Aquí, presentamos los protocolos que se han utilizado con éxito para delfín espermatozoides recolección, criopreservación y rendimiento de fecundación in vitro heteróloga utilizando ovocitos bovinos.
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Artículo de método
Tonina Delfín (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolección, criopreservación y fecundación In Vitro heteróloga
En este artículo
Resumen
Resumen
El uso de espermatozoides criopreservados delfín facilita el intercambio de material genético entre parques acuáticos y hace accesible a los laboratorios de estudios para mejorar nuestra comprensión de la reproducción de mamíferos marinos espermatozoides. Fecundación in vitro heteróloga, un reemplazo para la FIV homóloga, podría proporcionar un medio para probar la fertilidad de esperma potencial; para estudiar la fisiología de gametos y desarrollo temprano del embrión; y evitar el uso de ovocitos de valioso delfín, que son difíciles de obtener. Aquí, presentamos los protocolos que se han utilizado con éxito para recoger y criopreservar espermatozoides de delfín. La colección de semen se realiza por estimulación manual de delfines entrenados. Criopreservación se logra utilizando un extensor TRIS base de yema de huevo con el glicerol. Además, presentamos un protocolo que describe FIV heteróloga utilizando delfines espermatozoides y ovocitos bovinos y que verifica la naturaleza híbrida del embrión resultante mediante PCR. Fecundación heteróloga plantea preguntas sobre fertilización y puede utilizarse como una herramienta para estudiar la fisiología de gametos y desarrollo temprano del embrión. Además, el éxito de la FIV heteróloga demuestra el potencial de esta técnica para probar la capacidad, lo que vale la pena la examinación adicional de la fertilización de espermatozoides delfín.
Introducción
Tecnologías de reproducción asistida están poco desarrollados en los animales salvajes, incluyendo los mamíferos marinos. La falta de métodos sensibles para evaluar éxito fecundante de espermatozoides contribuye al lento desarrollo de tecnologías reproductivas en especies como los delfines. No fue hasta recientemente que los parámetros seminales básicos del delfín mular (Tursiops truncatus) fueron reportados1,2. Sin embargo, las variables tales como la motilidad y morfología, aunque ampliamente utilizado, dan información limitada sobre la eficiencia reproductiva. El mejor indicador de la calidad del e....
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Protocolo
declaración de ética: todos los procedimientos experimentales fueron revisados y aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, aprobado por la sociedad para el estudio de la reproducción y a la ley de Bienestar Animal para el cuidado de mamíferos marinos.
1. Delfín colección de semen y criopreservación
- preparación
- FERT hacer medio (heparina e hipotaurina-libre). Preparar el medio TALP FERT suplemen....
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Resultados
Los resultados, tablas y figuras (1 y 2) presentadas fueron reproducidas con permiso3.
Espermatozoides de delfines tienen alta motilidad después de la congelación y descongelación
Los eyaculados de delfín congelado porcentajes (% ± SD) de 84,5 ± 5.3 total motile y 69,1 ± 5.1 espermatozoides móviles progresivos. En términos de movilidad, estos númer.......
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Discusión
Para muchas especies mamíferas diferentes, hay diversas ventajas al uso de semen congelado. Estos incluyen la capacidad de transferir material genético valioso, el potencial de distribución en todo el mundo, el bajo riesgo de contaminación y la capacidad de preservar gametos masculinos durante décadas. El uso de espermatozoides criopreservados es esencial para el delfín mular, porque esta especie está protegida en el Apéndice II de CITES, que limita el transporte y el intercambio de animales entre diferentes parques acuá.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
su trabajo fue financiado por el Ministerio de economía y competitividad (70140-AGL2015-R a D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan y J. F. Pérez-Gutiérrez y la Fundación Séneca de Murcia (Grant 20040/germen/16 a F. García Vázquez)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| FERT-TALP medio | Merck | ||
| TCM-199 | Sigma | M-4530 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 | |
| platos de 4 pocillos | Nunc | 176740 | |
| Gradiente de densidad BoviPure | Nidacon International | BP-100 | |
| Solución de lavado Boviwash | Nidacon International | BW-100 | |
| Cloruro de magnesio | Promega | A35 1H | |
| Agua estéril | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H | |
| Tampón Tris Borato EDTA | Sigma | T4415 | |
| MB agarosa | Biotools | 20.012 | |
| 5X Tampón GoTaq flexi | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A | |
| MB agarosa | Biotools | 20.012 | |
| Polimerasa Taq | Promega | ||
| SafeView NBS | Biologicals Ltd. | M 890 A | |
| Cámara de recuento Makler | Sefi Medical | ||
| Cámara Thoma | Hecht-Assistant | ||
| Medidor de pH MicropH 2000 | Osmómetro Crison Instruments | ||
| Micro osmómetro avanzado 3300 | Norwood | ||
| Sistema de análisis de esperma asistido por ordenador | Projectes y Serveis I+D | ||
| Microscopio estereoscópico MZ 95 | Leica | ||
| Óptica epifluorescente Eclipse Te300 | Nikon | ||
| Software Confocal assistant 4.02 | de análisis Bio-Rad | 3D Microscopía | |
| de barrido láser confocal | Bio-Rad | ||
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Tubos | ||
| Iluminador UV | VWR | ||
| PCR Termociclador Primus 96 Plus | MWG AG Biotech | ||
Referencias
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al.
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Reimpresiones y permisos
