La estimulación de la señalización de Notch en el ratón osteoclastos precursores

Resumen

Notch de 'jove_content es una forma de comunicación celular que se basa en el contacto directo entre células. Para inducir correctamente la señalización de Notch in vitro, los ligandos de Notch deben presentarse a las células en un estado inmovilizado. Este protocolo describe los métodos para la estimulación in vitro de la señalización de Notch en precursores de osteoclastos de ratón.

Resumen

muesca de 'jove_content es un componente clave de múltiples procesos fisiológicos y patológicos. Sin embargo, la naturaleza de la señalización de Notch hace que la investigación in vitro de sus funciones variables y a veces contradictorias sea un desafío. Como componente de la comunicación directa célula-célula con receptores y ligandos unidos a la membrana plasmática, la señalización de Notch no puede activarse in vitro mediante la simple adición de ligandos a los medios de cultivo, como es posible con muchas otras vías de señalización. En cambio, los ligandos Notch deben presentarse a las células en un estado inmovilizado.

Las variaciones en los métodos de activación de la señalización Notch pueden conducir a diferentes resultados en células cultivadas. En los precursores de osteoclastos, en particular, las diferencias en los métodos de estimulación de Notch y el cultivo y diferenciación de precursores de osteoclastos han llevado a un desacuerdo sobre si la señalización de Notch es un regulador positivo o negativo de la diferenciación de osteoclastos. Si bien las comparaciones más cercanas de la diferenciación de osteoclastos en diferentes condiciones de estimulación de Notch in vitro y modelos genéticos han resuelto en gran medida la controversia sobre la señalización de Notch y los osteoclastos, los métodos estandarizados de estimulación continua y temporal de la señalización de Notch en células cultivadas podrían prevenir tales discrepancias en el futuro.

Este protocolo describe dos métodos para estimular la señalización de Notch específicamente en precursores de osteoclastos de ratón cultivados, aunque estos métodos deberían ser aplicables a cualquier tipo de célula adherente con ajustes menores. El primer método produce una estimulación continua de la señalización de Notch e implica la inmovilización del ligando de Notch en una superficie de cultivo de tejidos antes de la siembra de las células. El segundo, que utiliza el ligando Notch unido a perlas de agarosa, permite la estimulación temporal de la señalización de Notch en células que ya están adheridas a una superficie de cultivo. Este protocolo también incluye métodos para detectar la activación de Notch en precursores de osteoclastos, así como marcadores transcripcionales representativos de la activación de la señalización de Notch.

Introducción

La vía de señalización Notch de mamífero es homóloga a la misma vía en Drosophila melanogaster y consta de cuatro receptores transmembrana muesca (Notch1-4) y cinco ligandos unidos a la membrana del Jagged (JAG1 y JAG2) y Delta-como (DLL1, 3, y 4) las familias ^1. La señalización de Notch se inicia cuando el receptor Notch en una célula receptora está obligado por ligando en una célula de transmisión ^2. Durante este trans-activación, el ligando Notch unida a la membrana produce una fuerza de estiramiento sobre el receptor Notch unida a la membrana ^{3, 4.} ....

Protocolo

Toda la investigación con animales vertebrados que se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de Pennsylvania Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC).

1. Medios de cultivo Preparación

1. Preparar α-MEM disolviendo medio polvo mínimo esencial (MEM) y 1,9 g de bicarbonato de sodio en 900 ml de _H2O y complementar con 2 mM L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 100 ml calor suero bovino fetal inactivado. Esterilizar el uso de un filtro de 0,22 micras polietersulfona (PES).
2. Preparar macrófagos medio completándolo α-MEM con....

Resultados

El objetivo de este método es que la cultura y estimular la señalización Notch en los precursores de osteoclastos. Cuando está debidamente cultivadas, precursores de osteoclastos exhiben una morfología en forma de huso principalmente alargada con citoplasma lisa (Figura 1A). Se debe tener cuidado para evitar la activación inmunológica de los precursores de osteoclastos. Tras la activación, los precursores extienden y se aplanan con espumosa citoplasma (Figura 1B).......

Discusión

Los pasos críticos en el protocolo

Cultura y en la diferenciación in vitro de los precursores de osteoclastos proporciona una plataforma útil para la investigación de los mecanismos moleculares de la osteoclastogénesis y la identificación de dianas terapéuticas para la regeneración ósea y la conservación de la masa ósea. Cuando el cultivo de precursores de osteoclastos de ratón, el elemento más crítico es el mantenimiento de los precursores en un estado ingenuo. A medida que l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratón recombinante M-CSF	Biolegend	576402	Disponible en varios proveedores, actividad de prueba antes de los experimentos
Ratón recombinante RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Disponible en varios proveedores, actividad de prueba antes de los experimentos
Humano recombinante Jagged1-Fc	R& D Systems	1277-JG-050	Disponible en múltiples proveedores, actividad de prueba antes de los experimentos
Proteínas G perlas de agarosa	InvivoGen	gel-agg-2
Cabra anti-humana IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Medio esencial mínimo en polvo	Sigma-Aldrich	M0894
Reactivo de disociación celular Accutase	ThermoFisher	A1110501	Se utiliza para levantar los precursores de osteoclastos
Fosfatasa ácida, kit de leucocitos (TRAP)	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Se utiliza para teñir osteoclastos diferenciados