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Artículo de método

Propagación de pequeña escala de iPSCs humano en condiciones sin suero para la caracterización inmunocitoquímica de rutina

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DOI:

10.3791/55260

⸱

18 de febrero de 2017

 , 
1Department of Neurology, The University of Arizona

En este artículo

Resumen

La caracterización regular de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), para determinar el mantenimiento de su estado pluripotente, es un paso importante antes de que estas células se utilicen para otras aplicaciones. En este trabajo describimos un método para la propagación a pequeña escala de iPSCs humanas diseñado específicamente para permitir su caracterización fácil y rutinaria a través de inmunocitoquímica.

Resumen

Existe un gran interés en utilizar células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) para el modelado de enfermedades y la terapéutica celular debido a su especificidad para el paciente y su talla característica. Sin embargo, la pluripotencia de las iPSC, que es esencial para su funcionalidad, debe confirmarse antes de que estas células puedan utilizarse en tales aplicaciones. Si bien es necesaria una caracterización rigurosa de las iPSCs, a través de diferentes ensayos celulares y funcionales para establecer su pluripotencia, la evaluación rutinaria del mantenimiento de la pluripotencia puede lograrse de manera más simple y efectiva a través de técnicas inmunocitoquímicas. Aquí, presentamos un protocolo sistemático para el cultivo de hiPSCs, de una manera reducida, para facilitar particularmente la verificación de su estado pluripotente utilizando inmunocitoquímica. Más específicamente, esta metodología abarca un medio eficiente y rentable de cultivar iPSC en condiciones libres de suero y sembrarlas en pequeños portaobjetos de cámara o cubreobjetos de vidrio ideales para la inmunocitoquímica.

Introducción

La reprogramación de células somáticas adultas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPS) ofrece una manera de obtener un suministro potencialmente ilimitado de células específicos para cada paciente para estudiar la enfermedad 1, 2. Recapitulando un fenotipo de la enfermedad in vitro sería plausible para examinar los mecanismos celulares y moleculares asociados con la enfermedad, y mejorar el descubrimiento de fármacos y la medicina 3 personalizado. Además, iPSCs humanos (hiPSCs) ofrecen la posibilidad de derivar los tipos de células específicas que se pueden usar como un recurso único para reemplazar las células muertas o disfuncionales y restaurar la función en el contexto de varios trastornos 4, 5.

Un requisito previo importante para el uso de células iPS en las aplicaciones anteriores es asegurarse de que su pluripotentes e indiferenciada estado se mantiene durante la expansión de la cultura. Típicamente, techniqUES tales como citometría de flujo, transferencia Western, reacción en cadena de la polimerasa y ensayos funcionales, que requieren grandes cantidades de células y equipo especializado, se utilizan para el análisis detallado de IPSC pluripotencia 6, 7, 8, 9, 10. Sin embargo, la evaluación de rutina del estado indiferenciado de las células iPS 'efectivamente podría lograrse a través de la propagación limitada de estas células específicamente para inmunocitoquímica (CPI), lo que implica una reducción del tiempo y los recursos.

Los avances recientes permiten el crecimiento de iPSCs en condiciones libres de suero definidos, que es una mejora significativa sobre los sistemas de cultivo convencionales que requieren capas alimentadoras de fibroblastos murinos y medio de suero que contiene. Sin embargo, la literatura actual no incluye protocolos claros que describen paso a paso cómo hacer la transición a partir de células iPS alimentadorcapa a sistemas libres de alimentador.

En este contexto, el presente protocolo detalla sistemáticamente cómo hiPSCs cultivados en ratón irradiado de fibroblastos embrionarios (IMEF) capas de alimentación pueden ser (1) adaptado para propagar en un medio libre de suero, y (2) se cultivaron en una pequeña escala para apoyar específicamente robusta inmuno análisis. En general, esta metodología representa un procedimiento oportuno y rentable para la propagación de iPSCs humanos en condiciones libres de suero para la confirmación de su pluripotencia de forma rutinaria usando inmunocitoquímica.

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Protocolo

hiPSCs se obtuvieron a partir de fibroblastos dérmicos humanos aislados de 4 mm biopsias por punción de la piel y reprogramadas en casa a través de Sendai reprogramación 11 mediada por virus. La Universidad de Junta de Revisión Institucional de Arizona aprobó todos los procedimientos para la contratación de materia y toma de biopsias.

1. Preparación de la matriz extracelular superficie recubierta de IPSC Cultura

  1. Un día antes de la confluencia de los cultivos que crecen en hiPSC iMEFs, preparar la matriz extracelular (Matrigel) placas recubiertas.
  2. descongelación lenta una parte alícuota de la matriz extracelular (lote dependiente, siga las instrucciones en la hoja de especificaciones) en el hielo en 4 ° C durante 2 h.
  3. En una campana de bioseguridad, usando puntas de pipeta en frío (almacenado a -20 ° C), añadir 1 parte alícuota de la matriz extracelular de Eagle Modificado Medium / Nutrient Mixture de Dulbecco frío F-12 (DMEM / F12 / HEPES) de acuerdo con el factor de dilución específica del lote .
  4. Prescindir de 600 ~81; L de la matriz extracelular por pocillo de cada nuevo cultivo celular tratado placa de 12 pocillos necesario.
  5. Incubar la placa a temperatura ambiente durante varias horas. Aquí, utilizar un tiempo de incubación de 3 h.
    NOTA: Las placas se pueden utilizar inmediatamente o se almacenaron a 4 ° C durante un máximo de dos semanas.

2. Transferencia de hiPSCs Cultivado en células alimentadoras IMEF en la matriz extracelular para la Propagación

  1. En el día de pases, retire la placa recubierta matriz a partir de 4 ° C y dejar que la placa se adapte a la temperatura ambiente durante 1 h en la campana de cultivo de tejidos.
  2. Aspirar el medio de 1 pocillo de una placa de 6 pocillos de la cultura hiPSC creciente en iMEFs y reemplazar con 500 l de reactivo de colagenasa de disociación (1 mg / mL en medio de cultivo basal).
  3. Incubar a 37 ° C durante ~ 10 a 30 min hasta que los bordes de las colonias IPSC parecen levantar ligeramente.
    NOTA: El tiempo de incubación es dependiente de la línea y pueden variar. Monitor de disociación bajo un microscopio.
  4. Cocheefully aspirar el reactivo de disociación y lavar suavemente 2 veces con tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4).
  5. Añadir 1 ml de la temperatura ambiente mTeSR1 medio completo con 10 ng / ml Rho asociada a inhibidor de la proteína quinasa (Y-27632 inhibidor de ROCK) al pozo.
    NOTA: El uso de una mezcla 50:50 de medio acondicionado IMEF y mTeSR1 durante este paso inicial se sugiere y puede ser beneficioso para la supervivencia de las hiPSCs durante esta transición medios de comunicación.
  6. Mediante un pequeño microscopio de contraste de fase colocado parcialmente dentro de la campana, la puntuación de forma manual y recoger 1 - 2 colonias hiPSC (~ 700 - 1.000 m de diámetro) usando una jeringa y la aguja (25 g, 1 ½ pulgadas). Empujar los pedazos obtenidos de la colonia en el medio con una punta de pipeta P200.
  7. Aspirar y disponer de la matriz de la nueva placa, teniendo cuidado de no perturbar el recubrimiento.
  8. Transferir 1 ml de la suspensión de células de la vieja que contiene bien los iPSCs anotados en la nueva matriz recubierta también.
  9. Place la placa en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. Rock de la placa en varios, de ida y vuelta rápida, y de lado a lado los movimientos para repartir uniformemente las células. No moleste a la placa durante 24 h.
  10. Realizar cambios diarios medios completos con mTeSR1 medio completo (adición de Y-27632 ROCA inhibidor no es necesario después del cultivo inicial en el paso 2.5).

3. pases de pequeña escala de hiPSCs en placas recubiertas de Matrix

NOTA: Por lo general, después de la transferencia inicial de las hiPSCs a la matriz placas recubiertas, las células se debe pasó una vez más de una manera similar para asegurar que todos iMEFs se han eliminado y las células se han adaptado al alimentador libres condiciones.

  1. Un día antes de la confluencia de IPSC preparar planchas de matriz recién recubiertas como se discutió en la sección 1.
  2. En el día de paso, quitar la placa recubierta con matriz a partir de 4 ° C de incubación y dejar que la placa se adapte a la temperatura ambiente durante 1 h en la calle sin tejidocampana tura.
  3. Aspirar el medio desde el 1 pocillo de una placa de 6 pocillos de hiPSCs (originalmente de la transición de alimentación a la matriz) y reemplazar con 500 l de tampón de disociación celular.
    NOTA: El tampón de disociación celular comercial utilizado aquí (ver Materiales Tabla) es más adecuado para su uso con medio mTeSR1 en comparación con la colagenasa.
  4. Incubar a temperatura ambiente durante 3-7 min hasta que los bordes de las colonias IPSC parecen levantar ligeramente. Como se mencionó antes, el tiempo de incubación es de línea dependiente y variable. Por lo tanto, monitorear la disociación celular bajo un microscopio para determinar el momento óptimo.
  5. Con cuidado aspirar el tampón de disociación y lavar suavemente 2 veces con PBS.
  6. Añadir 500 l de temperatura ambiente mTeSR1 medio completo con 10 ng / ml de Y-27632 inhibidor de la roca para el pozo.
  7. En lugar de colonias de puntuación como en el paso 2.6, empuje el número deseado de colonias en los medios de comunicación usando una punta de P200 y se tritura suavemente la suspensión de células 2 veces against una esquina del pozo para romper las colonias hiPSC en grupos de ~ 50-200 micras de tamaño. Por ejemplo, para una placa de 12 pocillos, recoger 1 - 2 colonias de transferir a cada nuevo pozo 1. Transferir la suspensión celular desde el antiguo pozo en una sola nueva pocillo de una placa de 12 pocillos.
  8. Rock de la placa en varios de ida y vuelta rápida, y los movimientos de lado a lado para uniformemente repartidas a cabo las células, y dejar que la placa de apoyo durante 24 h en un 37 ° C, 5% de CO2.
  9. Realizar cambios diarios medios completos con mTeSR1 medio completo. Como se mencionó antes, no es necesario añadir Y-27632 ROCA inhibidor después de la placa inicial.
    NOTA: no utilizados colonias IPSC desde el paso 3.7 pueden ser fácilmente criopreservados en este punto.

4. Preparación de la Cámara portaobjetos y cubreobjetos para la siembra de hiPSCs para inmunocitoquímica

NOTA: El siguiente protocolo utiliza 4-así la cámara de diapositivas de plástico y 12 mm cubreobjetos de vidrio con appropriatlos volúmenes de correos de los medios de comunicación en los múltiples pozos para apoyar inmunocitoquímica rentable. Sin embargo, los volúmenes de los medios de comunicación se puede aumentar si se desea el uso de pocillos y cubreobjetos más grandes tamaños.

  1. Un día antes de la confluencia hiPSC, preparar la cámara de diapositivas recién recubiertas con matriz extracelular como se discutió en la sección 1. Añadir solución de matriz suficiente (~ 300 - 500 l por pocillo de un portaobjetos de cámara de 4 pocillos) para cubrir totalmente cada pocillo sin ninguna preocupación de evaporación. Por otra parte, después de colocar 1 cubreobjetos limpio y esterilizado en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, capa con 500 l de matriz extracelular y asegúrese de que el cubreobjetos no está flotando en la parte superior de la solución.
  2. En el día de paso, eliminar los portaobjetos de cámara / cubreobjetos recubiertos de 4 ° C y permitir la aclimatación a temperatura ambiente durante 1 h en la campana de cultivo de tejidos.
  3. Aspirar el medio desde el 1 pocillo de una placa de 12 pocillos de hiPSCs y reemplazar con 500 l de tampón de disociación.
  4. Se incuba a tempe habitaciónrature para ~ 3-7 min hasta que los bordes de las colonias IPSC aparece para levantar ligeramente.
  5. Con cuidado aspirar el tampón de disociación y añadir 1 ml de la temperatura ambiente mTeSR1 medio completo con 10 ng / mL Y-27632 ROCA inhibidor para el pozo.
  6. El uso de un microscopio de contraste de pequeña fase colocado dentro de la campana de cultivo de tejidos, recoger manualmente 1 colonia / nuevo pozo de un portaobjetos de cámara de 4 pocillos o 1 nuevo cubreobjetos a ser plateado (~ 1.000 - 1.500 m de diámetro) usando una punta P200 pipeta empujando fuera de la superficie de la placa en el medio.
  7. Aspirar la matriz de la nueva cámara de diapositivas / cubreobjetos, teniendo cuidado de no perturbar el recubrimiento.
  8. tritura suavemente la suspensión de células 2 veces contra una esquina de la bien romper las colonias hiPSC en grupos de ~ 50-200 micras de tamaño. Transferir 250 l de la suspensión de células de la vieja bien en cada nuevo pocillo de una 4-bien cámara de diapositiva / cubreobjetos.
  9. Llevar el volumen de cada nuevo pozo hasta 500 l con mTeSR1 containing 10 ng / mL Y-27632 ROCA inhibidor.
  10. Coloque la cámara de diapositivas / cubreobjetos en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2.
  11. Después de 24 h, realice los cambios diarios de los medios completos con mTeSR1 medio completo. De nuevo, como se ha mencionado anteriormente, la adición de Y-27632 ROCA inhibidor no es necesario después de la placa inicial.

5. Preparación de células iPS para inmunocitoquímica

  1. Una vez confluentes, preservar las colonias hiPSC a través de la fijación mediante la eliminación de los medios de los pocillos y añadiendo pre-calentado% paraformaldehído al 4 PRECAUCIÓN (~ 300 l / pocillo de una 4-así diapositivas cámara / cubreobjetos). Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
  2. Desechar el paraformaldehído debidamente en función de riesgo biológico institucional y directrices de seguridad química.
  3. Se lavan las células 3 veces durante 5 minutos cada uno en un agitador de sobremesa con PBS.
    Nota: Las celdas en la cámara de diapositivas / cubreobjetos se pueden almacenar con un amplio PBS a 4 ° C indefinidamente en esta etapa.Alternativamente, pueden utilizarse inmediatamente para la ICC.

6. La inmunotinción de hiPSCs con marcadores de pluripotencia

NOTA: hiPSCs inmunotinción con anticuerpos pluripotencia estándar. A modo de ejemplo, aquí las células son de doble teñido con anticuerpos dirigidos a una superficie 1 y 1 antígeno intracelular en una manera secuencial como sigue: Anti-Etapa-Specific Embryonic antígeno-4 (SSEA4) con la proteína 4 (OCT-anti-Octamer vinculante 4) y anti-Tra-1-60 con anti-SRY inhibidor de la HMG CAJA gen 2 (Sox2) (por favor, véase la Tabla de Materiales para obtener detalles de anticuerpos).

  1. Aspirar el PBS de los pocillos y añadir 500 l de solución / pocillo de bloqueo sin Triton-X-100. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
  2. Preparar una concentración pre-determinado (aquí, usar 1: 200) de los anticuerpos de superficie, ya sea SSEA4 o Tra-1-60, diluyendo en solución de bloqueo sin Triton X-100.
    1. Para la cámara de diapositivas, preparar 300 l / pocillo de un portaobjetos de cámara de 4 pocillosmediante la mezcla de 298,5 l de bloqueo solución anterior y 1,5 l de anti-SSEA4 o Tra-1-60 anticuerpo primario.
    2. Para cubreobjetos, preparar 40 l / cubreobjetos mediante la mezcla de 199 l de bloqueo de la solución y 1 l de anti-SSEA4 o Tra-1-60 anticuerpo primario.
  3. Aspirar la solución de bloqueo de la corredera de cámara y dispensar el anticuerpo primario en los pozos apropiados. Para cubreobjetos, colocar un trozo de Parafilm firmemente dentro de una caja de Petri y dispensar 40 l de anticuerpo primario en la parte superior como una gotita. Usando una jeringa con aguja doblada y fórceps, levante con cuidado el cubreobjetos de la cultura bien y colocarlo células hacia abajo sobre la gota de anticuerpos en la parafina. Incubar toda la noche a 4 ° C.
  4. A la mañana siguiente, se lavan las células 3 veces, 5 a 10 min cada uno, mediante la eliminación del anticuerpo de la diapositiva cámara y la adición de PBS. Para cubreobjetos, levantar cada uno de la parafina y colocarlo de nuevo en un pocillo de una placa de 24 pocillos, lado celda hacia arriba. Añadir cuidadosamente PBS.
  5. Preparar anticuerpos secundarios apropiados en 1: 500 en la solución de bloqueo.
    1. Para la cámara de diapositivas, preparar 300 l / pocillo de un portaobjetos de cámara de 4 pocillos mezclando 499 l de solución de bloqueo y 1 l de cabra anti-ratón IgG3 Alexa Fluor 488 (por SSEA4) o 1 l de anticuerpo de cabra anti-IgM de ratón Alexa Fluor 488 (por Tra-1-60).
    2. Para cubreobjetos, preparar 40 l / cubreobjetos mediante la mezcla de 499 l de bloqueo de la solución y 1 l de cabra anti-ratón IgG3 Alexa Fluor 488 (por SSEA4) o 1 l de anticuerpo de cabra anti-IgM de ratón Alexa Fluor 488 (por Tra-1-60 ).
  6. Aspirar el PBS de la cámara de diapositivas y dispensar el anticuerpo secundario en los pozos apropiados. Para cubreobjetos, siguiendo el Paso 6.2, invertir los cubreobjetos sobre la solución de anticuerpo colocado en Parafilm a temperatura ambiente durante 2 h.
    NOTA: Si se utiliza fluorescente marcado con anticuerpos secundarios, las células deben estar protegidos de la luz. Colocar los portaobjetos de cámara y los cubreobjetos en un env oscuraironment durante las incubaciones y lavados.
  7. Lavar las células 3 veces durante 5 a 10 minutos cada uno mediante la eliminación del anticuerpo de la diapositiva cámara y la adición de PBS. Para cubreobjetos, levantar cada uno con cuidado desde el parafilm y se coloque de nuevo en un pocillo de una placa de 24 pocillos, lado celda hacia arriba. añadir con cuidado PBS durante el lavado.
  8. Antes de sondeo para el segundo antígeno, intracelular OCT-4 o SOX2 en este caso, se incuba de nuevo en solución de bloqueo hecho con el reactivo de permeabilización (Triton-X-100) durante 1 h a temperatura ambiente.
  9. Para inmunotinción para OCT-4 o Sox2, basta con seguir la metodología descrita en los pasos 6.1-6.6 para la aplicación de los anticuerpos primarios y secundarios. Para los fines de este protocolo, usar OCT-4 y Sox2 a una concentración de 1: 200 y el secundario anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo Alexa Fluor 594 a 1: 500.
  10. Después de los tratamientos con anticuerpos primarios y secundarios mencionados anteriormente, se lavan las células 3 veces durante 5 a 10 minutos cada uno con PBS y contratinción con 4 ', 6'-diamino-2-phenylindole, dihidrocloruro (DAPI) siguiendo protocolos estándar si se desea la visualización nuclear.

7. Preparación para la visión

  1. Para portaobjetos de cámara, retire con cuidado la cámara superior de la diapositiva, siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, enjuague en agua destilada, y añadir medio y un cubreobjetos de montaje para permitir la microscopía.
  2. Para cubreobjetos, invertir los cubreobjetos a una gota de medio de montaje se coloca en un portaobjetos de microscopio de vidrio.
  3. Imagen bajo un microscopio de fluorescencia estándar o confocal.

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Resultados

Este protocolo proporciona una descripción paso a paso de cómo iPSCs humano puede ser transferido de capa de alimentación al alimentador de libre condiciones, y posteriormente se propagó de manera limitada específicamente habilitar inmunocitoquímica rentable para confirmar el mantenimiento pluripotencia. La figura 1 muestra una representación esquemática de este protocolo. La figura 2A muestra colonias que crecen en hiPSC iMEFs en placas de 6 pocillos. E...

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Discusión

El protocolo sistemático que aquí se presenta ofrece un ahorro de tiempo y un método rentable, en forma de una técnica de cultivo a escala reducida, diseñado específicamente para apoyar el análisis de pluripotencia efectiva mediante inmunocitoquímica.

Las principales ventajas de la metodología descrita son los siguientes. Tradicionalmente se necesitan más de 3 a 4 pasos a la transición iPSCs de capas de alimentación al alimentador libres de condiciones de cultivo con el fin de eliminar iMEFs...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Fuentes de Financiamiento: La Universidad de Arizona, la Fundación Jim Himelic y el Centro de Arizona para la Biología de Enfermedades Complejas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM-F12/HEPESLife Technologies11330032
Knockout Serum Replacement LifeTechnologies10828028
L-GlutamineLife Technologies25030081
MEM-NEAALife Technologies11140050
2-mercaptoetanolLife Technologies21985023
FGF humano recombinante-Ciencias Celulares BásicasCRF001B
Y-27632 Inhibidor de ROCKR& D1254
Colagenasa Tipo IVLife Technologies17104019
Matrigel Matriz calificada por hESC Corning354277
mTeSR1Tecnologías de células madre05850
mTeSR1 5x SuplementoStemCell Technologies05850
Tampón de disociación celular suaveTecnologías07174
0,1 M PO4 tampóninternon/a
Paraformaldehído, prillElectrónica Microscopy Sciences19202
1x solución salina tamponada con fosfaton/an/a
Suero normal de cabraLife Technologies16210072
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA2153
Triton-X-100Sigma-AldrichX100
Oct-4A (C30A3) mAb de conejo,
Sox2 (D6D9) mAb de conejo
SSEA4 (MC813) mAb de ratón,
TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Señalización de células mAb de ratón
Señalización de células
Señalización de células
Señalización de células		2840
3579
4755
4746		Alternativamente, se puede comprar una combinación de 6 anticuerpos primarios de pluripotencia juntos como un kit en el Catálogo #9656
IgM anti-Ms de cabra Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21042
Anti-Ms de cabra IgG3 Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21151
IgG anti-Rb de cabra Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11037
Placas decultivo celular multipocilloFisher Scientific 0720080/0720081Disponible en tamaños de 6, 12, 24, 48, 96 pocillos
12 565 21Disponible en vidrio o plástico Permanox en tamaños de 1, 2, 4, 8, 16 pocillos
Cubreobjetos para el crecimientoFisher Scientific 12 545 82Disponible en tamaños de 12, 15, 18, 22 y 25 mm
de medio basal de células madre

Referencias

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