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Artículo de método

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

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DOI:

10.3791/55255

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24 de mayo de 2017

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1Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR, 2Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR

En este artículo

Resumen

Aquí, se detalla el método de S de equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido H ybrids (SPLASH), que permite el genoma de la cartografía de todo el intramolecular y intermolecular RNA-ARN interacciones in vivo . SPLASH puede ser aplicado para estudiar interactones de ARN de organismos incluyendo levaduras, bacterias y seres humanos.

Resumen

Saber cómo interactúan los ARN con ellos mismos y con otros es clave para entender la regulación de genes basada en ARN en la célula. Aunque se ha demostrado que los ejemplos de interacciones ARN-ARN, tales como las interacciones ARNm-ARNm, regulan la expresión génica, se desconoce hasta qué punto se producen las interacciones ARN en la célula. Los métodos anteriores para estudiar las interacciones de ARN se han centrado principalmente en subconjuntos de ARN que están interactuando con una proteína particular o especies de ARN. Aquí, detallamos un método llamado S de equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido H ybrids (SPLASH) que permite a todo el genoma de captura de ARN interacciones in vivo de manera imparcial. SPLASH utiliza reticulación in vivo , ligación de proximidad y secuenciación de alto rendimiento para identificar socios de unión de bases de ARN intramoleculares e intermoleculares a nivel mundial. SPLASH puede aplicarse a diferentes organismos, incluyendo bacterias, levaduras y células humanas,S diversas condiciones celulares para facilitar la comprensión de la dinámica de la organización del ARN en diversos contextos celulares. Todo el protocolo SPLASH experimental tarda aproximadamente 5 días en completarse y el flujo de trabajo computacional tarda aproximadamente 7 días en completarse.

Introducción

Estudiar cómo las macromoléculas se pliegan e interactúan entre sí es la clave para entender la regulación genética en la célula. Aunque se ha centrado mucho esfuerzo en la última década en la comprensión de cómo el ADN y las proteínas contribuyen a la regulación de genes, se sabe relativamente menos sobre la regulación post-transcripcional de la expresión génica. El ARN lleva información tanto en su secuencia lineal como en su estructura secundaria y terciaria 1 . Su capacidad de base de pares con sí mismo y con otros es importante para su función in vivo . Los recientes avances en el sondaje de la estructura secundaria de ARN de alto rendimiento han proporcionado información valiosa sobre las ubicaciones de las regiones de doble y única hebra en el transcriptoma 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer información sobre los compañeros de interacción de emparejamiento sigue siendo en gran parte falta. Para determinar qué secuencia de ARN está interactuando con otra región de ARN en el transcriptoma, necesitamos información global de pares.

Mapear las interacciones de ARN en pares de una manera global e imparcial ha sido tradicionalmente un desafío importante. Mientras que los enfoques anteriores, tales como CLASH 9 , hiCLIP 10 y RAP 11 , se utilizan para identificar las interacciones de ARN a gran escala, estas técnicas típicamente mapa de ARN base de emparejamiento de un subconjunto de ARN que interactúan con una proteína particular o especies de ARN. Los desarrollos recientes en el estudio de las interacciones globales de ARN incluyen el método RPL 12 , que no estabiliza las interacciones de ARN in vivo y, por tanto, sólo puede capturar un subconjunto de interacciones in vivo . Para superar estos desafíos, nosotros y otros desarrollamos estrategias genéticamenteP ARN interactomas in vivo , utilizando versiones modificadas del reticulador psoraleno 13 , 14 , 15 . En este protocolo, se describen los detalles para realizar S equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido Hybridos (SPLASH), que utiliza biotinylated psoraleno a la cruz de enlace de base RNAs in vivo , seguido por la ligación de proximidad y de alto rendimiento de secuenciación a Identificar ARN base de apareamiento asociados genoma en todo ( Figura 1 ] [ 15] .

En este manuscrito, describimos los pasos para realizar SPLASH utilizando cultivos de células adherentes, en este caso las células HeLa. El mismo protocolo puede adaptarse fácilmente a las células de mamífero en suspensión ya las células de levadura y bacterias. En resumen, las células HeLa se tratan con psoraleno biotinilado y se irradian a 365 nm para reticular los pares de bases de ARN que interactúan in vivo. A continuación, los ARN se extraen de las células, se fragmentan y se enriquecen para reticular regiones usando esferas de estreptavidina. Los fragmentos de ARN que interactúan se ligan entonces juntos usando ligación de proximidad y se convierten en una biblioteca de cDNA para secuenciación profunda. Tras la secuenciación, los ARN quiméricos se asignan en el transcriptoma / genoma para identificar las regiones que interactúan con ARN que están emparejadas entre sí. Hemos utilizado exitosamente SPLASH para identificar miles de interacciones de ARN in vivo en levaduras y diferentes células humanas, incluyendo el emparejamiento de ARN intramolecular e intermolecular en diversas clases de ARNs, tales como snoRNAs, lncRNAs y mRNAs, para vislumbrar la organización estructural y los patrones de interacción De ARN en la célula.

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Protocolo

1. Tratamiento de las células HeLa con Bioralina y Extracción de ARN Biotiniladas

  1. Cultivo de células HeLa en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina estreptomicina (PS) en una placa de 10 cm.
  2. Lavar las células HeLa dos veces con 5 mL de 1x PBS. Escurra el exceso de PBS completamente del plato colocando el plato verticalmente durante 1 minuto.
  3. Añadir 1 ml de PBS que contiene 200 μM de psoraleno biotinilado y 0,01% p / v de digitonina, a las células uniformemente e incubar a 37 ° C durante 5 min. Mientras que el psoraleno biotinilado puede entrar en la célula, su permeabilidad es mucho mayor cuando las células se exponen a bajas cantidades de digitonina (0,01%) durante 5 min
  4. Retire la tapa de la placa de 10 cm que contiene las células HeLa tratadas y coloque el plato sobre hielo. Irradiar el plato que contiene las células con 365 nm UV durante 20 minutos en hielo, a una distancia de 3 cm de los bulbos UV, utilizando el reticulador UV.
  5. AislarOtal de células HeLa por extracción de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo siguiendo el protocolo del fabricante. Añadir volumen 1: 1 de isopropanol para precipitar el ARN a temperatura ambiente durante 30 min.
    Pause Point: El ARN se puede almacenar a -20 ° C en isopropanol indefinidamente. Se puede realizar una transferencia de puntos en este paso para comprobar que el psoraleno biotinilado ha entrado con éxito en las células y tiene ARN reticulados in vivo ( Figura 2 ).
  6. Centrifugar el ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C para recuperar el ARN. Se retira el sobrenadante y se añade 1 mL de etanol frío al 70% al sedimento de RNA para lavar el ARN.
  7. Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Se retira el sobrenadante y se seca al aire el gránulo durante 5 min a temperatura ambiente.
  8. Añadir nuclease de agua libre a la pastilla de ARN y cuantificar la concentración de ARN utilizando un espectrómetro UV.
    Pause Point: El ARN se puede almacenar a -80 ° C después de fCongelación de las pestañas en nitrógeno líquido.

2. Fragmentación del ARN

  1. Precaliente 15 μL de tampón de fragmentación de ARN 2x y 10 μL de la muestra de ARN (1 μg / μl) individualmente en tubos de PCR de 0,2 ml, a 95 ° C durante 1 min. Mezclar 10 μL del tampón de fragmentación de ARN 2x calentado con 10 μl de muestra de ARN pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar la muestra a 95 ° C durante 5 min. Detener la reacción por enfriamiento rápido de la reacción sobre hielo.
  2. Transferir y mezclar las 2 reacciones de fragmentación a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 40 μl de agua libre de nucleasa a la reacción, 10 μl de acetato de sodio 3 M, 1 μl de glucógeno y 300 μl de etanol al 100% a la reacción de fragmentación. Incubar el ARN a -20 ° C durante al menos 1 h para precipitar el ARN.
  3. Centrifugar el ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 min, eliminar el sobrenadante y lavar el ARN usando 1 mL de etanol al 70%.
  4. Centrifugar el ARN a 20.000 xg durante 15 min, remEl sobrenadante y disolver el ARN en 20 μl de agua libre de nucleasa.

3. Selección y elución del tamaño del ARN

  1. Añadir 20 μL de colorante de carga de ARN al ARN recuperado en el tubo de microcentrífuga. Calentar el ARN con el colorante de carga de ARN a 95 ° C durante 3 min y colocarlo en hielo durante 2 min.
  2. Añadir 3 μl de colorante de carga de ARN a 0,25 μL de escala de ADN de 10 nt en un tubo de microcentrífuga. Calentar la escalera a 95 ° C durante 3 min y colocarlo en hielo durante 2 min.
  3. Cargar la escala desnaturalizada y las muestras en un gel de urea TBE 8,6 cm x 6,8 cm 6% y fraccionar el tamaño por electroforesis durante 40 min a 180 V. Manchar el gel en 10 ml de tampón TBE que contiene 1: 10.000 de mancha de gel de ácido nucleico durante 5 Min en la oscuridad.
  4. Perfore un tubo de microcentrífuga limpio de 0,6 ml en la parte inferior usando una aguja de 24 G y colóquelo en un tubo de microflujo de 2 ml.
  5. Visualizar las bandas en el gel post-teñido usando un transiluminador y cortar una rebanada de gel correspondiente a 90-110 nt. Transfiera la rebanada de gel en el tubo de microcentrífuga perforado de 0,6 ml en el tubo de microcentrífuga de 2 ml. Esta selección de tamaños se realiza para permitir que los fragmentos quiméricos tengan una longitud mínima para mapear al transcriptoma y para distinguir entre productos ligados de proximidad frente a productos no ligados en etapas de selección de tamaño aguas abajo.
  6. Centrifugar las rebanadas de gel a 12.000 xg a temperatura ambiente durante 2 minutos para desmenuzar la rebanada de gel y recogerla en el tubo de microcentrífuga de 2 ml. Deseche el tubo de microcentrífuga vacío de 0,6 ml. Añadir 700 μl de tampón de elución a la rebanada de gel triturada en el tubo de microcentrífuga de 2 ml e incubar a 4 ° C durante la noche con rotación constante, para permitir la difusión de las muestras en el tampón.
  7. Transferir las rebanadas de gel y el tampón de elución a un filtro de tubo de centrifugación y centrifugar a 20.000 xg durante 2 min. Las rebanadas de gel quedarán atrapadas en el compartimiento superior del filtro. Deseche las rebanadas de gel y el compartimento superior.
  8. Añadir 1 μl de glucógeno y 700 mu l de isopropanol al 100% al filtrado en el tubo de microcentrífuga y precipitar el ARN a -20ºC durante al menos 1 h o durante la noche.
    Punto de Pausa: El ARN puede precipitarse en isopropanol indefinidamente a -20 ° C.
  9. Centrifugar el ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C para recuperar el ARN. Se retira el sobrenadante y se añade 1 ml de etanol frío al 70% para lavar el sedimento de ARN. Centrifugar el sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C.
  10. Retire el tampón de lavado y añada 20 μl de agua libre de nucleasa para resuspender el ARN. Cuantificar la concentración de ARN utilizando un espectrómetro UV.
    Pause Point: El ARN se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación rápida en nitrógeno líquido.

4. Enriquecimiento de regiones de reticulación de ARN

  1. Vortex streptavidina revestimiento de perlas magnéticas vigorosamente para resuspender las perlas de forma homogénea en el tubo. Transferir 100 μl de perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y colocarlo sobre un imánDurante 1 minuto para permitir que las perlas se peguen al lado magnético del tubo. Retire cuidadosamente el tampón de almacenamiento de las perlas y saque el tubo del soporte del imán.
  2. Añadir 1 ml de tampón de lisis a las perlas en el tubo de microcentrífuga y pipetear hacia arriba y hacia abajo. Coloque la microcentrífuga que contiene perlas en el soporte magnético durante 1 min para separar las perlas del tampón de lavado. Repita esto para un total de 3 lavados.
  3. Retire el tampón de lavado de las perlas colocando la microcentrífuga que contiene perlas en el soporte magnético durante 1 minuto. Añadir el inhibidor de RNasa (1: 200) al tampón de lisis y añadir 100 μl de tampón de lisis a las perlas lavadas en el tubo de microcentrífuga.
  4. Añadir 2 ml de tampón de hibridación recién preparado, 1 ml de tampón de lisis suplementado, 1,5 μg de ARN fraccionado de tamaño y 100 μl de perlas resuspendidas a un tubo de centrifugación cónico de 15 ml. Vórtice el tubo suavemente.
  5. Incubar el tubo cónico de centrifugación de 15 mL a 37 ° C durante 30 min con rotación de extremo a extremo.Precalentar el tampón de lavado a 37 ° C.
  6. Coloque los tubos cónicos de centrifugación de 15 mL en un soporte magnético para tubos de 15 mL durante 2 min para separar las perlas del tampón. Pipetear cuidadosamente el tampón del tubo y desecharlo.
  7. Añadir 1 ml de tampón de lavado precalentado a las perlas, pipetear hacia arriba y hacia abajo y transferir las perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar en las perlas a 37 ° C durante 5 min, con rotación de extremo a extremo.
  8. Centrifugar brevemente el contenido del tubo de microcentrífuga. Colocar las perlas lavadas de 1,5 ml en tubos de microcentrífuga sobre un soporte magnético para tubos de 2 ml durante 1 min, para separar las perlas del tampón de lavado. Retire el tampón de las perlas pipeteando suavemente el tampón fuera del tubo de microcentrífuga.
  9. Añadir 1 ml de tampón de lavado precalentado a las perlas y pipetear hacia arriba y hacia abajo para repetir el lavado. Realizar un total de 5 lavados. Al final del 5º lavado, retire el tampón de lavado colocando la microfuga que contiene perlas en el soporte del imán para1 minuto.

5. Ligadura de Proximidad

  1. Añadir 1 ml de tampón de polinucleótido quinasa T4 (PNK) frío a las perlas lavadas e incubar las perlas durante 5 min a 4ºC, con rotación de extremo a extremo. Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene las perlas en la banda magnética durante 1 min y retire suavemente el tampón T4 PNK. Repita este paso para un total de 2 lavados y retire el tampón T4 PNK después del último lavado.
  2. Añadir tampones a las cuentas, de acuerdo con la Tabla 1 . Para permitir que los extremos 3 'del fragmento de ARN se liguen a los adaptadores 3' a continuación, incubar las perlas en el tampón a 37 ° C durante 4 h con agitación constante para convertir el grupo fosfato cíclico 3 'al final del ARN a 3 'OH.
  3. Añadir tampones a la reacción anterior, de acuerdo con la Tabla 2 . Para permitir que el extremo 5 'de los fragmentos de ARN sea capaz de ligar, incubar la reacción a 37ºC durante 1 h con agitación constante en presencia de ATP, Para convertir 5 'OH en el ARN a 5' fosfato.
  4. Añadir tampón a la reacción anterior para realizar la ligación de proximidad, de acuerdo con la Tabla 3 . Incubar la reacción a 16 ° C durante 16 h, con agitación constante,
  5. Colocar la microcentrífuga que contiene el ARN ligado en un soporte magnético durante 1 minuto. Retire cuidadosamente el sobrenadante y agregue 1 ml de tampón de lavado a temperatura ambiente a las perlas. Resuspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  6. Coloque el tubo de microcentrífuga sobre el soporte del imán durante 1 minuto y retire cuidadosamente el tampón de lavado. Realice un total de 2 lavados y retire el tampón de lavado de las perlas al final del segundo lavado.
  7. Añadir 100 μl de RNA PK Buffer a las perlas y resuspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Calentar las muestras a 95 ° C durante 10 minutos en un bloque de calor.
  8. Se enfría la muestra en hielo durante 1 min y se añaden 500 μl de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo a la muestra. Mezclar vorticialmente vigorosamente durante 10 s. Incubar la mezclaA temperatura ambiente durante 10 min.
    Punto de Pausa: El ARN se puede almacenar en tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo a -80 ° C durante un par de meses.
  9. Añadir 100 μl de cloroformo a las muestras extraídas de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. Vórtice vigorosamente durante 10 s. Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  10. Transferir 400 μl de la capa acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 800 μl (2 volúmenes) de etanol al 100% y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  11. Transferir la solución de ARN a las columnas de limpieza de ARN y recuperar el ARN siguiendo las instrucciones del fabricante, asegurando que incluso los ARN pequeños se conservan. Eluir el ARN en 100 μl de agua libre de nucleasa.
    Pause Point: El ARN se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación rápida en nitrógeno líquido.

6. Reticulación inversa de Psoralen Biotinilado

  1. Transferir los 100 μl de las muestras eluidas en un pocillo de 24 pocillos plComió Quitar la cubierta e irradiar la muestra a UV 254 nm, durante 5 min en hielo.
  2. Transferir la muestra reticulada inversa a un tubo de microcentrífuga limpio. Añadir 10 μl de acetato de sodio, 1 μl de glucógeno y 300 μL de etanol al 100% y precipitar el ARN a -20 ° C durante al menos 1 h o durante la noche.
    Pause Point: El ARN puede precipitarse indefinidamente en etanol a -20 ° C.
  3. Centrifugar el ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C para recuperar el ARN. Se retira el sobrenadante y se añade 1 ml de etanol frío al 70% para lavar el sedimento de ARN.
  4. Centrifugar el sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C. Se retira el tampón de lavado y se añaden 4,25 μl de agua libre de nucleasa para resuspender el ARN. Transferir el ARN a un tubo PCR de 0,2 ml.
    Pause Point: El ARN se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación rápida en nitrógeno líquido.

7. Transcripción inversa y Circularización de cDNA

  1. Añadir 0,75 μLDel conector de ARN (0,5 mu g / mu L) a la muestra resuspendida en el tubo de PCR y calentar a 80ºC durante 90 s. Colocar la muestra en hielo durante 2 min.
  2. Añadir los tampones a la muestra desnaturalizada para la ligación 3 'adaptador, de acuerdo con la Tabla 4 . Incubar la reacción a 25 ° C durante 2,5 h.
  3. Transferir la reacción a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 90 μl de agua libre de nucleasa a la reacción, seguido de 10 μl de acetato de sodio, 1 μl de glucógeno y 300 μl de etanol al 100%. Precipitar el ARN a -20 ° C durante al menos 1 h o toda la noche.
    Pause Point: El ARN puede precipitarse indefinidamente en etanol a -20 ° C.
  4. Centrifugar el ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C para recuperar el ARN. Se retira el sobrenadante y se añade 1 ml de etanol frío al 70% para lavar el sedimento de ARN.
  5. Centrifugar el sedimento lavado a 20.000 g durante 15 minutos a 4 ° C. Quitar el tampón de lavado resuspender el gránulo en 5 μl de n libre de nucleasaAter
  6. Añadir 5 μL de colorante de carga de ARN al ARN recuperado en el tubo de microcentrífuga. Calentar el ARN con el colorante de carga de ARN a 95 ° C durante 3 min y colocarlo en hielo durante 2 min.
  7. Añadir 3 μl de colorante de carga de ARN a 0,25 μL de escala de ADN de 10 nt en un tubo de microcentrífuga. Calentar la escalera a 95 ° C durante 3 min y colocarlo en hielo durante 2 min.
  8. Realizar el fraccionamiento del tamaño utilizando gel de urea TBE de 8,6 cm x 6,8 cm 6% como en los pasos 3.3 y 3.4.
  9. Visualizar el gel teñido con tinción de ácido nucleico utilizando el transiluminador y cortar una rebanada de gel correspondiente a 110-140 nt en la escalera. Transfiera la rebanada de gel en el tubo de microcentrífuga perforado de 0,6 mL en el tubo de microcentrífuga de 2 mL y siga el protocolo de los pasos 3.6- 3.9.
  10. Añadir 5 μl de agua libre de nucleasa para resuspender el sedimento de ARN. Transferir el ARN a un tubo PCR de 0,2 ml.
    Pause Point: El ARN se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación rápida en nitrógeno líquido.
  11. Añadir 1 μl de cebador RT a 1,2581; M al ARN en el tubo de PCR y el calor a 80 ° C durante 2 min. Colocar la muestra en hielo durante 2 min.
  12. Añadir los tampones para la transcripción inversa de acuerdo con la Tabla 5 . Incubar la reacción a 50 ° C durante 30 min.
  13. Añadir 1,1 μl de NaOH 1 N a la reacción y calentar a 98 ° C durante 20 min. Colocar la reacción sobre hielo.
  14. Transferir la reacción a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 90 μl de agua libre de nucleasa a la reacción, seguido de 10 μl de acetato de sodio, 1 μl de glucógeno y 300 μl de etanol al 100%. Precipitar el ADN a -20 ° C durante al menos 1 h o toda la noche.
    Punto de Pausa: El ADN puede precipitarse en etanol indefinidamente a -20 ° C.
  15. Centrifugar el ADN precipitado a 20.000 g durante 30 minutos a 4 ° C para recuperar el ADN. Se retira el sobrenadante y se añade 1 ml de etanol frío al 70% para lavar el sedimento de ADN. Centrifugar el sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C. Quitar el tampón de lavado resuspender el pelDejar entrar 5 μl de agua libre de nucleasa.
  16. Realizar el fraccionamiento del tamaño utilizando gel de urea TBE de 8,6 cm x 6,8 cm 6% como en los pasos 3.3 y 3.4.
  17. Visualizar el gel post-teñido usando el transiluminador y cortar una rebanada de gel correspondiente a 200-240 nt en la escalera. El ADNc transcripto inverso es ahora 96 ​​bases más largo que el fragmento de ARN debido a la adición del cebador RT de 96 bases. Transfiera la rebanada de gel en el tubo de microcentrífuga perforado de 0,6 ml en el tubo de microcentrífuga de 2 ml.
  18. Centrifugar las rebanadas de gel a 12.000 xg a temperatura ambiente durante 2 minutos para desmenuzar la rebanada de gel y recogerla en el tubo de microcentrífuga de 2 ml. Deseche el tubo de microcentrífuga vacío de 0,6 ml.
  19. Añadir 700 μl de tampón de elución a la rebanada de gel desmenuzado en el tubo de microcentrífuga de 2 ml e incubar a 37 ° C durante 2 h con rotación constante. Siga el protocolo como se describe en los pasos 3.7- 3.8.
  20. Añadir 6 μl de agua libre de nucleasa para resuspender el sedimento de ADN. Transferir el ADN a un tubo PCR de 0,2 ml.
  21. Añadir los tampones a la reacción para la circularización de cDNA, de acuerdo con la Tabla 6 . Incubar la reacción a 60 ° C durante 1 h y calentar a 80 ° C durante 10 min para inactivar la reacción.
  22. Transferir la reacción a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Purificar el cDNA circularizado usando una columna de limpieza de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante. Añadir 20 μL de agua libre de nucleasa a la columna para eluir el cDNA purificado.
    Pause Point: El ADN se puede almacenar a -20 ° C durante un par de meses.

8. Amplificación por PCR (PCR a pequeña escala)

  1. Añadir los tampones a la reacción según la Tabla 7 para la amplificación por PCR para probar el número mínimo de ciclos necesarios para la amplificación de la biblioteca.
  2. Configure las condiciones de ciclo de PCR de acuerdo con la Tabla 8 . Detener la reacción y transferir 5 μl deLa reacción de PCR a 10, 15 y 20 ciclos, en tubos separados de microcentrífuga de 1,5 ml.
  3. Añadir 1 μl de colorante de carga de gel de ADN 6x a cada una de las 5 μL de reacción de PCR en los diferentes ciclos. Realizar electroforesis en gel en un gel de agarosa al 3%, a 120 V, durante 1 h para visualizar los productos de PCR.
    1. Utilice el número más bajo de ciclos de PCR (Y) que muestren una amplificación de alrededor de 250 bases (en la Figura 3 , hay una banda fuerte a 15 ciclos de amplificación y una banda débil a 10 ciclos. Generan suficiente material para la secuenciación profunda ya que la cantidad de cDNA utilizado es 10 veces la de la amplificación por PCR a pequeña escala).

9. Amplificación por PCR (PCR a gran escala) y purificación

  1. Añadir los tampones a la reacción de acuerdo con la Tabla 9 para la amplificación por PCR para PCR a gran escala.
  2. Configurar las condiciones de ciclo de PCR segúnTabla 10 .
  3. Añadir 5 μL de colorante de carga de gel de ADN 6x a los 25 μL de reacción de PCR y cargar en un pocillo de un gel de agarosa al 3%. Cargue 1 kb más la escalera de ADN en un pozo separado. Realizar electroforesis en gel a 100 V, durante 1,5 h.
  4. Visualice el gel completo usando un transiluminador UV.
  5. El tamaño extrae una rebanada de gel que contiene productos de PCR de 200 a 300 bases y transfiera el gel a un tubo de microcentrífuga limpio de 2 ml.
  6. Añadir 1 ml de tampón de solubilidad en gel, de un kit de extracción de gel de ADN, a la rebanada de gel e incubar a temperatura ambiente durante 30 min, o hasta que el gel se disuelva, con agitación constante.
  7. Añadir 200 μl de isopropanol al gel disuelto y mezclar bien por pipeteado. Transferir 700 μL de la muestra a una columna de limpieza de extracción de ADN en gel y centrifugar a 13.000 xg durante 30 s. Mantener la transferencia de la muestra disuelta en la columna hasta que toda la muestra se ha cargado en la columna.
  8. Añadir 500 μl de tampón de solubilidad en gel,Seguido de 700 μl de tampón de lavado de columna, a la columna, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Añadir 12 μl de agua libre de nucleasa al centro de la columna para eludir el ADN. Pause Point: El ADN se puede almacenar a -20 ° C.
  9. Cuantificar la concentración del ADN utilizando la cuantificación fluorométrica. Si se construyen varias bibliotecas y se agrupan juntas para la secuenciación, añada la misma cantidad de cada muestra al conjunto, para una secuenciación de alto rendimiento.

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Resultados

La figura 1 muestra el esquema del flujo de trabajo SPLASH. Tras la adición de psoraleno biotinilado en presencia de 0,01% de digitonina y reticulación UV, se extrae el ARN total de las células y se realiza una transferencia de puntos para asegurar que la reticulación del biotinilado al ARN se ha producido de manera eficiente ( Figura 2 ). Utilizamos oligos biotinilados de 20 bases como controles positivos para titular la cantid...

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Discusión

Aquí, describimos en detalle el flujo de trabajo experimental y computacional para SPLASH, un método que nos permite identificar par-wise RNA interacciones en un genoma de ancho manera. Hemos utilizado exitosamente SPLASH en bacterias, levaduras y cultivos humanos y anticipamos que la estrategia puede ser ampliamente aplicada a diversos organismos bajo diferentes estados celulares. Uno de los pasos críticos en el protocolo es comenzar con al menos 20 μg de ARN reticulado para tener material adecuado para los procesos po...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Wan y al laboratorio de Nagarajan por las discusiones informativas. N.Nagarajan es apoyado por el financiamiento de A * STAR. Y.Wan cuenta con el apoyo financiero de A * STAR y Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

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Materiales


Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 kb Plus Escalera de ADNLife Technologies Holdings Pte Ltd10787026
ADN 10 bp Escalera de ADNLife Technologies Holdings Pte Ltd10821-015 Escalera deADN
20% solución SDSPrimera BASEBUF-2052-1L   
20x SSCFirst BASEBUF-3050-20X1L
3.0 M Solución de acetato de sodioFirst BASEBUF-1151-1L-pH5.2   Necesario para la precipitación de ácidos nucleicos
Solución de acrilamida al 40%/Bis, 19:1Bio-Rad1610145TBE Componente de gel de urea
Kit de tampón AmbionLife Technologies Holdings Pte LtdAM9010
Persulfato de amonio, grado molecular   PromegaV3131 Componente de gel de urea TBE
Azul de bromofenolSigma-AldrichB0126-25G
CloroformoMerck1.02445.1000Extracción
de ARN ADN ligasa monocatenarioEpicentroCL9025KCircLigasa II ssDNA Ligasa
Filtros de tubo de centrífugaSigma-AldrichCLS8160-96EACostar Spin-X Filtros de tubo
D5628-1G DIGITONINA CRISTALINASigma-AldrichD5628-1GPara el tratamiento celular
Transiluminador de lector oscuro Clare Chemical ResearchDark Reader DR89X Transiluminadorluz azul Transiluminador
gel de ADN Tinte de carga (6x)Life Technologies Holdings Pte LtdR0611Requerido para la electroporación de gel
de agarosa Dulbecco's Modified Eagle MediumPan BioTechP04-03500Para el cultivo de células Hela
Perlas magnéticas de estreptavidinaLife Technologies Holdings Pte Ltd65002Dynabeads MyOne Estreptavidina C1 
Soporte magnético para 15  Tubos mLLife Technologies Holdings Pte Ltd12301DDynaMag-15
Soporte magnético para 15  Tubos mLLife Technologies Holdings Pte Ltd12321DDynaMag-2
ThermoMixerEppendorf5382 000.015Eppendorf ThermoMixer  C
Psoraleno biotiniladoLife Technologies Holdings Pte Ltd29986EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotina
F8T5/BL HitachiF8T5/BL Bombilla UV de 365 nm
Suero fetal bovinoLife Technologies Holdings Pte Ltd10270106   Componentes del medio Hela
FormamidaPromegaH5052   Componente en el tampón de hibridación
G8T5Sankyo-DenkiG8T5Bombilla UV de 254 nm
GlucógenoLife Technologies Holdings Pte Ltd10814010Necesario para la precipitación de ácidos nucleicos
NanodropLife Technologies Holdings Pte LtdEspectrofotómetro Nanodrop 2000para la cuantificación de ácidos nucleicos
Agua libre de nucleasasa Primera BASEBUF-1180-500ml   
Penicilina Estreptomicina   Life Technologies Holdings Pte Ltd15140122   Componentes del medio Hela
ADN polimerasa de alta fidelidad (2x)Life Technologies Holdings Pte LtdF531L Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion con tampón HF (2x)
Juego de imprimaciones 1New England BiolabsE7335L Imprimaciones de PCR
Kit de extracción de gel de ADNQIAgen28106Kit de extracción de gel QIAquick
Kit de cuantificación fluorométricaLife Technologies Holdings Pte LtdQ32854Qubit dsDNA HS Kit de ensayo
de limpieza de ARNQiagen74106RNeasy Mini Kit Columna de membrana de sílice
Inhibidor de la rnasaLife Technologies Holdings Pte LtdAM2696SUPERase In
Transcriptasa inversaLife Technologies Holdings Pte Ltd18080400Síntesis de primera cadena SuperScript III
Tinción de gel de ácido nucleicoLife Technologies Holdings Pte LtdS11494SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide KinasaNew England BiolabsM0201LEnzima de reparación de extremos
T4 ARN ligasa 1New England BiolabsM0204LEnzima para ligadura de proximidad
T4 ARN ligasa 2, truncada KQNew England BiolabsM0373LEnzima para ligadura de adaptadores
TemedBio-Rad1610801TBE Componente de gel de urea
Tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinioLife Technologies Holdings Pte Ltd15596018TRIzol® Reactivo para la extracción de ARN
UreaFirst BASEBIO-2070-5kg   
Reticulante UVStratagene400072UV Stratalinker 1800
Transiluminador UVUVP95-0417-01Para la visualización de bandas
Xileno Cyanol FFSigma-AldrichX4126-10G
Limpieza de ADNZymo Research D4004Concentrador de ADN Zymo-5 
Lista de software necesario
FastQC software0.11.4http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software1.0.7https://github.com/jstjohn/SeqPrep
software BWA0.7.12http://bio-bwa.sourceforge.net/
software SAMTOOLS1.2.1http://www.htslib.org/
PULLSEQ software1.0.2https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software2.5.0chttps://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py script PYTHONPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py script PYTHONPYTHON 2.7.11
pickJunctionReads.awk ScriptAWK GNU 4.1.2https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M acetato
< tampón >lisis fuerte
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
usar, excepto cuando lave las perlas
Proteinasa K 
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
fuerte>Tampón de hibridación
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamida (almacenar en la oscuridad a 4 & grados; C)
Agregue siempre Superase-in fresco antes de usar
2x SSC
2x NaCl y citrato de sodio (SSC) (diluido a partir de 20x caldo de Invitrogen SSC)
0.5% SDS
2x tampón de fragmentación de ARN
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8,3
2x Carga de ARN Colorante
95% Formamida
0.01% Xileno Cianol
1 mM EDTA
RT secuencia de cebadores:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGATGGTGCCTACAG
escalera de de de kit SuperMix https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src de sodio Agregue siempre Superase-in fresco antes de < 0,02% SDS 0,02% azul de bromofenol <td colspan="4">3' Secuencia del adaptador de ARN: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC

Referencias

  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

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