Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para generar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando la proteína morfogénica ósea 4 e inhibidores de las vías Activina/Nodal. Este método es adecuado para la diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas y puede generar grandes cantidades de células para la manipulación genética.

Resumen

La placenta es el primer órgano de desarrollar durante la embriogénesis y es necesario para la supervivencia del embrión en desarrollo. La placenta está compuesto de varias células trofoblásticas que la diferencian de las células trophectoderm extra-embrionarias de blastocisto preimplantación. Como tal, nuestra comprensión de los eventos tempranos de diferenciación de la placenta humana es limitada debido a las restricciones éticas y legales sobre el aislamiento y la manipulación de la embriogénesis humana. Células madre pluripotentes humanos (hPSCs) son un sistema de modelo sólido para investigar el desarrollo humano y también pueden diferenciarse in vitro en células trofoblásticas que expresan marcadores de los diversos tipos de células trofoblásticas. A continuación, presentamos un protocolo detallado para la diferenciación en células trofoblásticas hPSCs utilizando la proteína morfogenética ósea 4 y los inhibidores de las vías de señalización de Activina / nodal. Este protocolo genera diversos tipos de células trofoblásticas que pueden ser transfectadas con siRNAspara la investigación de fenotipos de pérdida de función o pueden ser infectados con patógenos. Además, hPSCs pueden ser modificados genéticamente y luego diferenciarse en progenitores trofoblásticas para los análisis de ganancia de función. Este método de diferenciación in vitro para la generación de trofoblastos humanos a partir de hPSCs supera las restricciones éticas y legales de trabajar con embriones humanos tempranos, y este sistema se puede utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo el descubrimiento de fármacos y investigación de células madre.

Introducción

Se requiere la placenta para el crecimiento y la supervivencia del feto durante el embarazo y facilita el intercambio de gases, nutrientes, productos de desecho y hormonas entre la circulación materna y fetal. El primer órgano formado durante la embriogénesis de mamíferos es la placenta, que comienza el desarrollo de 6-7 días después de la concepción en los seres humanos y 3.5-4.5 días en ratones ^{1, 2, 3, 4.} Las células trofoblásticas son las células más importantes de la placenta, y estas células representan uno de los acontecimientos más ....

Protocolo

NOTA: Para la diferenciación de cualquiera de hESCs o hiPSCs en progenitores trofoblásticas, hPSCs cultivados en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) son la transición al alimentador libres condiciones para dos pasajes antes de iniciar la diferenciación con BMP4 / A / P. Este proceso elimina la contaminación MEF de células diferenciadas. A continuación, se presenta un protocolo para la diferenciación de células madre, y el mismo protocolo se puede aplicar a hiPSCs.

1. Cultura y recuperación de hESCs irradiados en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) (Preparaciones)

1. Gamma-irradiación de MEFs
   1. Hacer 500 ml de medio ....

Resultados

Visión general de diferenciación in vitro de hPSCs

Este protocolo de diferenciación in vitro comienza con hESCs indiferenciadas cultivadas en MEFs que están transición a alimentador libres condiciones para un paso (Figura 1A). Aunque hemos descrito la diferenciación de hESCs en este protocolo, se utilizó este protocolo para diferenciar con éxito hiPSCs en células trofoblásticas. La transición a .......

Discusión

Nosotros presentamos los pasos básicos para diferenciar hESCs en progenitores trofoblasto. Este protocolo ha sido recientemente optimizado para diferenciar rápidamente hESCs con la adición de inhibidores de la activina / señalización nodal, el aumento de la diferenciación a células trofoblásticas y evitando la generación de los progenitores mesodermo, que normalmente se observan con el tratamiento BMP4 solo. El sistema modelo BMP4 permite el examen de las primeras etapas de especificación trofoblasto linaje humano y de .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	Esto se conoce como "reemplazo de suero" en este protocolo.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamina	Invitrogen	10828-028
Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispasa	Invitrogen	17105-041
Colagenasa tipo IV	Invitrogen	17104-019
Inhibidor de rocas Y27632	Calbiochem	688000
MEFs CF1 irradiados	GlobalStem	6001G	MEFs pueden generarse a partir de embriones de día 13.5 embyos e irradiados.
0,22 y micro; m filtro de jeringa	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i incubadora de bajo oxígeno	Heracell/VWR	89187-192	Cualquier incubadora de cultivo de tejidos con capacidad para regular las concentraciones de oxígeno es suficiente.
BMP4	R& D Sistemas	314-BP-01M
A 83-01	R& D Systems	2939/10
PD173074	R& D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol se utiliza para aislar el ARN total.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning 356231		Esto se conoce como "matriz extracelular" en este protocolo.