, E> 1,1) no es físicamente realista; un valor de R 2 para la regresión lineal mucho menos de 1,0 (por ejemplo, R 2 <0,985) significa que las normas no están funcionando de manera fiable. Estos problemas generalmente indican que la norma amplicón más bajo cae por debajo de un umbral de cuantificación fiable, y por lo tanto el nivel más bajo debe ser excluido de la regresión lineal. Si una regresión lineal adecuado no se puede hacer utilizando por lo menos tres normas únicas, desechar las mediciones de expresión para el gen.
      5. Si la regresión lineal es adecuada, utilice el ajuste de parámetros resultante a y b </ em> para cada gen para estimar el número de moléculas de ARNm m est (en unidades de moléculas × E RT) para el gen correspondiente en cada muestra de células individuales a partir del valor medido t C:
        figure-protocol-3
      6. Designar a cualquier medida m est <1 m como est = 0. Además, designar cualquier medición sin amplificación en PCR cuantitativa y por lo tanto no tiene valor como t C m est = 0.
        Nota: Las mediciones con un m est menor que el más bajo o mayor que el más alto nivel utilizado en la regresión se encuentran por extrapolación de la curva estándar. Estas estimaciones no son necesariamente válido, pero deben considerarse con precaución.
    5. Visualizar los datos de expresión de genes de una sola célula.
      1. Haz un diagrama de beeswarm (Dorn, J. y Santo, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange / 37105) en la que cada punto representa la expresión de genes en una célula en particular; un ejemplo se muestra en la Figura 8.
      2. Haz un diagrama de violín (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661) en el que la anchura de la "violín" representa la frecuencia de las mediciones de la expresión génica en torno a un nivel particular en el población de células analizadas; un ejemplo se muestra en la Figura 8.
        NOTA: Los análisis más sofisticados pueden sondear las relaciones en la expresión entre los pares de genes 21, 22 y pueden inferir las redes de expresión génica.

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    Resultados

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Una visión general del protocolo se muestra en la Figura 1, incluyendo los pasos para el tratamiento de células, el aislamiento de células individuales mediante FACS, la generación y pre-amplificación de las bibliotecas de ADNc a partir de lisados de una sola célula, la confirmación de bibliotecas de ADNc de una sola célula en pozos ordenados, y la medición de la expresión génica por qPCR.

    En preparación para ...

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    Discusión

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Hemos presentado un método para aislar células de mamíferos individuales de una población de células adherentes cultivadas en cultivo y para someter a ensayo la expresión de aproximadamente 96 genes en cada célula. Buena preparación previa es fundamental para que este método funcione bien. En particular, el diseño y las pruebas de imprimación pares específicos de las transcripciones de interés (pasos 1.2-1.3) son mucho tiempo, pero importantes pasos, como los cebadores determinan la calidad de las mediciones de una sola...

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    Divulgaciones

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Agradecimientos

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Nos gustaría dar las gracias a V. Kapoor en el CCR ETIB Citometría de Flujo Core por su ayuda en la realización de la clasificación de células durante el desarrollo de este protocolo. Agradecemos también a la Unidad de Diagnóstico Molecular CCR LP M. y J. Raffeld y Zhu y el NHLBI ADN Secuenciación y Genómica por su ayuda en la realización de la qPCR durante el desarrollo de este protocolo. Esta investigación fue apoyada por el Programa Intramural del NIH.

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    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    RNeasy Plus Mini KitQiagen74134
    Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad con inhibidor de RNasaThermoFisher4374966
    Phusion ADN polimerasa de alta fidelidadNew England BioLabsM0530S Kit de
    extracción de gel QIAquickQiagen28704
    Quant-iT Kit de ensayo de dsDNA de alta sensibilidadThermoFisherQ33120 
    Tubos de microcentrífuga de baja adherencia de 2,0 ml USAScientific1420-2600
    Tampón de suspensión de ADNTeknovaT0221
    Axygen 0,2 ml Maxymum Recovery Tubos de PCR de pared delgadaCorningPCR-02-L-C
    GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Kit de reactivos de carga de ensayoFluidigm100-3415
    HyClone RPMI 1640 mediosGE Healthcare Life SciencesSH30027.01
    Suero fetal bovino, certificado (EE. UU.)ThermoFisher16000-044
    Solución antibiótica-antimicóticaCorning30-004-CI
    NeocarzinostatinaSigmaN9162
    ELIMINasaDecon Labs1101
    SUPERase-InThermoFisherAM2696
    CellsKit qRT-PCR directo de un solo pasoThermoFisher11753500
    E. coli DNAAffymetrix14380 10 MG
    Película de sellado ThermalSeal, estérilExcel ScientificSTR-THER-PLT
    BD FACSAria IIuBD Biosciences
    HyClone Trypsin 0.05%GE Healthcare Life SciencesSH30236.01
    PBS, 1xCorning21-040-CV
    Falcon 40 µ m Filtro de célulasCorning352340
    Exonucleasa INew England BioLabsM0293S
    SsoFast EvaGreen Supermix con bajo ROXBio-Rad172-5210
    96.96 Dynamic Array IFC para la expresión génica (chip qPCR microfluídico)FluidigmBMK-M-96.96
    Controlador IFC HX (máquina de carga)Fluidigm
    BioMark o BioMark HD (máquina de qPCR microfluídica)Software
     Software Fluidigm
    MATLABMathWorks
    de análisis de PCR en tiempo real Fluidigm

    Referencias

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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