Una Cámara personalizable para medir la migración celular

Resumen

Este protocolo detalla un método adaptable para medir la migración de células en respuesta a quimioatrayentes, que también pueden ser utilizados para determinar la velocidad de difusión de un fármaco fuera de una matriz de polímero.

Resumen

La migración celular es una parte vital de la respuesta inmune, el crecimiento y la cicatrización de heridas. La migración celular es un proceso complejo que implica interacciones entre las células, la matriz extracelular, y factores químicos solubles y no solubles (por ejemplo, factores quimiotácticos). Los métodos estándar para la medición de la migración de las células, tales como el ensayo de cámara de Boyden, el trabajo contando las células a ambos lados de un divisor. Estas técnicas son fáciles de usar; Sin embargo, ofrecen poca modificación geométrica para diferentes aplicaciones. En contraste, los dispositivos de microfluidos pueden ser utilizados para observar la migración de células con gradientes de concentración personalizables de factores solubles ^{1, 2.} Sin embargo, los métodos para hacer los ensayos de microfluidos basados ​​pueden ser difíciles de aprender.

A continuación, describimos un método fácil para la creación de cámaras de cultivo de células para medir la migración de células en respuesta a gradientes de concentración químicos. Nuestros millas celularesmétodo de la cámara gración puede crear diferentes gradientes de concentración lineal con el fin de estudiar la migración celular para una variedad de aplicaciones. Este método es relativamente fácil de usar y se lleva a cabo normalmente por los estudiantes universitarios.

La cámara de microcanal fue creado por la colocación de un inserto acrílico en la forma de la cámara de microcanal final por pocillo en una placa de Petri. Después de esto, poli (dimetilsiloxano) (PDMS) se vertió en la parte superior del inserto. El PDMS se deja endurecer y después se eliminó la inserción. Esto permitió la creación de los pozos en cualquier forma o tamaño deseado. Las células se pueden añadir posteriormente a la cámara de microcanal, y agentes solubles se pueden añadir a uno de los pozos por remojo un bloque de agarosa en el agente deseado. El bloque de agarosa se añade a uno de los pozos, y las imágenes de lapso de tiempo puede ser tomada de la cámara de microcanal con el fin de cuantificar la migración celular. Las variaciones de este método se pueden hacer para una aplicación determinada, por lo que este método higHly personalizable.

Introducción

Para que ocurran procesos vitales como la cicatrización de heridas, las respuestas inmunitarias y el desarrollo embrionario, debe tener lugar la migración celular. La migración celular implica la interacción entre las células y las células vecinas, la matriz extracelular y las señales químicas solubles (atrayentes o repelentes). Por ejemplo, en el proceso de cicatrización de heridas, los fibroblastos desempeñan un papel integral en la fibrogénesis y la contracción de la herida, donde las células se reclutan en el sitio de la lesión para sintetizar colágeno con el fin de formar la matriz extracelular³. Se han estudiado numerosos mecanismos detrá....

Protocolo

1. La producción de una Cámara de microcanales para crear un gradiente de concentración

1. Cortar una pieza de molde de acrílico
   1. Obtener una pieza de acrílico de la anchura deseada. Típicamente utilizar hojas de acrílico 1/16 pulgadas de espesor. hojas más gruesas son difíciles de cortar bien y muy delgadas hojas no tienen la resistencia mecánica, provocando su rotura o deformación durante el proceso.
   2. Crear un archivo CAD con la forma deseada de la pieza de acrílico para producir una cavidad dentro del polidimetilsiloxano (PDMS). Ajustar la anchura del cauce y longitud para alcanzar el gradiente deseado correspondiente a lo....

Resultados

La figura 2 muestra el movimiento de la parte delantera de células a través del canal en respuesta a un gradiente de suero bovino fetal colocado en el extremo opuesto del canal, desde donde se siembran las células. El frente celular se muestra a las 48 h (figura 2A), 72 h (Figura 2B), 96 h (Figura 2C), y 120 h (Figura 2D) post chapado. El movimiento de la parte frontal de células fue rastreado con estas .......

Discusión

Nuestra cámara de microcanal puede ser utilizado para una multitud de propósitos, incluyendo la determinación de la tasa de migración celular en respuesta a factores de crecimiento y factores quimiotácticos y la medición de la velocidad de difusión de un fármaco a partir de una matriz de polímero. Es posible utilizar nuestra cámara de microcanal para hacer crecer células y colocar un quimioatrayente en un extremo de la cámara. Las células crecen en respuesta a la quimioatrayente, y la migración de las células pueden ser.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona	Sigma-Aldrich 761036		poli(dimetilsiloxano) Kit de 2 partes que incluye base de elastómero de silicona y agente de curado de elastómero de silicona
Láminas acrílicas	US Plastic	44200
Placas de Petri desechables	Halcón	25373-041
Isotiocianato de fluoresceína– dextrano	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agarosa, Tipo I, Baja EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Medio de águila modificado de Dulbecco	Fisher Scientific	11965092	Componentes de los medios celulares
Fetal Bovino Serio	Fisher Scientific	16000036	Componentes de los medios celulares
Penicilina-estreptomicina	Fisher Scientific	15140148	Componentes de los medios celulares
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)		Fisher Scientific
EVOS XL	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Instrumento utilizado para tomar imágenes de lapso de tiempo
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	Número de modelo: VLS2.30	Cortadora láser utilizada para cortar plástico

Sistema de imágenes celulares BP24384