Artículo de método
Este protocolo describe una técnica de ensayo escalable de aseo personal en Drosophila que proporciona datos robustos y cuantitativos para medir el comportamiento de la preparación. El método se basa en la comparación de la diferencia en la acumulación de colorantes en los cuerpos de los animales no ceñidos frente a los cuidados durante un período determinado de tiempo.
El comportamiento de aseo de Drosophila es un complejo programa locomotor de varios pasos que requiere un movimiento coordinado tanto de las patas delanteras como de las patas posteriores. Aquí presentamos un protocolo de ensayo de aseo personal y un nuevo diseño de cámara que es rentable y escalable para estudios pequeños o en gran escala de aseo de Drosophila . Las moscas se espolvorean por todo su cuerpo con colorante amarillo brillante y se da tiempo para eliminar el tinte de sus cuerpos dentro de la cámara. Las moscas se depositan entonces en un volumen establecido de etanol para solubilizar el colorante. Se mide y se registra la absorbancia espectral relativa de muestras de tinte-etanol para animales cepillados frente a no cepillados. El protocolo proporciona datos cuantitativos de acumulación de colorantes para las moscas individuales, que pueden ser fácilmente promediados y comparados entre muestras. Esto permite que los diseños experimentales evalúen fácilmente la capacidad de preparación para estudios en animales mutantes o manipulaciones de circuitos. Este procedimiento eficiente es versátil y escalable. Mostramos wOrk-flow del protocolo y datos comparativos entre animales WT y animales mutantes para el Receptor de Dopamina Drosophila tipo I ( DopR ).
El aseo en Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) es un comportamiento innato robusto que implica la coordinación de múltiples programas motores independientes 1 . Las moscas de la fruta limpian sus cuerpos de polvo, microbios y otros patógenos que podrían inhibir la función fisiológica normal, como la visión y el vuelo, o dar lugar a desafíos inmunológicos importantes. Al detectar y responder tanto a la mecánica 2 como a la activación inmunitaria 3 , las moscas se frotan repetidamente las piernas juntas o en una región del cuerpo objetivo hasta que esté suficientemente lim....
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1. Preparación
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El ensayo de aseo proporciona datos cuantitativos para evaluar el rendimiento del comportamiento basado en el resto relativo del colorante acumulado que queda sobre los cuerpos de moscas después de un tiempo establecido de medición para el aseo (30 min). En la Figura 1 se destacan imágenes de muestra del diseño de la cámara de limpieza deslizante y los pasos principales del ensayo. Las moscas agregan una cantidad significativa de colorante de la formación de polvo inmedi.......
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El ensayo de aseo es relativamente sencillo, pero recomendamos a los experimentadores que presten especial atención a los siguientes temas. Mantener un sello hermético apretando los tornillos en las placas superiores e inferiores después de introducir las moscas y el tinte es esencial para resultados reproducibles. El colorante Brilliant Yellow es muy fino y las articulaciones sueltas permitirán pérdidas de colorante de los bordes de la cámara. La irregularidad en el contenido de colorante para cada pocillo podría fácil.......
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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Deseamos agradecer a Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon y Rose Hedreen por sus primeros trabajos en pruebas y establecimiento de esta metodología y diseños de cámara. Agradecemos a Kelly Tellez y Graham Buchan por leer y editar el manuscrito. Damos las gracias a Andrew Seeds y Julie Simpson por su trabajo pionero y su asesoramiento y apoyo en la sugerencia del uso de Brilliant Yellow Dye (Sigma). Este trabajo es apoyado en parte por el Mary E. Groff Cirugía y Investigación Médica y Educación Charitable Trust, el Bronfman Science Center, y el Hellman Fellows Program.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo transparente de PVC Tygon de alta flexibilidad | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", utilizado con puntas de micropipeta y malla para construir aspiradores de boca Puntas |
| micropipeta (1 mL y 200 μ L) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| , 2 x 2.6 " | McMaster-Carr | 9318T44 | utilizada para construir la cámara de aseo y los aspiradores bucales |
| Dumont #5 Pinzas | Roboz Instrumento quirúrgico | RS-5050 | |
| Tinte amarillo brillante | Sigma-Aldrich | 201375-25G | recomendamos el uso de guantes de nitrilo al manipular este producto |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | configurado para "tocar" |
| Etanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL VWR | International | 10025-726 | |
| Tubos de microcentrífuga de 0,65 mL Los | VWR International | 20170-293 | se pueden reutilizar con ensayos sucesivos |
| Placa UV de 96 pocillos | Corning | ||
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | necesita descargar el catálogo para acceder al número | de producto http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Incubadora Drosophila | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" de plástico acrílico | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 tuercas | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" tornillos de cabeza hexagonal | McMaster-Carr | 92185A199 | la placa inferior debe roscarse para este tamaño de tornillo |
| 8 - 32 x 1/2" tornillos de cabeza hexagonal | McMaster-Carr | 92185A194 | la segunda placa desde la parte superior necesita ser roscada |
| 2 - 56 tornillos de máquina Phillips de cabeza plana de 56 3/8" | McMaster-Carr | 91500A088 | estos mantienen las dos placas centrales juntas |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" tubo de aluminio | McMaster-Carr | 92510A044 | Fabricado internamente; El producto enumerado tiene aproximadamente las mismas dimensiones y debería funcionar para tornillos de tamaño 8. Estos actúan como fundas para los tornillos de 1" y colocan la tapa hexagonal ligeramente hacia arriba de la superficie de la placa superior |
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