Sublimación de DAN Matriz para la detección y visualización de gangliósidos en el tejido cerebral de la rata por MALDI Imaging Espectrometría de Masas

Resumen

Se presenta un protocolo para la sublimación de la matriz DAN en tejido cerebral de rata para la detección de gangliósidos utilizando la espectrometría de masas de imágenes MALDI.

Resumen

Preparación de la muestra es la clave para la detección y visualización de analitos en experimentos de láser asistida por matriz de desorción / ionización (MALDI) Imaging Espectrometría de Masas (IMS) óptima. Determinar el protocolo apropiado para seguir todo el proceso de preparación de la muestra puede ser difícil, ya que cada paso debe ser optimizada para cumplir con las características únicas de los analitos de interés. Este proceso no sólo consiste en encontrar una matriz compatible que puede desorber e ionizar las moléculas de interés de manera eficiente, sino también la selección de la técnica de deposición de matriz apropiada. Por ejemplo, una técnica de deposición de matriz húmeda, lo que implica la disolución de una matriz en un disolvente, es superior para la desorción de la mayoría de proteínas y péptidos, mientras que las técnicas de deposición de matriz seca son particularmente eficaces para la ionización de los lípidos. Sublimación ha sido reportado como un método altamente eficaz de la deposición de matriz seca para la detección de lípidos en el tejido por MALDI IMS debido a la homogeneity de la deposición de cristales de la matriz y la deslocalización mínimo analito en comparación con muchos métodos de deposición húmeda ^{1, 2.} En términos generales, se trata de la colocación de una muestra y de la matriz en polvo en una cámara sellada al vacío con las muestras prensadas contra una superficie fría. El aparato es bajado a continuación en un baño calentado (arena o aceite), lo que resulta en la sublimación de la matriz en polvo sobre la superficie de muestra de tejido enfriado. Aquí se describe un protocolo de sublimación usando 1,5-diamino-naftaleno matriz (DAN) para la detección y visualización de los gangliósidos en el cerebro de rata utilizando MALDI IMS.

Introducción

Asistida por matriz de desorción láser / ionización (MALDI) Imaging Espectrometría de Masas (IMS) se está convirtiendo en un codiciado técnica para la visualización de la distribución espacial de los lípidos, péptidos y proteínas a través de superficies de muestras intactas. MALDI IMS era conocido previamente como una técnica analítica para analitos pre-purificado, pero en los últimos años, se ha llamado la atención en muchas otras disciplinas debido a la capacidad de combinar la exactitud de la espectrometría de masas con puntos de referencia de alta resolución visuales / anatómicas sin la necesitará para cualquier etiquetado externo. Como la piscina científica de l....

Protocolo

Todos los procedimientos de manejo de animales describen a continuación se adhieren a la Universidad de Cuidado de Animales de Ontario Occidental (2016-014).

1. Preparación del tejido y Seccionamiento

1. Extraer el tejido cerebral de la rata a través de un proceso conocido como "fresco congelado Extraction" (FFE).
   1. La eutanasia a las ratas con una sobredosis de pentobarbital sódico y controlar los reflejos en las extremidades. Una vez que todos los reflejos han cesado, cortar la cabeza de la rata utilizando una guillotina.
   2. Con cuidado, separar los músculos y otros tejidos del cráneo utilizando un bisturí. El uso ....

Resultados

Al finalizar el experimento sublimación, las dos mitades del aparato de vidrio se separan en la campana de humos y la corredera, pegado en el condensador, se pueden eliminar (Figura 3A). En este punto, la corredera debe ser examinado para la distribución desigual de la matriz y el tiempo, la temperatura o la colocación del aparato en el baño de arena puede tener que ser ajustado para la siguiente diapositiva. Un exitoso experimento sublimación DAN resultará en una capa u.......

Discusión

Este trabajo detalla un protocolo estandarizado de la sublimación de la matriz en el tejido para la detección de lípidos cargados negativamente, tales como gangliósidos, en los experimentos de MALDI IMS. Preparación de muestras para MALDI IMS es muy variable y debe ser personalizado para adaptarse a las propiedades únicas de analito de interés. La aplicación de la matriz sobre la superficie de la muestra de tejido es un aspecto crucial del proceso de preparación de la muestra con respecto a la calidad de los resultados .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sublimador	Chemglass Life Sciences	CG3038-01
matriz de 1,5-diaminonafthalene (DAN)	Sigma-Aldrich	D21200	100 g
Cryostat	Thermo-Fisher Scientific		CryoStar NX50
con retroalimentación	de temperatura Thermo-Fisher Scientific	HP88857290	Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V
Gato de acero inoxidable	Thermo-Fisher Scientific		2216479 10x10
Trampa			Hecho a medida en el sitio
Bomba de vacío	Franklin Electric	1102180403	Savant VP100
Correderas de óxido de indio y estaño (ITO)	Hudson Surface Technology	PSI 1111000	tipo II, 1,1 mm/25 cada una
MALDI TOF/TOF 5800 Instrument	AB Sciex
Desecador	Sigma-Aldrich	D2797	de sobremesa