Artículo de método

MitoCeption: Transferencia hermoso humano MSC mitocondrias de las células madre de glioblastoma

DOI:

10.3791/55245

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22 de febrero de 2017

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1Institute for Regenerative Medicine and Biotherapy (IRMB), INSERM U1183, Montpellier University, 2Institute of Neurosciences of Montpellier (INM), INSERM U1051, Montpellier University

En este artículo

Resumen

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Aquí, un protocolo (MitoCeption) se presenta para transferir las mitocondrias, aislado a partir de células madre mesenquimatosas humanas (MSC), a las células madre glioblastoma (GSC), con el objetivo de estudiar sus efectos biológicos sobre el metabolismo y funciones GSC. Un protocolo similar se puede adaptar para transferir mitocondrias entre otros tipos de células.

Resumen

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Las mitocondrias juegan un papel central para el metabolismo celular, la producción de energía y el control de la apoptosis. la función mitocondrial inadecuada ha sido encontrado responsable de muy diversas enfermedades, que van desde patologías neurológicas al cáncer. Curiosamente, las mitocondrias recientemente se ha demostrado para mostrar la capacidad de ser transferido entre los tipos de células, en particular a partir de células madre mesenquimatosas humanas (MSC) a las células cancerosas en condiciones de cocultivo, con metabólicos y funcionales consecuencias para las células mitocondrias receptores, mejorando aún más el interés actual para las propiedades biológicas de estos orgánulos.

La evaluación de los efectos de la mitocondria MSC transferido en las células diana es de primordial importancia para entender el resultado biológico de tales interacciones célula-célula. El protocolo MitoCeption descrito aquí permite la transferencia de las mitocondrias aisladas de antemano a partir de las células del donante a las células diana, usando MSC mitocondriasy células madre de glioblastoma (GSC) como un sistema modelo. Este protocolo se ha utilizado anteriormente para transferir las mitocondrias, aislado de MSCs, a adherente células cancerosas MDA-MB-231. Este protocolo de transferencia de las mitocondrias está adaptado aquí para GSCS que presentan la particularidad específica de crecer como neuroesferas in vitro. La transferencia de las mitocondrias aisladas puede ir seguida de células activadas por fluorescencia (FACS) y la imagen confocal utilizando mitocondrias colorantes vitales. El uso de células donantes y de destino mitocondrias con haplotipos distintos (SNP) también permite la detección de la mitocondria transferidos sobre la base de la concentración de su ADN mitocondrial circular (ADNmt) en las células diana. Una vez que el protocolo ha sido validado con estos criterios, las células que albergan la mitocondria transferidos se pueden analizar adicionalmente para determinar los efectos de las mitocondrias exógenos en las propiedades biológicas, tales como el metabolismo celular, la plasticidad, la proliferación y respuesta al tratamiento.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las mitocondrias son orgánulos que se encuentran en las células eucariotas en los que juegan un papel central en la absorción de nutrientes, así como en la producción de energía y metabolitos. Estos orgánulos contienen ADN mitocondrial circular (mtDNA), 16,6 kb de largo, que codifica las proteínas de los complejos de la cadena de transporte de electrones, tRNAs y rRNAs 1. La funcionalidad de estos orgánulos es crítica para la homeostasis celular y varias patologías se han asociado con disfunción mitocondrias 1, 2, 3. El estado de las mitocondrias, por ejemplo, ha sido relacionado con la inflamación, las enfermedades infecciosas y el cáncer, en este último caso con consecuencias para la metástasis y la resistencia a la terapia de 4, 5, 6, 7.

Las mitocondrias muestran la notable capacidad de las siendo transferido entre las células "diana" "donante" y. Esto conduce a cambios en el metabolismo energético de las células diana, así como en otras modificaciones funcionales, tales como la reparación de tejidos y la resistencia a los agentes quimioterapéuticos, como demostrado recientemente por diferentes laboratorios 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Las células madre mesenquimales humanas (MSCs) muestran esta capacidad de transferencia de las mitocondrias a una amplia variedad de células diana, incluyendo cardiomiocitos, células endoteliales, células epiteliales alveolares pulmonares, células tubulares renales y las células cancerosas, lo que lleva a las modificaciones de las propiedades funcionales de estas células 8,> 9, 10, 12, 17, 18.

Las mitocondrias de cambio aparece ahora como un mecanismo ampliamente utilizado que permite que un número de diferentes tipos de células para comunicarse unos con otros y modificar sus propiedades biológicas. Este intercambio mitocondria puede ocurrir a través de la formación de los nanotubos de efecto túnel (TNT), con la participación de conexina 43 que contienen uniones gap 8 o M-Sec / TNFaip2 y la exocyst complejas 19. Alternativamente, la transferencia de las mitocondrias también ha demostrado ser mediada por arrestina microvesículas proteína que contiene el dominio 1 (mediadas por ARMMs) 20. Curiosamente, la eficacia de la transferencia de las mitocondrias estaba vinculada a la tasa de expresión de la Rho GTPasa 1 miro1 21, un factor clave para explicar las diferencias en las eficacias de transferencia entre las mitocondrias iPSC-MSC y adultos BM-MSC 22.

A pesar de esta gran cantidad de datos relativos a las mitocondrias de cambio de célula a célula, se sabe relativamente poco sobre el metabolismo y la evolución biológica de esta transferencia de las mitocondrias. Por lo tanto, completamente de acuerdo con la configuración de las herramientas apropiadas para evaluar plenamente los efectos biológicos de esta transferencia. A través de los años, varios enfoques técnicos para la transferencia de las mitocondrias de donante a las células aceptoras se han propuesto. Esto incluye la inyección directa de las mitocondrias en oocitos de 23, 24, 25, la fusión celular para generar cíbridos transmitochondrial 26, 27 y, más recientemente, la transferencia de mitocondrias aisladas utilizando fototérmica nanoblades 28.

Nosotros y otros previamente demostrada la capacidad de mitochond aisladoria para ser internalizado por las células vivas, como se observa tanto in vitro como in vivo 29, 30, 31, a través de los mecanismos propuestos para involucrar a macropinocitosis 32. Hemos desarrollado además un método, llamado MitoCeption, para transferir cuantitativamente mitocondrias aisladas (de MSCs) a las células diana, como se ejemplifica con el (adherente) MDA-MB-231 línea celular de cáncer de mama 31. Este protocolo fue adaptado aquí para la transferencia de las mitocondrias aisladas MSC humanos a las células madre de glioblastoma (GSCS).

Glioblastoma son tumores malignos agresivos del cerebro que rápidamente se vuelven resistentes al tratamiento, debido principalmente a las células madre glioblastoma (GSC) presentes dentro del tumor 33. Estos GSCs crecen como neuroesferas en vitro y generan tumores en modelos de xenoinjerto. Las células cancerosas dentro de glioblastoma tienen lacapacidad para hacer conexiones de célula a célula, como se muestra recientemente para células tumorales cerebrales astrocíticos que se interconectan a través de microtubos extendidos, a través del cual las mitocondrias (así como núcleos de calcio y de células) pueden migrar, lo que resulta en las redes de astrocitoma de radioterapia resistente 34. Glioblastoma puede reclutar muchas células diferentes dentro del microambiente del tumor, incluyendo MSCs 35, 36. Nos mostró que las MSC puede realizar conexiones entre células con GSCS en co-cultivo y transferir sus mitocondrias (datos no mostrados), que se espera para modificar las propiedades funcionales de la SGC. El presente protocolo describe cómo la técnica MitoCeption se puede utilizar para transferir las mitocondrias, de antemano aislada de MSC humanas, a GSCs humanos con el propósito de determinar su resultado biológico funcional. El multipotentes y altamente tumorigénico línea Gb4 GSC 37 se utilizó en este estudio.

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Protocolo

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Día 1

1. El etiquetado de la célula madre mesenquimales (MSC) Las mitocondrias (Opcional)

  1. Dos días antes de la preparación mitocondrias, semilla de MSC humanas en una placa de cultivo de 100 mm, en 10 ml aMEM / FBS 10%, a fin de tener 4 x 10 5 MSCs en cultivo en el Día 1.
  2. Enjuagar las MSC con PBS (4 ml) y añadir 4 ml aMEM / FBS al 1% (precalentado a 37 ° C).
  3. Añadir la cantidad requerida de las mitocondrias colorante vital e incubar las células durante 30 min en la incubadora a 37ºC.
  4. Retire la solución de colorante mitocondrias, enjuagar las células dos veces con 4 ml precalentada (37 ° C) aMEM / FBS al 1% y volver a agregar 4 ml aMEM / FBS al 10%. Se incuban las células a 37 ° C.
  5. Cambiar el medio de cultivo (10 ml aMEM / FBS 10%) después de 30 min y, otra vez, 2 horas más tarde.

Día 1

2. El etiquetado de las células de glioblastoma madre (GSC) (Opcional, ver la sección Discusión)

Medio de cultivo celular Composición
medio basal GSC DMEM / F-12 suplementado con
La insulina 20 mg / ml
1x suplemento N2
La glucosa 3 g / L
L-glutamina 2 mM
medio de proliferación SGC Añadir al medio basal:
1x suplemento B27
EGF 10 ng / ml
bFGF 10 ng / ml
Fungine 10 mg / ml
Fungizone 0,25 mg / ml
Heparina 2 mg / ml
La ciprofloxacina 2 mg / ml
Gentamicina 2 mg / ml
medio de proliferación MSC & #945; MEM suplementado con
L-glutamina 2 mM
10% de FBS
bFGF 2 ng / ml

Tabla 1: Medios de cultivo.

  1. Disociar GSCS (línea celular Gb4 32 (10 x 10 6 células) crecido como neuroesferas en poli-HEMA frascos de cultivo celular recubierto (consulte los pasos 3.1 a 3.12).
  2. GSCS de semillas en una placa de 48 pocillos a 10 5 células / pocillo en medio de proliferación GSC (500 l) (ver Tabla 1).
  3. Centrifugar la placa a 270 xg durante 5 minutos a 20 ° C.
  4. Añadir la cantidad requerida de colorante vital de células y se incuba durante 30 min a 37 ° C.
  5. Añadir 500 l de medio basal GSC (Tabla 1) por pocillo de la placa de 48 pocillos.
  6. Centrifugar la placa a 270 xg, a 20 ° C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
  7. Repita los pasos 2.5 a 2.6.
  8. Añadir 500 l de medio basal GSC y se incuba a 37 ° C durante 30 min.
  9. Centrifugar la placa a 270 xg, a 20 ° C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
  10. Añadir 500 l de medio de proliferación GSC por pocillo de la placa de 48 pocillos y se incuban en la incubadora a 37ºC.
    Nota: La cantidad de GSCS indicado (10 x 10 6 células) permite la realización de los diferentes experimentos de dosis-respuesta y los controles de FACS. Una vez que las condiciones experimentales se definen con mayor precisión esta cantidad puede ser mucho menos marcada.

Dia 2

3. La siembra de las células madre de glioblastoma

  1. Recoger las neuroesferas GSC (10 x 10 6 células) por centrifugación a 270 xg durante 5 min, a 20 ° C en un tubo de 50 ml.
  2. Lavar las células con 5 ml de HBSS, y se centrifuga a 270 xg durante 5 min a 20 ° C.
  3. Aspirar el sobrenadante.
  4. resuspender suavemente el sedimento de GSC en 100 l de tripsina-EDTA (0,25%) (por 10 x 10 6 células)
  5. Incubar a 37 ° C durante 3 min.
  6. Añadir 10 l CaCl DNasa 2 (20 mM) y 2 l I (10 mg / ml).
  7. Disociar las neuroesferas pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo (30-50x) con una pipeta P200. Evitar las burbujas. Compruebe bajo el microscopio que todos GSCS se disocian.
  8. Añadir 10 l inhibidor de tripsina (5%) y 10 ml de HBSS.
  9. Centrifugar a 270 xg GSCS durante 7 minutos a 20 ° C.
  10. Eliminar el sobrenadante y añadir 10 ml de medio basal GSC (Tabla 1).
  11. Contar GSCS con una cámara de recuento Thoma y centrifugar las células a 270 xg durante 7 minutos a 20 ° C.
  12. Añadir el volumen adecuado de medio de proliferación GSC (Tabla 1) para llegar a la concentración celular de 10 6 GSCS / ml.
  13. De semillas 10 5 GSCs (100 l de la suspensión de células) por pocillo de una placa de 96 pocillos.
  14. Centrifugar las placas a 270 x g durante 7 minutos a 20 ° C para obtener GSCS en el bottom de pozos.
  15. Incubar la placa de 96 pocillos a 37 ° C hasta que la sección 5.

Dia 2

4. Aislamiento de MSC mitocondrias

  1. Ajuste la temperatura del microtubo de centrifugación a 4 ° C.
  2. Preparar dos tubos de 1,5 ml "A" y "C", que contiene los reactivos para la extracción de las mitocondrias (200 l de reactivo A y 400 l de reactivo C, que contiene tanto los inhibidores de la proteasa libre de EDTA). Preparar otros 2 tubos, etiquetados "MSC" y "Mito". Mantenga todos los tubos en hielo. También hay que preparar los tubos para las diluciones seriadas de las mitocondrias.
  3. Wash MSCs con 10 ml precalentada (37 ° C) PBS.
  4. Wash MSCs con 2 ml de tripsina (sin EDTA) durante 10 segundos y añadir 1 ml de tripsina (sin EDTA). Se incuban las células durante 5-10 minutos a 37 ° C.
  5. Recuperar las MSC mediante la adición de 10 ml aMEM / FBS al 10%, la transferencia a un tubo de 50 ml.
  6. centrifugar las células a 270 xg durante 5 minutos a 20 ° C.
  7. Eliminar el sobrenadante y añadir10 ml aMEM / FBS 10% al sedimento celular.
  8. Contar las MSCs con una cámara de recuento Malassez.
  9. Centrifugar MSCs (4-5 x 10 5) a 270 xg durante 5 min a 20 ° C.
  10. Descartar el sobrenadante, añadir 1 m enfriado en hielo aMEM / FBS 10% al sedimento celular y la transferencia de las células al tubo marcado con "MSC" (preparado en el paso 4.2). Mantenga el tubo en hielo.
  11. Centrifugar el tubo que contiene las MSCs en 900 xg durante 5 min, a 4 ° C.
  12. Eliminar todo el medio residual del tubo.
  13. Añadir 200 l de mitocondrias Aislamiento Reactivo A (que contiene los inhibidores de la proteasa libre de EDTA). Vortex a velocidad media durante 5 seg y dejar los tubos en hielo durante exactamente 2 min.
  14. Añadir 2,5 l de mitocondrias Aislamiento Reactivo B. Vortex a velocidad máxima durante 10 segundos, y luego se van tubos en hielo. Repetir cada 30 s durante 5 min.
  15. Añadir 200 l de mitocondrias Aislamiento Reactivo C (que contiene los inhibidores de proteasa libre de EDTA). Mezclar por la inclinación del tubo (roughly 30 veces, no vórtice). Centrifugar el tubo a 700 xg durante 10 min a 4 ° C.
  16. Transferir el sobrenadante (que contiene la mitocondria MSC) al tubo "Mito" (preparado en el paso 4.2).
  17. Centrifugar a 3000 xg, 15 min a 4 ° C, para obtener el pellet mitocondrias. Descartar el sobrenadante. El sedimento contiene las mitocondrias aisladas.
  18. Enjuague el pellet mitocondrias con 200 l de reactivo C. A continuación, se centrifuga a 12.000 xg, 5 min a 4 ° C, para obtener el pellet mitocondrias.

5. Transferencia de mitocondrias aisladas MSC a GSCS (MitoCeption)

  1. Añadir 200 l de la (0 ° C) medio pre-enfriado GSC proliferación al sedimento de mitocondrias aisladas de MSCs (4 x 10 5).
  2. Se diluye la preparación de las mitocondrias (en medio de proliferación SGC) para añadir consistentemente 20 l de suspensión mitocondrial de los GSCS.
  3. Añadir el volumen de mitocondrias aisladas en los pocillos de la 96-wplaca ell que contiene los GSCs (de la etapa 3.15), a la concentración deseada (de 0,1 a 10 mg). Añadir la mitocondria lentamente, cerca de la parte inferior del pozo, que cubre toda la superficie al menos una vez.
  4. Para el control de MSC mitocondrias fuga de colorante vital, añadir la misma cantidad de la preparación mitocondrias (0,1 a 10 mg) a los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenía GSC medio de proliferación solamente (sin GSCS) (véase la parte 6.2 para la detección de fugas de colorante vital).
  5. Centrifugar la placa de 96 pocillos que contiene las mitocondrias GSCs receptores con la mitocondria MSC (etapa 5.3) y la placa de control (paso 5.4) a 1.500 xg durante 15 min a 4 ° C.
  6. Colocar las placas de cultivo en el 37 ° C incubadora de células inmediatamente después de la centrifugación.
    Nota: El protocolo de transferencia de las mitocondrias se basa en la centrifugación de la suspensión mitocondrias en las células cultivadas en la fuerza de centrifugación adecuada, con una serie de centrifugaciones que se puede ajustar en función de la System células de donante / receptor mitocondrias.

Día 3

6. Análisis de la transferencia de mitocondrias por FACS y Confocal Imaging

  1. Preparación de muestras para análisis FACS GSC
    Nota: Si las mitocondrias MSC se marcaron con un colorante vital de antemano (Sección 1), la eficiencia puede ser monitoreado por FACS, 24 horas después de la transferencia de las mitocondrias.
    1. Centrifugar la placa de 96 pocillos con los GSCs MitoCepted a 270 xg durante 5 min a 20 ° C.
    2. Descartar el sobrenadante.
    3. Añadir 100 l de tripsina (sin EDTA) en cada pocillo. Incubar a 37 ° C durante 3 min. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para disociar las neuroesferas formadas en el periodo de tiempo de 24 horas.
    4. Añadir 100 l de medio basal SGC.
    5. Centrifugar la placa a 270 xg durante 5 min a 20 ° C y descartar el sobrenadante.
    6. Resuspender GSCS en 300 l GSC medio basal y la transferencia de FACS adaptado tubos.
    7. Realice la una FACSANÁLISIS.
  2. El control de fugas mitocondrias colorante vital de las mitocondrias aisladas (FACS)
    Nota: El propósito de este paso es determinar la señal de FACS de fondo que no reflejaría una verdadera transferencia MSC mitocondrias sino, más bien, la mera fuga de colorante vital de la mitocondria MSC marcado utilizado para MitoCeption (paso 5.3).
    1. Sembrar las células GSC como se describe en los pasos 3.1 a 3.15.
    2. Se incuban las células a 37 ° C durante 1 hr.
    3. Centrifugar la placa de 96 pocillos que contiene mitocondrias solamente (de la etapa 5.4 a 5.6) a 1500 xg durante 5 min a 20 ° C.
    4. Aspirar el medio de cultivo de la placa de 96 pocillos GSC (paso 6.2.2) y sustituirlo por el medio incubado con mitocondrias solamente (sobrenadante del paso 6.2.3).
    5. Incubar la placa de 96 pocillos que contiene los GSCs a 37 ° C durante 2 hr.
    6. Proceder como en los pasos 6.1.1 a 6.1.7 para el análisis FACS.
  3. Preparación de GSC samples de imagen confocal
    Nota: Si la transferencia de MSC mitocondrias para GSCS va a ser analizada por imágenes de fluorescencia, ambos MSC y GSCS necesitan ser etiquetados con anterioridad, respectivamente, con las mitocondrias (paso 1) y celular (paso 2) colorantes vitales.
    1. Preparar GSCS como en los pasos 6.1.1 a 6.1.5.
    2. Volver a suspender en 2 ml GSCS GSC medio de proliferación que contenía FBS al 2% y las semillas en placas de cultivo de 35 mm (fondo de cristal).
    3. Realizar imagen confocal en las GSCS con las mitocondrias fluorescentes MSC transferidos 24 horas más tarde.

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Resultados

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Los pasos de procedimiento que describen el aislamiento de las mitocondrias de las células madre mesenquimales (MSC) y su transferencia a las células madre glioblastoma dirigidos (GSC) por MitoCeption se muestran en la Figura 1. GSCS son las células madre cancerosas cultivadas como neuroesferas para preservar sus propiedades de células madre. Para el protocolo, GSCS se siembran como células individuales de un par de horas antes de la transferencia de las mitocondrias (pa...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un creciente número de estudios muestran que las células pueden intercambiar las mitocondrias y que estas mitocondrias tener profundos efectos en el metabolismo y las funciones de la célula diana. Por lo tanto, es esencial para dominar las herramientas para transferir cuantitativamente la mitocondria de las células del donante a estas células diana para permitir un estudio preciso de sus efectos biológicos.

El protocolo descrito aquí fue originalmente funcionó para transferir las mitocondria...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), con el que CJ y ML.V. están afiliados, ha presentado una solicitud de patente de la técnica MitoCeption (EP14306154.7).

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Andrea Parmeggiani (L2C y DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), así como los miembros del laboratorio útil para los debates, Christophe Duperray para ayudar con el análisis FACS, la instalación de imágenes RIO Montpellier (MRI) para proporcionar el medio ambiente adecuado para FACS y microscopía confocal. BNM fue apoyado por una beca de postgrado de la LABEX Numev (convención ANR-10-LabX-20). AB fue apoyado por una beca de estudiante de la Universidad de Varsovia y la Unión Europea (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV es un miembro del personal científico del Centro Nacional de Investigación Científica (CNRS).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de aislamiento de mitocondrias para tejidos Fisher Scientific 
Suplemento N-2 (100x)Fisher Scientific11520536
B-27 Suplemento SIN VIT A (50x)Fisher Scientific 
HBSS sin Ca2+ sin Mg2+  SigmaH4385
poly Heme Sigma P3932
aMEM sin glutaminaOzymeBE12-169F
DMEM/F-12 sin glutaminaFisher Scientific 
L-Glutamina Invitrogen 25030-024 y nbsp;
Glucosa Sigma G7021
Insulina Sigma I 1882 
Humano  bFGF R& D Systems233-FB-025
EGF Peprotech AF-100-15 
HeparinaSigmaH3149 
CaCl2MERCK2382
Inhibidor de tripsinaSigma T9003
DNasa ISIGMA 
Tripsina 0,25% / EDTA 1  mMInvitrogen 
TripsinaGibco 15090-046
Inhibidores de la proteasa sin EDTASigma4693159001
Ciprofloxacina Sigma17850-5G-F
Fungine Invivogenant-fn-1
Fungizone Thermofisher15290018
GentamicinaEuromedexEU0410
MitoTracker Verde FMSondas MolecularesM7514
MitoTracker Red CMXRosSondasMoleculares  M7512
MitoTracker Deep RedFM Sondas moleculares  M22426 
CellTracker Verde CMFDASondas MolecularesC7025
CellTracker Azul CMF2HCSondas MolecularesC12881
RIPASanta Cruzsc-24948
FluoroDish Plato de cultivo estérilWorld Precision InstrumentsFD35-100
HemacitómetroFisher Scientific267110
Tubos FACSBeckman Coulter2.523.749
Aparato FACSGallios   3L 10C
LC INICIO RÁPIDO DNA MASTER PLUS  Roche3515885001
1057966311500446115405661010415900125200056

Referencias

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