Métodos para la auto-integración de Megamolecular Biopolímeros en el Aire-LC Interfaz de secado

Resumen

Se proporciona aquí un método para el secado inducida por auto-integración de biopolímeros megamolecular en la interfaz cristalina de aire-líquido. Esta metodología será útil no sólo para la comprensión de los potenciales macroscópicas de biopolímeros, sino también como un método de evaluación para materiales blandos en las áreas biomédicas y ambientales.

Resumen

Los organismos vivos que utilizan el agua son siempre propenso a secarse en el medio ambiente. Sus actividades son impulsadas por micro- basada en biopolímero y estructuras de macro, como se ve en los casos de agua en movimiento en los haces vasculares y la hidratación de agua en capas de la piel. En este estudio, hemos desarrollado un método para evaluar el efecto de soluciones cristalinas líquido acuoso (LC) compuestas de biopolímeros sobre secado. Como biopolímeros LC tienen peso megamolecular, elegimos estudiar polisacáridos, proteínas del citoesqueleto, y el ADN. La observación de las soluciones de biopolímero durante el secado bajo luz polarizada revela milliscale auto-integración a partir de la interfaz de aire-LC inestable. La dinámica de las soluciones acuosas de biopolímero LC se pueden monitorizar mediante la evaporación de agua a partir de una célula con un lado abierto. Mediante el análisis de las imágenes tomadas con luz de polarización cruzada, es posible reconocer los cambios espacio-temporales en el parámetro de orden de orientación. Estamétodo puede ser útil para la caracterización de no sólo los materiales artificiales en diversos campos, pero también tejidos vivos natural. Creemos que va a proporcionar un método de evaluación para materiales blandos en los campos de la biomedicina y ambientales.

Introducción

Al centrarse en las estructuras rígidas, en forma de barra de biopolímeros, materiales blandos dinámicas se han usado para diversas aplicaciones, incluyendo matrices de polisacárido de biopelícula ^1, "geles activos" compuestas de proteínas del citoesqueleto ^2, y "origami de ADN" de las formas deseadas ^3. Para aclarar las propiedades estructurales, muchas estrategias han sido explorados, como la microscopía electrónica de transmisión, microscopía electrónica de barrido, microscopía de fuerza atómica, y la microscopía de fluorescencia confocal. Sin embargo, debido a que estos métodos se llevan a cabo principalmente en un estado seco o estática, es difícil de explicar los comportamientos dinámicos en escalas macroscópicas, como se ve en los sistemas vivos reales. Recientemente, hemos observado con éxito el comportamiento dinámico de biopolímeros en la interfaz aire-LC acuoso a través de la luz polarizada ^4. Durante la visualización de la estructura orientada, mientras que el secado de la biopolímerosolución, los cambios temporales indicados auto-integración de biopolímeros en la interfaz aire-LC inestable.

Aquí, se describe un protocolo para el secado de las soluciones de LC de biopolímero en la interfase aire-LC utilizando instrumentos polarizadas. A diferencia de otros análisis de la fase de LC que no consideran el secado de ^{5, 6,} se investigaron aquí la dinámica de LC durante el proceso de secado mediante la evaluación del parámetro de orden de orientación en la vista lateral de la fase fluida en una celda de un solo lado abierto . La combinación de la evaporación celular y el uso de instrumentos polarizadas permitidos para la vigilancia macroscópica con una dirección evaporación controlada. Además, fue posible validar los registros de secado, centrándose en las estructuras cristalinas de los microdominios adsorbidos, que fueron afectados por el peso molecular, la concentración, etc. Para demostrar la eficacia del método, la pro secadocesos de biopolímeros básicas con formas de varilla rígida, tales como polisacáridos, los microtúbulos (MT), y el ADN, se investigaron. Elegimos estos biopolímeros porque son ejemplos típicos de macromoléculas con pesos jerárquicos megamolecular, y sus interacciones intermoleculares les permiten formar estados LC.

Protocolo

1. Instrumentos

1. dispositivo de polarización
   1. Para construir un dispositivo de polarización, proporcionar una fuente de luz con una lámpara halógena, una guía de luz, polarizadores, una etapa de ejemplo, un carril de óptica, la varilla se encuentra, y una cámara digital reflex de lente única (véase la Figura 1C y Lista de Materiales para la polarización piezas del dispositivo).

2. Preparación de la solución de biopolímero

1. soluciones de polisacáridos
   1. Disolver sacran ⁷ (0,5 g) en agua pura (100 ml) por agitación a ~ 80 ° C durante más de 12 h. Durante la disolución, cubrir el recipiente con una envoltura de plástico para evitar la evaporación. Preparar una solución acuosa de goma de xantano de la misma manera.
   2. Enfriar las soluciones a ~ 25 ° C para obtener soluciones acuosas 0,5% en peso.
   3. Centrifugar la solución sacran para eliminar las impurezas (48.400 xg, 4 ° C, 1 h, 3 timES).
2. solución MT
   1. Preparar una solución de tubulina 0,5% en peso (1 ml) en un tampón Britton-Robinson (80 mM piperazina N, N '-bis (ácido 2-etanosulfónico) (tuberías); 1 mM de ácido etilenglicol-bis (éter β-aminoetil) - N, N, N 'N' tetraacético (EGTA), y 5 mM de _MgCl2, pH 6.8) en hielo ^8.
   2. Utilice solución tubulina 0,5% en peso (50! L) y guanosina-5' - [(α, β) -methyleno] trifosfato (GpCpp) (5 l) para preparar una solución de tubulina GpCpp que contiene (50! L). Incubar a 37 ° C durante 3 h para obtener un núcleo MT estable.
      NOTA: El papel de GpCpp es apoyar la formación de MT y para suprimir completamente la despolimerización de MT a la tubulina.
   3. Mezclar la solución al 0,5% en peso de la tubulina (950! L) y la solución de tubulina GpCpp que contiene (50! L) a ~ 25 ° C durante 1 día para obtener una solución estable MT 0,5% en peso.
3. solución de ADN
   1. Preparar una solución de ADN 0,5% en peso (1 ml) en solución tampón Tris-EDTA (Tris 10 mM, pH 8,0, con EDTA 1 mM).
4. Mantener las soluciones de muestra biopolímero 0,5% en peso a 25 ° C para el experimento de secado.

3. Los experimentos de secado y la observación bajo luz polarizada-Cruz

1. Soluciones en una célula con un lado abierto (Figura 1A)
   1. Cortar una lámina de silicio (ver Lista de Materiales) en una forma apropiada con un espesor de 1 mm (dimensión interior de 5-15 mm, 1 mm, y ~ 20 mm; Figura 1A).
      1. Montar una célula con un lado abierto compuesto por un separador de silicio con dimensión interior de 5-15 mm, 1 mm, y ~ 20 mm y dos portaobjetos de vidrio no modificadas (76 mm x 1 mm x 26 mm). Fijar ambos lados de la célula con clips dobles con antelación para mantener la solución de muestra se escape.
   2. Añadir lentamente cada uno de la solución de biopolímero 0,5% en peso (100-300 l) utilizando un 1-mm pipeta ~ de tamaño de poropunta te a cada célula a ~ 25 ° C. Eliminar burbujas de aire de las células usando una aguja de jeringa.
   3. Colocar las células en un horno con un circulador de aire a 60 ° C bajo presión atmosférica durante la evaporación; la dirección de evaporación es opuesta a la de la gravedad.
2. Observaciones bajo luz polarizada cruzada (Figura 1B-1C)
   1. Proporcionar luz directamente visible a través de una lámpara halógena de 100 W con una fuente de luz de superficie plana en un área amplia (80 mm x 80 mm). Ajuste los polarizadores a 45 ° y 135 ° utilizando los soportes (Figura 1C).
   2. Fijar las posiciones de la fuente de luz, polarizadores, etapa de la muestra, y la cámara utilizando un carril óptico y soportes de varilla (Figura 1C). Coloque la etapa de la muestra entre los dos polarizadores (la distancia entre los polarizadores debe ser ~ 5 cm). Coloque la cámara ~ 20 cm de la etapa de la muestra para permitir el enfoque.
   3. A tiempos dados, colocar las muestras de la etapa 3.1.3 entre la polarizers en el escenario paralelo al plano XZ y cubrir el dispositivo con una cortina de negro; el dispositivo real se muestra en la Figura 1C.
   4. Fotografiar las muestras a través de polarizadores lineales cruzados utilizando una cámara réflex digital con un objetivo zoom estándar (ver Lista de Materiales). Controlar los ajustes de la cámara, como la distancia focal, el uso de programas informáticos (ver Lista de Materiales).
3. Análisis espacio-temporal de la intensidad de luz transmitida (Figura 1C)
   1. Para evaluar el cambio del parámetro de orden de orientación en el proceso de secado, recoger fotografías por hora durante 24 h.
   2. Medir la intensidad de la luz transmitida a lo largo de la línea central en la dirección Z como un valor de gris utilizando un programa de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ).
   3. Trazar la curva del valor de gris como una función de la distancia desde el lado abierto superior.
4. Las observaciones microscópicas bajo ligh de polarización cruzadat (Figura 1D)
   1. Para comprobar los métodos, realizar observaciones microscópicas con un microscopio de polarización equipado con una cámara CCD ^9. Mantenga una placa de retardo de primer orden en la trayectoria luminosa. Controlar las condiciones para las fotos usando un software de PC.

Resultados

Utilizando el dispositivo como se muestra en la Figura 1, la auto-integración de microdominios a macrodomain en un secado se evaluó la interfaz aire-LC (Figura 2A). Como la primera demostración del experimento de secado, dos tipos de polisacáridos megamolecular, sacran (M _w = 1,9 x 10 ⁷ g mol ^-1) y goma de xantano (4,7 x 10 ⁶ g mol ^-1), se compararon. La Figura 2B muestra fo...

Discusión

A veces era difícil para la cámara enfocar la muestra debido a la intensidad de la luz transmitida es demasiado baja. En tales casos, la colocación de una película de plástico transparente extendida en el escenario ayudó a organizar el foco. La limitación de la resolución observable era dependiente de la lente de la cámara, ~ 10 micras en este caso. La limitación observable del espesor de la muestra, Dy, era dependiente de la intensidad de luz máxima de la lámpara, ~ 10 mm en este caso.

La v...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
sacran	Green Science Materials Inc., Japón		De Aphanothece sacrum. Mw = 1.9 × 107 g mol-1
xantana	Taiyo Kagaku Co., Japón	Neosoft XC	de Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 × 106 g mol-1
tubulina	Citoesqueleto, Inc., EE. UU	T240	De cerebro porcino.
GpCpp	Jena Bioscience, Alemania	NU405L
piperazina-N,N′ -bis(ácido 2-etanosulfónico)	Sigma-Aldrichi, Co. LLC.	P6757-500G	PIPES
etilenglicol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-ácido tetraacético	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	342-01314	EGTA
MgCl2-6H2	O Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	135-15055
KOH	Wako Industrias Químicas Puras, Ltd.	162-21813	perdigones
DNA	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	D1626	De testículos de salmón. Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp)
Solución tampón Tris-EDTA	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	T9285-100ML	10 mM Tris, pH 8.0, con vidrio deslizante EDTA de 1 mM
	Matsunami Glass Ind., Ltd., Japón	S1111
lámina de caucho de silicona	Asone Co.	6-611-32	Espesor: centrífuga de 1 mm
	Beckman-Coulter, Inc., EE. UU	Avanti J-25	equipado con una fuente de luz de rotor JA-20
	Sumita Optical Glass, Inc., Japón	de luz LS-LHA
	Sumita Optical Glass, Inc., Japón	GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)	80 mm y veces;
Lámpara halógena	Ushio Inc., Japón	JCR 15V150WBN
titular	Sigmakoki, Co., Ltd.	Etapa de muestra KMH-80
	Sigmakoki, Co., Ltd.	TARW-25503L
portamuestras	Sigmakoki, Co., Ltd.	Caña SHA-25RO
	Sigmakoki, Co., Ltd.	ROU-12-40
soporte de postes	Sigmakoki, Co., Ltd.	Soporte de postes RS-6-40
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Soporte de postes RS-12-60
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Soporte de postes RS-12-80
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Portador RS-12-130
	Sigmakoki, Co., Ltd.	Soporte de cámara CAA-25LS
	Sigmakoki, Co., Ltd.	CMH-2
	Sigmakoki, Co., Ltd.	OBA-500SH
tubo de lente	Tomytech, tubo de lente BORG	BK	80φ, L25 mm
tubo	de lente Tomytech, tubo de lente BORG	BK	80φ, L50 mm
	multibanda Tomytech, BORG		80φ
Placa	V Tomytech, BORG	Placa V 60S soporte de
placa	Viexen, Co., Ltd.	soporte de placa SX
EOS Kiss X7i	Canon Inc., Japón	8594B001	con un objetivo zoom estándar,  Software fotográfico EFP 18-55 mm
	Canon Inc., Japón	EOS Utility
PC	Microsoft	Microscopio
	Olympus	BX51
placa de retardo de primer orden	Olympus	U-TP530	λ = 530 nm
Cámara CCD	Olympus	DP80
software fotográfico		Olympus	cellSens
	Institutos Nacionales de Salud	ImageJ