Una Cámara personalizable para medir la migración celular

Summary

Este protocolo detalla un método adaptable para medir la migración de células en respuesta a quimioatrayentes, que también pueden ser utilizados para determinar la velocidad de difusión de un fármaco fuera de una matriz de polímero.

Abstract

La migración celular es una parte vital de la respuesta inmune, el crecimiento y la cicatrización de heridas. La migración celular es un proceso complejo que implica interacciones entre las células, la matriz extracelular, y factores químicos solubles y no solubles (por ejemplo, factores quimiotácticos). Los métodos estándar para la medición de la migración de las células, tales como el ensayo de cámara de Boyden, el trabajo contando las células a ambos lados de un divisor. Estas técnicas son fáciles de usar; Sin embargo, ofrecen poca modificación geométrica para diferentes aplicaciones. En contraste, los dispositivos de microfluidos pueden ser utilizados para observar la migración de células con gradientes de concentración personalizables de factores solubles ^{1, 2.} Sin embargo, los métodos para hacer los ensayos de microfluidos basados ​​pueden ser difíciles de aprender.

A continuación, describimos un método fácil para la creación de cámaras de cultivo de células para medir la migración de células en respuesta a gradientes de concentración químicos. Nuestros millas celularesmétodo de la cámara gración puede crear diferentes gradientes de concentración lineal con el fin de estudiar la migración celular para una variedad de aplicaciones. Este método es relativamente fácil de usar y se lleva a cabo normalmente por los estudiantes universitarios.

La cámara de microcanal fue creado por la colocación de un inserto acrílico en la forma de la cámara de microcanal final por pocillo en una placa de Petri. Después de esto, poli (dimetilsiloxano) (PDMS) se vertió en la parte superior del inserto. El PDMS se deja endurecer y después se eliminó la inserción. Esto permitió la creación de los pozos en cualquier forma o tamaño deseado. Las células se pueden añadir posteriormente a la cámara de microcanal, y agentes solubles se pueden añadir a uno de los pozos por remojo un bloque de agarosa en el agente deseado. El bloque de agarosa se añade a uno de los pozos, y las imágenes de lapso de tiempo puede ser tomada de la cámara de microcanal con el fin de cuantificar la migración celular. Las variaciones de este método se pueden hacer para una aplicación determinada, por lo que este método higHly personalizable.

Introduction

Para que ocurran procesos vitales como la cicatrización de heridas, las respuestas inmunitarias y el desarrollo embrionario, debe tener lugar la migración celular. La migración celular implica la interacción entre las células y las células vecinas, la matriz extracelular y las señales químicas solubles (atrayentes o repelentes). Por ejemplo, en el proceso de cicatrización de heridas, los fibroblastos desempeñan un papel integral en la fibrogénesis y la contracción de la herida, donde las células se reclutan en el sitio de la lesión para sintetizar colágeno con el fin de formar la matriz extracelular³. Se han estudiado numerosos mecanismos detrás de la migración de fibroblastos al sitio de una herida, e incluyen diferentes factores mecánicos, físicos, eléctricos y quimiotácticos⁴. Los fibroblastos responden especialmente bien a diferentes gradientes de concentración de factores de crecimiento. Estos diferentes factores de crecimiento trabajan juntos para optimizar la regeneración de tejidos⁵. Al observar la respuesta quimiotáctica de los fibroblastos a las concentraciones del factor de crecimiento, se puede estudiar el patrón de migración direccional de los fibroblastos y cómo se orientan alrededor de obstáculos físicos para llegar a su destino. Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron, en primer lugar, desarrollar un sistema en el que el crecimiento de los fibroblastos pudiera rastrearse bajo la guía de barreras físicas y, en segundo lugar, modelar el crecimiento de los fibroblastos a medida que navegan por el sistema.

Actualmente, el ensayo de cámara de Boyden es el sistema más utilizado para medir la migración de células⁶. La cámara de Boyden consiste en una placa de pocillos múltiples de dos cámaras donde cada pocillo puede contener medio con o sin quimioatrayentes⁷. Una membrana de filtro proporciona una interfaz porosa entre las dos cámaras de cada pozo; Esto crea una barrera para que las células no puedan pasar a través de ella a menos que sea por migración activa. Típicamente, para la cámara de Boyden, se agrega un quimioatrayente a la cámara inferior, y se permite que el sistema se equilibre para formar un gradiente entre los pozos superior e inferior⁴. Un problema con el ensayo de cámara de Boyden es que se terminan formando gradientes pronunciados a lo largo de un solo eje perpendicular a la superficie de la membrana. Esto hace que la diferencia en la concentración de quimioatrayente entre los pozos superior e inferior sea inferior a lo que se esperaba originalmente. Debido a esta restricción, el ensayo de cámara de Boyden dificulta la correlación de las respuestas celulares específicas con características de gradiente particulares, como la pendiente y la diferencia de concentración. Sin estas mediciones, es difícil estudiar la integración de señales multigradiente.

Para abordar algunas de las limitaciones del ensayo tradicional de cámara de Boyden, se han desarrollado ensayos microfluídicos para formar gradientes de concentración personalizables¹. Los métodos estándar para crear sistemas microfluídicos requieren salas limpias para las técnicas litográficas. Estas técnicas pueden ser difíciles de aprender, especialmente en un entorno de aula estándar. Por lo tanto, hemos diseñado un sistema de cámaras para medir la migración celular que se puede realizar sin usar una sala limpia. Con nuestro sistema, los pocillos del ensayo se pueden ajustar a un tamaño preferido y se puede producir un gradiente de concentración lineal de pendiente personalizada. Esto permite una medición precisa de la quimiotaxis a partir de movimientos aleatorios. El diseño es un sistema barato y fácil de usar para modelar el crecimiento celular en respuesta a diferentes estímulos químicos.

Protocol

1. La producción de una Cámara de microcanales para crear un gradiente de concentración

1. Cortar una pieza de molde de acrílico
   1. Obtener una pieza de acrílico de la anchura deseada. Típicamente utilizar hojas de acrílico 1/16 pulgadas de espesor. hojas más gruesas son difíciles de cortar bien y muy delgadas hojas no tienen la resistencia mecánica, provocando su rotura o deformación durante el proceso.
   2. Crear un archivo CAD con la forma deseada de la pieza de acrílico para producir una cavidad dentro del polidimetilsiloxano (PDMS). Ajustar la anchura del cauce y longitud para alcanzar el gradiente deseado correspondiente a los protocolos experimentales individuales.
      1. A continuación, utilice una pieza de acrílico de las siguientes dimensiones: dos cuadrados (0,254 cm x 0,254 cm) conectados por un canal de ancho de 0,127 cm (0,254 cm de largo) (Figura 1).
   3. Importe el archivo CAD en el aparato de corte por láser y colocar la pieza de acrílico en un cortador de láser de acuerdo con la manuel protocolo del cante.
      NOTA: Como alternativa, 3D-imprimir la pieza desde el diseño CAD. La ventaja de este método es que los materiales alternativos pueden utilizarse para el molde; Sin embargo, la resolución y la reproducibilidad se pueden disminuir con la impresión en 3D en comparación con el corte por láser.

Figura 1: (CAD) Representación Computer-Aided Design de la Cámara de microcanales. Esta imagen representa el dibujo CAD de la pieza de acrílico necesaria para crear la cámara de microcanales. 1 A) Vista superior de dibujo CAD, 1B) Vista lateral de CAD dibujo con dimensiones en pulgadas, 1C) Vista superior de CAD dibujo con dimensiones en pulgadas Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Verter el polidimetilsiloxano (PDMS)
   1. En un recipiente para pesar, mezclar 10 partes en peso de base de elastómero comercial (por ejemplo Sylgard 184) con 1 parte en peso de elastómero comercial Agente de curado (por ejemplo Sylgard 194). Típicamente, la mezcla 10 g de elastómero base a 1 g de elastómero agente de curado.
   2. Agitar para combinar la base y agente de curado con una micropipeta para 5 min.
   3. Configurar una campana de vacío y colocar el barco sopesar con PDMS en el vacío durante 30 min para eliminar las burbujas de aire atrapadas.
   4. Apague el vacío y retire el recipiente para pesar. Verter el PDMS en la parte superior del acrílico recortada en una pequeña placa de Petri. Asegúrese de que el PDMS cubre completamente el inserto.
   5. Permitir a los PDMS curar durante la noche (al menos 18 h) a temperatura ambiente.
3. Extracción de la inserción de PDMS
   1. Después de curar el PDMS, extraiga la tapa cortando cuidadosamente el PDMS alrededor de la pieza de acrílico con un bisturí.

2. placas las células en una Cámara de microcanales

1. La esterilización de la cámara para el recubrimiento de las células.
   NOTA: Mientras PDMS pueden ser esterilizados con óxido de etileno u otras técnicas, un tratamiento UV rápida es rápido, barato, y suficiente para estudios de cultivo celular. La duración del tratamiento UV corta no afectó la estructura o la integridad mecánica de la pieza de PDMS.
   1. En una cabina de cultivo de células estándar, cubrir completamente la cámara con 70% de etanol.
   2. Ponga la placa de Petri en la campana de flujo laminar con las tapas.
   3. Cierre el capó y encender la luz UV. Exponerlo a la luz UV durante 1-2 h.
   4. Abra la campana de flujo laminar y esperar 15 minutos para restablecer el flujo.
   5. Retire el etanol al 70%.
   6. Lavar las cámaras dos veces con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Use 1 ml de PBS para cada lavado. Retirar PBS y se permiten cámaras que se seque durante la noche con las tapas.
      NOTA: Como alternativa, en lugarde utilizar una campana de flujo laminar, usar una caja de cámara UV para la esterilización si hay alguno disponible. Hacer una caja de UV mediante la colocación de una fuente de luz UV en la parte posterior de una caja de cartón forrada con papel de aluminio. El papel de aluminio refleja la luz para permitir la iluminación uniforme de la muestra.
2. Sembrando células en la Cámara
   1. Contar las células usando azul tripán y un hemocitómetro.
      1. Añadir 100 ml de la suspensión celular a 400 l de 0,4% Trypan azul y mezclar suavemente. Aplicar 100 l de esta solución a la hemocitómetro rellenando suavemente ambas cámaras bajo el cubreobjetos de vidrio.
      2. Utilizar un microscopio con un objetivo de 10X para centrarse en la cuadrícula en el hemocitómetro. Utilizar un contador de cuenta de la mano para contar las células no teñidas en vivo dentro de un conjunto de 16 plazas en el hemocitómetro.
      3. Recuento de células en los 4 grupos de 16 cuadrados. Tome el recuento medio de células a partir de las 4 series de 16 plazas y se multiplica por ⁴ 5x10. Este número final es el number de células / ml en la suspensión celular.
   2. Añadir 2.500 células a un pocillo de cada cámara. Esto se traduce en una densidad de células casi confluentes de ~ 30.000 / cm ^2.
   3. Permiten a las células para sentarse en la cámara durante 60 minutos antes de la adición de medios (Modificado de Dulbecco del medio Eagle, 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina).

3. Los bloques de agarosa dextrano empapados

1. Creación de un bloque de agarosa
   1. Verter 3% de agarosa en el molde impreso 3D (2 mm x 2 mm x 2 mm).
   2. Dejar que la agarosa solidifique en una cámara de vacío durante 30 min para eliminar las burbujas.
   3. Retire el bloque de agarosa del molde.
      NOTA: Como alternativa, se vierte 3% de agarosa en pequeña placa de Petri en un espesor de 2 mm. Corte un bloque de 2 mm x 2 mm x 2 mm con un bisturí u otra herramienta de corte. Esto no es tan preciso como el sistema de molde, pero puede ser un poco más fácil de hacer.
2. completamente submerge el bloque de agarosa en una solución de la concentración deseada del factor quimiotáctico. Para evaluar la formación gradiente de concentración, lave la cámara en primer lugar con dextrano fluorescente. La concentración y peso molecular del dextrano deben coincidir con la de un factor o fármaco de interés soluble.
3. Remojar la noche a la mañana de bloques de agarosa.

4. lapso de tiempo de la difusión de dextrano para evaluar el gradiente de concentración del factor soluble

1. Coloque el bloque de agarosa dextrano empapado en un pequeño pozo cuadrado de la cámara de microcanales.
2. Coloque la cámara de microcanal en un sistema de imágenes de células o utilizar otro microscopio de fluorescencia con una función de tiempo. Comienza el lapso de tiempo de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
   Nota: Los resultados mostrados son tomadas con filtro de GFP, el 50% de luz, 4/10 pH, y la magnificación 4X.

5. lapso de tiempo de Crecimiento Celular

1. células de la placa en la cámara de microcanal en un extremo de lacámara. Aquí, utilizar fibroblastos 3T3. Añadir 2.500 células a un pocillo en la cámara de microcanal. Recuento de células como se describe en 2.2.1.
   1. Permiten a las células para sentarse en la cámara durante 60 minutos antes de la adición de medios (Modificado de Dulbecco del medio Eagle, 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina). Mantener la cámara de microcanal con células cultivadas en placas a 37 ° C en 5% de CO _2. La migración celular a través del canal se pueden ver con un microscopio.
   2. Añadir un marcador o utilizar un defecto microscópico en la cámara como un marcador con el fin de servir como un punto de partida para cuantificar la distancia los delanteros célula se mueve.
2. Establecer un gradiente mediante la colocación de un gel de agarosa (8 mm ³ bloques) que contiene el factor de crecimiento concentrado, quimio-atrayente, drogas, u otro factor está probando (aquí, 40% de FBS se utiliza como un ejemplo) en un extremo del microcanal cámara.
3. Tomar imágenes con lapso de tiempo de la parte frontal de células en movimiento. Aquí, los resultados muestran imágenes de la célula front que fueron tomadas cada 12 h utilizando un sistema de imagen.
4. Use imágenes de la parte delantera celular para cuantificar la tasa de crecimiento celular. Calcular la tasa de crecimiento por primera utilizando la función polyfit MATLAB (roipoly) para crear una máscara poligonal definida por el frente de células, las paredes del canal, y el marcador de referencia. Las dimensiones de esta máscara producen la distancia de migración de la parte frontal de la que se calcula la velocidad del frente de celda promedio. Otros estudios han utilizado un método similar ^8.
   NOTA: Comparar el borde de la parte delantera de crecimiento de células en cada trama a la concentración del factor soluble en esa misma distancia. El gradiente de concentración factor soluble se calcula usando un modelo de difusión 1D aproximación.
5. Tomar imágenes fluorescentes de las células por medio de faloidina y DAPI.
   1. Fijar las células antes de la tinción con faloidina.
      1. Cálido paraformaldehído al 4% a 37 ° C.
      2. Agregar suficiente paraformaldehído al 4% para cubrir las células. Mantener células en elde paraformaldehído durante 10 min.
      3. Enjuague dos veces con PBS durante 15 min cada vez. Use suficiente PBS para cubrir las células.
   2. Retirar PBS a partir de células y añadir solución permeabilizante suficiente (0,1% Triton X-100 en PBS) para cubrir células. Deje la solución durante 10 min.
   3. Lavar dos veces con PBS durante 5 min cada vez. Use suficiente PBS para cubrir las células.
   4. Retirar PBS a partir de células y añadir solución de (1% de albúmina de suero bovino en PBS) de bloqueo para 20 min.
   5. Eliminar la solución de bloqueo y se lava 2 veces con PBS durante 5 minutos cada vez. Use suficiente PBS para cubrir las células.
   6. A partir de este punto, proteger a las células de la luz con papel de aluminio cuando no se utilicen. Retirar PBS a partir de células y añadir faloidina 488 diluido 1:50 en PBS durante 1 h.
   7. Lavar 2 veces en PBS durante 5 min para cada lavado. Use suficiente PBS para cubrir las células. A continuación, retire PBS a partir de células.
   8. Añadir DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) diluido 1: 1000 en PBS a las células durante 15 min.
   9. Retire y DAPILavar las células dos veces con PBS durante 5 min para cada lavado.
   10. Retire último lavado y añadir una cantidad suficiente para cubrir las células PBS. Las células ahora se pueden obtener imágenes con un microscopio de fluorescencia.

Results

La figura 2 muestra el movimiento de la parte delantera de células a través del canal en respuesta a un gradiente de suero bovino fetal colocado en el extremo opuesto del canal, desde donde se siembran las células. El frente celular se muestra a las 48 h (figura 2A), 72 h (Figura 2B), 96 h (Figura 2C), y 120 h (Figura 2D) post chapado. El movimiento de la parte frontal de células fue rastreado con estas ...

Discussion

Nuestra cámara de microcanal puede ser utilizado para una multitud de propósitos, incluyendo la determinación de la tasa de migración celular en respuesta a factores de crecimiento y factores quimiotácticos y la medición de la velocidad de difusión de un fármaco a partir de una matriz de polímero. Es posible utilizar nuestra cámara de microcanal para hacer crecer células y colocar un quimioatrayente en un extremo de la cámara. Las células crecen en respuesta a la quimioatrayente, y la migración de las células pueden ser...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona	Sigma-Aldrich 761036		poli(dimetilsiloxano) Kit de 2 partes que incluye base de elastómero de silicona y agente de curado de elastómero de silicona
Láminas acrílicas	US Plastic	44200
Placas de Petri desechables	Halcón	25373-041
Isotiocianato de fluoresceína– dextrano	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agarosa, Tipo I, Baja EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Medio de águila modificado de Dulbecco	Fisher Scientific	11965092	Componentes de los medios celulares
Fetal Bovino Serio	Fisher Scientific	16000036	Componentes de los medios celulares
Penicilina-estreptomicina	Fisher Scientific	15140148	Componentes de los medios celulares
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)		Fisher Scientific
EVOS XL	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Instrumento utilizado para tomar imágenes de lapso de tiempo
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	Número de modelo: VLS2.30	Cortadora láser utilizada para cortar plástico