Artículo de método

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

DOI:

10.3791/55268

⸱

16 de marzo de 2017

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para generar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando la proteína morfogénica ósea 4 e inhibidores de las vías Activina/Nodal. Este método es adecuado para la diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas y puede generar grandes cantidades de células para la manipulación genética.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La placenta es el primer órgano de desarrollar durante la embriogénesis y es necesario para la supervivencia del embrión en desarrollo. La placenta está compuesto de varias células trofoblásticas que la diferencian de las células trophectoderm extra-embrionarias de blastocisto preimplantación. Como tal, nuestra comprensión de los eventos tempranos de diferenciación de la placenta humana es limitada debido a las restricciones éticas y legales sobre el aislamiento y la manipulación de la embriogénesis humana. Células madre pluripotentes humanos (hPSCs) son un sistema de modelo sólido para investigar el desarrollo humano y también pueden diferenciarse in vitro en células trofoblásticas que expresan marcadores de los diversos tipos de células trofoblásticas. A continuación, presentamos un protocolo detallado para la diferenciación en células trofoblásticas hPSCs utilizando la proteína morfogenética ósea 4 y los inhibidores de las vías de señalización de Activina / nodal. Este protocolo genera diversos tipos de células trofoblásticas que pueden ser transfectadas con siRNAspara la investigación de fenotipos de pérdida de función o pueden ser infectados con patógenos. Además, hPSCs pueden ser modificados genéticamente y luego diferenciarse en progenitores trofoblásticas para los análisis de ganancia de función. Este método de diferenciación in vitro para la generación de trofoblastos humanos a partir de hPSCs supera las restricciones éticas y legales de trabajar con embriones humanos tempranos, y este sistema se puede utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo el descubrimiento de fármacos y investigación de células madre.

Introducción

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Se requiere la placenta para el crecimiento y la supervivencia del feto durante el embarazo y facilita el intercambio de gases, nutrientes, productos de desecho y hormonas entre la circulación materna y fetal. El primer órgano formado durante la embriogénesis de mamíferos es la placenta, que comienza el desarrollo de 6-7 días después de la concepción en los seres humanos y 3.5-4.5 días en ratones 1, 2, 3, 4. Las células trofoblásticas son las células más importantes de la placenta, y estas células representan uno de los acontecimientos más tempranos de diferenciación del linaje del embrión de mamífero. Surgen de las células trophectoderm extra-embrionarias exteriores del blastocisto preimplantación. Nuestro conocimiento de las primeras etapas del desarrollo de la placenta está limitado por las restricciones éticas y logísticas en el modelado de desarrollo humano temprano.

Durante la implantación de embriones, los trofoblastosinvadir el epitelio materna y diferenciarse en células progenitoras especializados 5. Citrofoblastos (CTBS) son mononucleadas, progenitores no diferenciadas que se fusionan y se diferencian en sinciciotrofoblastos (SYN) y trofoblastos invasivos extravillous (EVT), que ancla la placenta al útero. SYN son multinucleadas, células diferenciadas terminales que sintetizan hormonas necesarias para sostener el embarazo. Los eventos que generan diferenciación temprana EVT y SYN son esenciales para la formación de la placenta, como alteraciones en las células trofoblásticas dan lugar a aborto involuntario, la preeclampsia, restricción del crecimiento intrauterino y 1. Los tipos de líneas de células trofoblásticas humanas que se han desarrollado incluyen CTBS y coriocarcinomas, que producen hormonas placentarias y propiedades invasivas de visualización 6 inmortalizados. células trofoblásticas primaria a partir de placentas de primer trimestre humanos se pueden aislar, pero las células rápidamente differentiate y detener la proliferación in vitro. Es importante destacar que, transformado y líneas celulares primarias tienen diferentes perfiles de expresión génica, lo que indica que las líneas celulares inmortalizadas trofoblásticas oncogénicas y pueden no representar con precisión los trofoblastos primaria 7. Además, estas líneas es poco probable que se asemejan a trofoblasto placentario progenitores de células madre, ya que se derivan de una etapa más avanzada primero a través de tercer trimestre.

Hay una necesidad de un sólido en el sistema de cultivo in vitro de trofoblastos humanos en fase inicial con el fin de estudiar los primeros eventos de la formación y la función de la placenta. Las células madre embrionarias humanas (hESCs), que comparten propiedades con la masa celular interna del embrión preimplantatorio, con frecuencia se utilizan para modelar el desarrollo humano temprano, incluyendo la formación de la placenta temprana. Tanto las células madre pluripotentes inducidas humanas (hESCs hiPSCs) y pueden diferenciarse en los trofoblastos in vitro usando hueso MorProtein phogenic 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Esta conversión de las células pluripotentes a las células trofoblásticas usando BMP4 es específico para las células humanas y se utiliza ampliamente para estudiar el desarrollo de la placenta humana temprana, ya que no requiere acceso a los embriones humanos tempranos 9, 16. Recientemente, se descubrió que la adición de los inhibidores de A83-01 (A) y PD173074 (P), que bloquean las vías de señalización SMAD2 / 3 y MEK1 / 2, aumenta la eficiencia de diferenciación HPSC en progenitores trophectoderm-como, principalmente SYN y EVT, sin la extensa generación de mesodermo, endodermo, o células del ectodermo 9, 17 . El uso de estas condiciones del medio, CMEh diferenciado durante 12 días tienen perfiles de expresión de genes similares a los de las células trophectoderm aisladas de embriones en fase de blastocisto humanos y secretan varias hormonas de crecimiento placentario-específica, apoyando la validez de este sistema de modelo in vitro 9, 11. A continuación, presentamos un protocolo detallado para la diferenciación in vitro de células progenitoras en hPSCs trofoblásticas humanas usando BMP4 Un medio de cultivo / / P. Estas condiciones producen abundantes cantidades de células para una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo la secuenciación de ARN, la alteración génica utilizando siRNAs, infecciones por patógenos, y la modificación genética usando transfección lipofección mediada.

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Protocolo

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NOTA: Para la diferenciación de cualquiera de hESCs o hiPSCs en progenitores trofoblásticas, hPSCs cultivados en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) son la transición al alimentador libres condiciones para dos pasajes antes de iniciar la diferenciación con BMP4 / A / P. Este proceso elimina la contaminación MEF de células diferenciadas. A continuación, se presenta un protocolo para la diferenciación de células madre, y el mismo protocolo se puede aplicar a hiPSCs.

1. Cultura y recuperación de hESCs irradiados en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) (Preparaciones)

  1. Gamma-irradiación de MEFs
    1. Hacer 500 ml de medio para el cultivo de los MEFs: DMEM con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 1x penicilina / estreptomicina (Pen / Strep), y 0,1 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA).
    2. Descongelar un vial de MEFs primarios y el uso de medio MEF para cultivar las células. Ampliar los MEFs primarios de 30 planchas en medio de cultivo MEF.
      NOTA: Las concentraciones de oxígeno no son críticos para este paso, por loo bien condiciones fisiológicas (4%) o ambientales (20%) dentro de la incubadora se pueden utilizar.
    3. Recoger los MEFs. Utilizar 0,25% de tripsina para eliminar los MEFs de las placas y transferir las células a un tubo cónico. Coloque los MEFs en un instrumento de irradiación y exponer las células a 3.500 grises.
      NOTA: La cantidad de tiempo dependerá de la actividad de la fuente dentro de la unidad de irradiación.
    4. Resuspender las MEFs irradiados con medio de cultivo MEF y contar el número de células utilizando un hemocitómetro.
    5. Se precipitan los MEFs utilizando una centrífuga y se añaden 50% medio de cultivo MEF y el 50% de células medio (80% de SFB y medio de cultivo MEF 20%) de congelación. Alícuota de 1 x 10 6 células por vial.
    6. Colocar los viales MEF irradiado en un congelador a -80ºC durante la noche, y luego transferirlos a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
  2. Descongelación de MEFs congelados y hESCs para la cultura
    1. Hacer 500 ml de medio de células madre: DMEM / F-12 con 20% de suero Replacement, NEAA 0,1 mM, 2 mM L-glutamina, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-mercaptoetanol, y 1x Pen / Strep.
    2. Descongelar un vial de MEFs un día antes de la descongelación de la hESCs. Rociar una placa de 6 pocillos con 0,1% de gelatina, usando 1 ml de cada pozo. Incubar durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente, y luego retire la gelatina.
    3. Retirar un vial de MEFs del almacenamiento en nitrógeno líquido y sumergir el vial en un baño de agua a 37 °. Mira el vial de forma intermitente hasta que sólo quedan pequeños cristales de hielo. transferir rápidamente el contenido del vial a 9 ml de medio de MEF dentro de un tubo cónico de 15 ml.
    4. Sedimentar las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en medio MEF. Alícuota del MEF uniformemente sobre una placa de 6 pocillos. Poner la placa en una incubadora a 37 ° C bajo contenido de oxígeno (4%) durante la noche.
  3. El cultivo rutinario de hESCs en MEFs
    1. Retirar un vial de células madre a partir de nitrógeno líquido y descongelar rápidamente el vial utilizando un 37 ° C baño de agua. pipeta suavemente la hESCs en un tubo cónico de 15 ml que contiene 9 ml de medio de células madre y centrifugar a 200 xg durante 5 min. Se elimina el medio y volver a suspender las células con 1 ml de medio de células madre.
    2. Aspirar el medio MEF de la placa preparada en el paso 1.2.4 y se añade 1 ml de medio de células madre. Añadir inhibidor de la roca Y-27632 (10 mM) al medio de células madre. Transferir la hESCs en MEFs.
    3. Colocar las células en una incubadora a 37 ° C bajo contenido de oxígeno (4%) durante la noche. Reemplazar el medio hCME diaria. Raspe células diferenciadas con una pipeta Pasteur, se visualizaron bajo un microscopio vertical en 4X.
    4. Passage la hESCs cada 4-6 días, dependiendo de la confluencia celular y el tamaño de las colonias de células madre. Preparar un plato de MEFs el día antes de los pases. Cuando las células están listas para el paso, eliminar el medio de células madre y lavar el pocillo con 1 ml de PBS.
    5. Añadir 1 mg / ml de colagenasa (previamente calentada a 37 ° C), se incuba a 37 ° C durante 5 minutos, y retirar la colagenasa. Wcenizas las células con PBS, añadir 1 ml de medio de células madre por pozo, y raspar manualmente las células en pequeños grupos utilizando la punta de una pipeta de 5 ml. La transferencia de los grupos de células en suspensión en un pozo (s) nueva MEF-revestido.

2. La transición de hESCs MEFs de que los enlaces de forma gratuita Condiciones sobre placas recubiertas con matriz extracelular

  1. Preparar MEF medio condicionado (CM)
    1. La placa de las MEFs irradiados en un matraz T75 a 90-100% de confluencia; es importante que los MEFs están densamente plateado. Observar las células utilizando un microscopio para determinar si se han unido a la parte inferior del frasco (MEFs se unen aproximadamente 6 hr después de la siembra o al día siguiente).
      NOTA: solteras células flotan en el medio cuando se observa con un microscopio. Al día siguiente, retire medio MEF y añadir 25 ml de medio de células madre que carecen de B-FGF.
    2. Se recoge el medio acondicionado después de 24 horas de incubación. Reemplazar con medio fresco al día durante un máximo de 12 días.
    3. Filtrar el CM recogido utilizando un filtro de 0,22 mM. Antes de su uso, añada fresca B-FGF al CM.
      NOTA: CM se puede congelar a -80 ° C y se almacenó durante hasta 1 año. Como alternativa, el CM almacenar a 4 ° C durante 2 semanas.
  2. Transición desde la hESCs la cultura en los MEFs al alimentador de placas de matriz libre con recubrimiento extracelulares.
    1. Preparación de la matriz extracelular para las placas de cultivo de tejidos de revestimiento
      1. Descongelar una alícuota de la matriz extracelular en hielo (aproximadamente 3-4 horas). Utilizando puntas de frío de hielo, uno 50 ml tubo cónico de frío, y el medio DMEM / F12, la transferencia de 2 mg de la matriz extracelular en 24 ml de DMEM enfriado con hielo / F-12 (la dilución depende de la concentración de la matriz extracelular del proveedor ).
      2. Inmediatamente transferir los 50 ml tubo cónico de hielo y almacenarlo a 4ºC. Para placas de cultivo de tejidos de revestimiento, añadir la cantidad apropiada de la matriz extracelular diluida al pocillo (por ejemplo, 1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos). Agitar para recubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 hr.
    2. hESCs paso de los MEFs (como en el paso 1.3) utilizando CM-B que contiene FGF (10 ng / ml).
      1. Aspirar para eliminar la matriz extracelular de la nueva placa y añadir CM contiene B-FGF. La transferencia de los grupos celulares raspadas de la placa de MEF con una pipeta y alícuota en la placa de matriz recubierto extracelular. Incubar en la incubadora a 37ºC bajo contenido de oxígeno durante la noche.
      2. Reemplazar el CM con el medio B-FGF diaria; la cantidad de medio dependerá del tamaño del matraz de cultivo. Use 2 ml de medio para una 6-bien también. Raspe células diferenciadas con una pipeta Pasteur.
      3. hESCs paso cada 6-7 días, cuando las colonias son brillantes cuando se observa bajo el microscopio.
        NOTA: colonias de células madre cultivadas en placas de matriz extracelular-revestido se hacen más grandes que las células MEF-cultivadas.
      4. Cuando las células libres de alimentador están dispuestos a paso, se elimina el medio, lavar por el anuncianteding 1 ml de PBS utilizando una pipeta, aspirado para eliminar el PBS, añadir 0,5 mg / ml de dispasa (pre-calentado a 37 ° C) con una pipeta, y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
      5. Se lavan las células con PBS mediante la adición de 2 ml de PBS por pocillo y aspirando después. Añadir 1 ml de CM por pocillo y raspar manualmente las células en pequeños grupos utilizando la punta de una pipeta de 5 ml.
      6. Placa de los grupos de células en suspensión en nuevas placas de matriz recubierto extracelulares; las células se adhieran después de 24 horas.

3. La diferenciación de hESCs Uso de BMP4 / A / P

  1. Preparar el medio de diferenciación. Uso CM (que carece de B-FGF) y añadir (fresco) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 M), y PD173074 (0,1 M). Añadir estos inhibidores a la CM antes del uso.
  2. Utilizar hESCs libres de alimentador que crecen en placas de matriz extracelular con recubrimiento de 1 paso, que sean cultivadas dentro de una incubadora a 4% de oxígeno. Después de la primera paso en placas de matriz recubierto extracelulares,dejar que las células se adhieren durante 24 horas. El día siguiente, iniciar la diferenciación. Retire la CM (que contiene B-FGF) y reemplazarlo con CM que contiene BMP4 / A / P (2 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos). Continuar el cultivo de las células por medio de 4% los niveles de oxígeno.
  3. Reemplazar el CM que contiene BMP4 / A / P (2 ml / pocillo de una placa de 6 pocillos) cada 2 días. Aspirar para eliminar el medio viejo y añadir nuevas CM usando una pipeta. En el segundo día después de la adición de BMP4 y la eliminación de B-FGF (considerado diferenciación día 2), la morfología de la célula va a cambiar, apareciendo más grande cuando se observa usando un microscopio.
    NOTA: indiferenciado de células, que presentan bordes redondos brillantes, no estarán presentes.
  4. Recoger las células en los puntos de tiempo deseados. Las células diferenciadas se dejan de dividirse después de alrededor de 2 semanas. transfectar células durante este período de tiempo (véase la siguiente sección).

4. La transfección de las células trofoblásticas con siRNAs o el ADN del plásmido

  1. Preparar las células trofoblásticas para la transfección
    1. CMEh de cultivo para dos pasajes sobre la matriz extracelular después de su transferencia de los MEFs (véase el paso 2.2). Utilice medio que contiene células madre B-FGF.
    2. Dividir la hESCs en una nueva placa de matriz extracelular un día antes de la diferenciación. Alta confluencia celular es importante, así dividir las células 1: 1 en una nueva placa / pocillo, lo que garantizará al menos 50% de confluencia el día siguiente. Se incuban las células durante la noche en la incubadora de bajo oxígeno.
      NOTA: hESCs no necesitan ser contados durante este paso.
    3. Al día siguiente, reemplazar el medio con el medio de diferenciación (CM que contiene BMP4 / A / P y carente B-FGF, usando 2 ml / pocillo de una placa de 6 pocillos). Eliminar el medio viejo por aspiración y transferir el nuevo medio (2 ml) usando una pipeta. Colocar las células en una incubadora de bajo contenido de oxígeno (4% de oxígeno) durante la noche.
  2. Las transfecciones utilizando siRNAs de una alteración del gen o utilizando ADN plásmido
    1. Diferenciar las células hasta que la deseada tiempo-punto (entre los días 1 y 14). El día antes de la transfección, trypsinize las células utilizando tripsina al 0,05% durante 5 min. Placa a la confluencia deseada (según el protocolo de reactivo de transfección) en una placa recubierta con gelatina (añadir 0,1% de gelatina a una placa de cultivo de tejidos durante 20 min y aspirado para eliminar). Añadir CM que contiene BMP4 / A / P (que carece de B-FGF) e incubar durante la noche.
    2. El día siguiente, añadir medio de diferenciación fresco a las células. Transfectar siRNAs utilizando un reactivo de transfección de siRNA. Para ADN de plásmido, usar un reactivo de lipofectamina apropiado.
    3. Seguir el protocolo de producto como se describe para cada reactivo de transfección. La transferencia de los complejos de siRNA-lipofectamina a cada pocillo / placa de las células, mezclar suavemente, y cultivar las células durante la noche en una incubadora de bajo contenido de oxígeno.
      NOTA: Algunos reactivos de transfección son inhibidas por los antibióticos, que exigen que carecen de CM penicilina / estreptomicina.
    4. Al día siguiente, reemplazar con medio de diferenciación fresca.
    5. Recoger las células en el deseod puntos de tiempo (por ejemplo, 24 horas, 48 horas y 72 horas) para comprobar la eficacia de la interrupción de genes utilizando RT-PCR cuantitativa. Para las células de recolección, utilice 0,05% de tripsina, la adición de 1 ml por pocillo e incubando durante 5 min a 37 ° C. Añadir 5 ml de medio de MEF por pocillo para neutralizar la tripsina. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min y utilizar el sedimento celular para el aislamiento de ARN.

5. infección por patógenos de las células trofoblásticas: Infección viral de Sendai

  1. Preparar para la diferenciación de hESCs
    1. CMEh de cultivo para dos pasajes sobre la matriz extracelular después de la transferencia de los MEFs (véase el paso 2.2). Utilice medio que contiene células madre B-FGF.
    2. Dividir la hESCs en una nueva placa de matriz extracelular un día antes de la diferenciación. Alta confluencia celular es importante, así que las células de división 1: 1 en una nueva placa / pocillo, lo que garantizará al menos 50% de confluencia el día siguiente. Se incuban las células durante la noche en una incubadora de bajo contenido de oxígeno (4% de oxígeno).
      NOTA: hESCs no necesitan ser contadas durante este paso.
    3. Al día siguiente, reemplazar el medio con el medio de diferenciación (CM que contiene BMP4 / A / P y carente B-FGF) y el cultivo de una noche en un incubador con bajo contenido de oxígeno (oxígeno al 4%).
  2. Sendai infección viral de las células trofoblásticas
    1. Un día antes del día de diferenciación deseada, trypsinize las células de diferenciación (a células individuales) usando 0,05% de tripsina durante 5 min y transferirlos a una placa recubierta con gelatina. Añadir medio de diferenciación e incubar durante la noche en una incubadora de bajo contenido de oxígeno.
    2. El día siguiente, se añade medio para la infección (esto variará dependiendo del virus). Uso CM carece de Pen / Strep contiene BMP4 / A / P, usando 0,5 ml de un pocillo de una placa de 6 pocillos. Añadir virus Sendai para MOI = 1. Incubar durante 8 horas en una incubadora con bajo contenido de oxígeno.
    3. Si los puntos de tiempo adicionales son necesarios, se elimina el medio que contiene el virus después de 4 horas y sustituirla por BMP4 / A / P CM. recoger las célulaspara el aislamiento de ARN usando un rascador de células.
    4. Determinar la eficacia de la infección viral mediante la realización de QRT-PCR para los genes implicados en la respuesta viral 18.

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Resultados

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Visión general de diferenciación in vitro de hPSCs

Este protocolo de diferenciación in vitro comienza con hESCs indiferenciadas cultivadas en MEFs que están transición a alimentador libres condiciones para un paso (Figura 1A). Aunque hemos descrito la diferenciación de hESCs en este protocolo, se utilizó este protocolo para diferenciar con éxito hiPSCs en células trofoblásticas. La transición a ...

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Discusión

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Nosotros presentamos los pasos básicos para diferenciar hESCs en progenitores trofoblasto. Este protocolo ha sido recientemente optimizado para diferenciar rápidamente hESCs con la adición de inhibidores de la activina / señalización nodal, el aumento de la diferenciación a células trofoblásticas y evitando la generación de los progenitores mesodermo, que normalmente se observan con el tratamiento BMP4 solo. El sistema modelo BMP4 permite el examen de las primeras etapas de especificación trofoblasto linaje humano y de ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por un Fondo de Fórmula de Investigación de Salud de Pensilvania.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM/F12Invitrogen11330-057
Knock Out Serum ReplacementInvitrogen10828-028Esto se conoce como "reemplazo de suero" en este protocolo.
NEAAInvitrogen11140-050
FBSInvitrogen16000-044
L-GlutaminaInvitrogen10828-028
Penicilina/EstreptomicinaInvitrogen15140-155
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
B-FGFMilliporeGF-003
DMEMInvitrogen11965-118
DispasaInvitrogen17105-041
Colagenasa tipo IVInvitrogen17104-019
Inhibidor de rocas Y27632Calbiochem688000
MEFs CF1 irradiadosGlobalStem6001GMEFs pueden generarse a partir de embriones de día 13.5 embyos e irradiados.
0,22 y micro; m filtro de jeringaMilliporeSLGS033SS
Heracell 150i incubadora de bajo oxígenoHeracell/VWR89187-192Cualquier incubadora de cultivo de tejidos con capacidad para regular las concentraciones de oxígeno es suficiente.
BMP4R& D Sistemas314-BP-01M
A 83-01R& D Systems2939/10
PD173074R& D Systems3044/10
RNAiMaxInvitrogen13778150
TrizolThermoFisher15596026Trizol se utiliza para aislar el ARN total.
X-tremeGENE 9Roche6365779001
MatrigelCorning 356231Esto se conoce como "matriz extracelular" en este protocolo.

Referencias

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