La caracterización regular de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), para determinar el mantenimiento de su estado pluripotente, es un paso importante antes de que estas células se utilicen para otras aplicaciones. En este trabajo describimos un método para la propagación a pequeña escala de iPSCs humanas diseñado específicamente para permitir su caracterización fácil y rutinaria a través de inmunocitoquímica.
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Artículo de método
Propagación de pequeña escala de iPSCs humano en condiciones sin suero para la caracterización inmunocitoquímica de rutina
En este artículo
Resumen
Resumen
Existe un gran interés en utilizar células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) para el modelado de enfermedades y la terapéutica celular debido a su especificidad para el paciente y su talla característica. Sin embargo, la pluripotencia de las iPSC, que es esencial para su funcionalidad, debe confirmarse antes de que estas células puedan utilizarse en tales aplicaciones. Si bien es necesaria una caracterización rigurosa de las iPSCs, a través de diferentes ensayos celulares y funcionales para establecer su pluripotencia, la evaluación rutinaria del mantenimiento de la pluripotencia puede lograrse de manera más simple y efectiva a través de técnicas inmunocitoquímicas. Aquí, presentamos un protocolo sistemático para el cultivo de hiPSCs, de una manera reducida, para facilitar particularmente la verificación de su estado pluripotente utilizando inmunocitoquímica. Más específicamente, esta metodología abarca un medio eficiente y rentable de cultivar iPSC en condiciones libres de suero y sembrarlas en pequeños portaobjetos de cámara o cubreobjetos de vidrio ideales para la inmunocitoquímica.
Introducción
La reprogramación de células somáticas adultas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPS) ofrece una manera de obtener un suministro potencialmente ilimitado de células específicos para cada paciente para estudiar la enfermedad 1, 2. Recapitulando un fenotipo de la enfermedad in vitro sería plausible para examinar los mecanismos celulares y moleculares asociados con la enfermedad, y mejorar el descubrimiento de fármacos y la medicina 3 personalizado. Además, iPSCs humanos (hiPSCs) ofrecen la posibilidad de derivar los tipos de células específicas que se pueden usar....
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Protocolo
hiPSCs se obtuvieron a partir de fibroblastos dérmicos humanos aislados de 4 mm biopsias por punción de la piel y reprogramadas en casa a través de Sendai reprogramación 11 mediada por virus. La Universidad de Junta de Revisión Institucional de Arizona aprobó todos los procedimientos para la contratación de materia y toma de biopsias.
1. Preparación de la matriz extracelular superficie recubierta de IPSC Cultura
- Un día antes de la confluencia de los cultivos que crecen en hiPSC iMEFs, preparar la matriz extracelular (Matrigel) placas recubiertas.
- descongelación lenta una parte alícuota....
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Resultados
Este protocolo proporciona una descripción paso a paso de cómo iPSCs humano puede ser transferido de capa de alimentación al alimentador de libre condiciones, y posteriormente se propagó de manera limitada específicamente habilitar inmunocitoquímica rentable para confirmar el mantenimiento pluripotencia. La figura 1 muestra una representación esquemática de este protocolo. La figura 2A muestra colonias que crecen en hiPSC iMEFs en placas de 6 pocillos. E.......
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Discusión
El protocolo sistemático que aquí se presenta ofrece un ahorro de tiempo y un método rentable, en forma de una técnica de cultivo a escala reducida, diseñado específicamente para apoyar el análisis de pluripotencia efectiva mediante inmunocitoquímica.
Las principales ventajas de la metodología descrita son los siguientes. Tradicionalmente se necesitan más de 3 a 4 pasos a la transición iPSCs de capas de alimentación al alimentador libres de condiciones de cultivo con el fin de eliminar iMEFs.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Fuentes de Financiamiento: La Universidad de Arizona, la Fundación Jim Himelic y el Centro de Arizona para la Biología de Enfermedades Complejas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement Life | Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoetanol | Life Technologies | 21985023 | |
| FGF humano recombinante-Ciencias Celulares Básicas | CRF001B | ||
| Y-27632 Inhibidor de ROCK | R& D | 1254 | |
| Colagenasa Tipo IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel Matriz calificada por hESC Corning | 354277 | ||
| mTeSR1 | Tecnologías de células madre | 05850 | |
| mTeSR1 5x Suplemento | StemCell Technologies | 05850 | |
| Tampón de disociación celular suave | Tecnologías | 07174 | |
| 0,1 M PO4 tampón | interno | n/a | |
| Paraformaldehído, prill | Electrónica Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x solución salina tamponada con fosfato | n/a | n/a | |
| Suero normal de cabra | Life Technologies | 16210072 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) mAb de conejo, Sox2 (D6D9) mAb de conejo SSEA4 (MC813) mAb de ratón, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Señalización de células mAb de ratón | Señalización de células Señalización de células Señalización de células | 2840 3579 4755 4746 | Alternativamente, se puede comprar una combinación de 6 anticuerpos primarios de pluripotencia juntos como un kit en el Catálogo #9656 |
| IgM anti-Ms de cabra Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Anti-Ms de cabra IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| IgG anti-Rb de cabra Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Placas de | cultivo celular multipocilloFisher Scientific | 0720080/0720081 | Disponible en tamaños de 6, 12, 24, 48, 96 pocillos |
| 12 565 21 | Disponible en vidrio o plástico Permanox en tamaños de 1, 2, 4, 8, 16 pocillos | ||
| Cubreobjetos para el crecimiento | Fisher Scientific | 12 545 82 | Disponible en tamaños de 12, 15, 18, 22 y 25 mm |
Referencias
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, ....
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Reimpresiones y permisos
