Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Resumen

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Resumen

Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis (TB), es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Con el aumento de la propagación de la tuberculosis multirresistente (MDR-TB), existe una urgencia real para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra las infecciones por M. tuberculosis. Tradicionalmente, los compuestos se evalúan en función de su actividad antibacteriana en condiciones de crecimiento in vitro en caldo; sin embargo, los resultados a menudo son engañosos para patógenos intracelulares como M. tuberculosis, ya que las condiciones de detección fenotípica en caldo son significativamente diferentes de las condiciones reales de la enfermedad dentro del cuerpo humano. La detección de inhibidores que actúan dentro de los macrófagos ha sido tradicionalmente difícil debido a la complejidad, la variabilidad de la infección y la lenta tasa de replicación de M. tuberculosis. En este estudio, reportamos un nuevo enfoque para evaluar rápidamente la efectividad de los compuestos sobre la viabilidad de M. tuberculosis en un modelo de infección por macrófagos. Utilizando una combinación de un ensayo de citotoxicidad y un ensayo de viabilidad de M. tuberculosis en caldo, pudimos crear un sistema de cribado que genera un análisis exhaustivo de los compuestos de interés. Este sistema es capaz de producir datos cuantitativos a un bajo costo que está al alcance de la mayoría de los laboratorios y, sin embargo, es altamente escalable para adaptarse a grandes entornos industriales.

Introducción

Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis (TB), es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. TB-Drogas sensible es una enfermedad tratable que requiere múltiples antibióticos para un período de 6 meses. A pesar de ser una enfermedad tratable, la mortalidad por tuberculosis se estimó en 1,5 millones en 2015 ^1. En los últimos 10 años, han aumentado las preocupaciones sobre la prevalencia de resistente a los medicamentos M. tuberculosis. Multirresistente TB (MDR-TB) se define como la tuberculosis que es resistente a al menos isoniazida (INH) y la rifampicina (RMP), y la mayo....

Protocolo

1. cepa bacteriana y el medio de crecimiento

1. Hacer dextrosa albúmina y solución de sal de stock (ADS) por solubilización de 25 g de albúmina de suero bovino, 10,0 g de dextrosa, y 4,05 g de cloruro de sodio en 460 ml de agua desionizada. Filter-esterilizar el ADS y almacenar a 4 ° C.
2. Hacer caldo 7H9 mediante la adición de 4,7 g de 7H9 en polvo y 2 ml de glicerol a 900 ml de agua purificada. Autoclave el caldo 7H9 a 121 ° C durante 10 min y permitir que se enfríe a temperatura ambiente antes de proceder. Hacer 7H9ADST mediante la adición de 100 ml de ADS y 0,5 ml de Tween 80 a 900 ml de caldo 7H9. Almacenar a 4 ° C.
3. Pesar 50 mg de sulfat....

Resultados

Detección intracelular de alto rendimiento usando M. tuberculosis que expresa el gen de la luciferasa

La figura 2A y en la Tabla 1 contienen los datos brutos recogidos por el luminómetro, expresados en unidades luminiscentes relativas (RLU), que muestra el efecto de una concentración creciente de la rifampicina fármaco TB en M. tuberculosis dentro de las células THP-1. L.......

Discusión

El objetivo de este estudio fue la creación de una forma sencilla y rentable método HTS usando un modelo de infección intracelular humano para M. tuberculosis. La tuberculosis es una enfermedad humana caracterizada por la infección de los macrófagos alveolares por M. tuberculosis. Debido a cuestiones de bioseguridad, la investigación con modelos biológicos, tanto de la bacteria y las células huésped se ha utilizado en el pasado. Sin embargo, se ha demostrado que el uso de bacterias portadoras y los mod.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Suero fetal bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albúmina, Bovino pH7	Affymetrix	10857
Dextrosa	Fisher Scientific	BP350
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	BP358
Sulfato de kanamicina	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N- Dimetilformamida (DMF)	Fisher Scientific	D131
1 M Ácido hidrocolérico (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Ácido acético	Fisher Scientific	351269
SDS Fisher	Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glicerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	Colección de cultivos tipo americano	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
Placa blanca de fondo plano de 96 pocillos	Corning	3917
Placa transparente de fondo plano de 95 pocillos	Corning	3595
Sellador de placas transparentes	Espectrofotómetro Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Espectrofotómetro	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Luminómetro	Biotek	Epoch
	Applied Biosystems	Tropix TR717

de microplacas