Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

Resumen

Describimos aquí un novedoso, robusto y eficiente método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para la expresión, aislamiento y caracterización de complejos de proteínas de células eucariotas. Este protocolo podría utilizarse para la caracterización bioquímica de complejos discretos, así como para la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función.

Resumen

La purificación de activo proteína-proteína y complejos de proteína-ácido nucleico es crucial para la caracterización de las actividades enzimáticas y de novo identificación de nuevas subunidades y modificaciones post-traduccionales. sistemas bacterianos permiten la expresión y purificación de una amplia variedad de polipéptidos individuales y complejos de proteínas. Sin embargo, este sistema no permite la purificación de subunidades de proteínas que contienen modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, la fosforilación y la acetilación), y la identificación de nuevas subunidades reguladoras que sólo están presentes / expresadas en el sistema eucariota. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de una novela, robusto y eficiente método de purificación por afinidad en tándem (TAP) usando estreptomicina y proteínas bandera de etiquetado que facilita la purificación de complejos de proteínas con proteínas de forma transitoria o estable expresado etiquetadas con epítopo de las células eucariotas. Este protocolo se puede aplicar a caracterizar protein funcionalidad compleja, para descubrir las modificaciones posteriores a la traducción en subunidades complejos, e identificar nuevos componentes complejos de regulación mediante espectrometría de masas. En particular, este método TAP se puede aplicar para estudiar complejos de proteínas formadas por componentes eucariotas o patógenos (virales y bacterianas), produciendo de este modo una amplia gama de oportunidades experimentales aguas abajo. Proponemos que los investigadores que trabajan con complejos de proteínas podrían utilizar este enfoque de muchas maneras diferentes.

Introducción

Interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la regulación precisa de los procesos biológicos ^1, y más estudios sobre estos IBP puede informar acerca de su función ^2. Varios enfoques se han ideado para el estudio y caracterización de los IBP, así como para la identificación de novo de nuevos componentes de la proteína de regulación. En 1989, Stanley Fields y sus colegas informaron de la levadura de dos híbridos (Y2H) de ensayo ^3. Este enfoque permite la identificación imparcial y exhaustiva de interactores (presas) para una proteína de interés definida (cebo) en

Protocolo

1. Las células Plating

1. Un día antes de la transfección, la placa de 3,5 x 10 ⁶ células HEK293T en 10 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml de solución madre) por placa de 100 mm. Plate 3 - 5 100 mm platos por experimento / condición para asegurar una recuperación suficiente proteína.
   NOTA: El número de placas tiene que ser determinada para cada experimento / condición, que se basará en los niveles de expresión y la solubilidad del complejo de proteína de interés. Alternativamente, si se necesita la purificación a gra....

Resultados

En este artículo, se demuestra la aplicabilidad del método TAP para el bien caracterizado CycT1-CDK9 compleja (también conocido como P-TEFb quinasa).

Los plásmidos que codifican la ciclina T1-STREP (CycT1: S) y CDK9-FLAG (CDK9: F), o CDK9-STREP (CDK9: S) y Ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabla 1), se transfectaron en células HEK293T . Los controles negativos incluyeron transfecciones con un vector vacío y la CDK9:.......

Discusión

El protocolo descrito aquí para la expresión y el aislamiento de los complejos de proteínas a partir de células eucariotas no se limita a la caracterización bioquímica de tales conjuntos moleculares, pero también puede ser utilizado para la identificación de nuevos interactores y modificaciones posteriores a la traducción que podría regular su función. La utilización de etiquetas de afinidad no se limita a lo que se menciona en este protocolo; pero nuestra experiencia sugiere que el uso de STREP como el primer paso AP m.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH3002.2FS
Suero fetal bovino	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH30071
Penicilina/Estreptomicina	MP Biomedicals	MP091670049
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
Cóctel de inhibidores de proteasa	Roche
STREP-Tactin Superflow	IBA Lifesciences	2-1208-010
STREP-tag Buffer de elución	IBA Lifesciences	2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	F2426
Corning 100 mm × 20 mm estilo plato de cultivo celular poliestireno no pirogénico tratado 20/manga	Corning
Protein Lo-Bind Eppendorf	Eppendorf 022431081
Mezclador de vórtice digital	Fisher Scientific	02-215-370
Estante de espuma de microtubos de 48 orificios	Fisher Scientific	02-215-386
Asador de agitadores Labquake	Termo	415110