Los análisis de linaje celular y el gen de Estudios de la función Uso MARCM Twin-situ

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para una técnica de etiquetado mosaico que permite la visualización de las neuronas derivadas de una célula progenitora común en dos colores distintos. Esto facilita el análisis de linaje neural con la capacidad de las neuronas individuales de nacimiento actualización y el estudio de la función de genes en las mismas neuronas de diferentes individuos.

Resumen

M osaic un nálisis con un r epressible c ell m Arker (MARCM) es un sistema de etiquetado mosaico positivo que se ha aplicado ampliamente en Drosophila estudios neurobiológicos para representar intrincados morfologías y manipular la función de los genes en subconjuntos de neuronas dentro de otra manera sin marcar y no perturbado organismos. mosaicos genéticos generados en el sistema MARCM están mediados a través de la recombinación específica de sitio entre cromosomas homólogos dentro de la división de las células precursoras para producir ambos marcados (clones MARCM) y células hijas durante la mitosis sin marcar. Una extensión del método MARCM, llamado MARCM de doble punto (tsMARCM), etiquetas, tanto de las células individuales derivados de un antepasado común con dos colores distintos. Esta técnica fue desarrollada para permitir la recuperación de información útil a partir de los dos hemi-linajes. Por exhaustivamente el análisis de diferentes pares de clones tsMARCM, el sistema permite tsMARCM de alta resolución linaje neuronal mapping para revelar la exacta orden de nacimiento de las neuronas marcadas producidos a partir de células progenitoras comunes. Además, el sistema también se extiende tsMARCM estudios de la función de genes permitiendo que el análisis fenotípico de las neuronas idénticas de diferentes animales. A continuación, describimos cómo aplicar el sistema tsMARCM para facilitar los estudios de desarrollo neural en Drosophila.

Introducción

El cerebro, compuesto de un gran número y diversidad de tipos de neuronas, dota a los animales con la capacidad de percibir, procesar y responder a los desafíos del mundo externo. Las neuronas del adulto Drosophila cerebro central se derivan de un número limitado de células madre neuronales, llamadas neuroblastos (NBS), durante el desarrollo ^{1, 2.} La mayor parte del NBS participar en la neurogénesis del cerebro en Drosophila someterse a la división asimétrica para generar RN auto-renovación y células madre ganglio (GMCs), y los GMC y luego ir a través de otra ronda de división para producir ....

Protocolo

1. Construir moscas tsMARCM-Ready mediante la Requerido Los transgenes ^{11, 13}

1. Generar la versión original de moscas tsMARCM listas de transgenes que son transportados por las moscas individuales ¹¹ (ver Tabla 1). Realizar esquemas estándar de moscas genéticos de cruce, que se han descrito anteriormente, poniendo múltiples transgenes en las mismas poblaciones de mosca ^13.
   1. En una línea parental, montar los transgenes de FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (la primera reportero, mCD8 :: GFP; la expresión del tr....

Resultados

El sistema tsMARCM se ha utilizado para facilitar linaje neural análisis y estudios de la función génica mediante la recuperación de información importante sobre las neuronas derivadas de NBS comunes. El sistema ha sido utilizado para identificar la mayoría (si no todos) los tipos neuronales, determinar el número de células de cada tipo neuronal, y determinar el orden de nacimiento de estas neuronas ^{11, 12,}

Discusión

Los pasos críticos dentro del Protocolo

Los pasos 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 y 3.2 son fundamentales para la obtención de buenos resultados tsMARCM. Conductores Gal4 específicos de tejido que no expresan GAL4 en progenitores neurales son los preferidos para los pasos de 1.1.1 y 1.2.1. Evitar el hacinamiento de los animales criados en los viales mosca de comida en el paso 2.3. Debido a que la latencia de inducción, el nivel de expresión de FLP al choque térmico, y el tiempo medio de separac.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dióxido de carbono (CO2)	Proveedor local	n.a.Anestesiar	moscas
CO2 Proveedor	local	n.a.Clasificar	, cruzar y transferir moscas
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (u otros proveedores)	PBS001	Diseccionar, enjuagar, lavar e inmunotinción cerebros de moscas
Formaldehído	Sigma-Aldrich	252549	Arreglar cerebros de moscas
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Enjuagar, lavar e inmunotinción cerebros de mosca
Cabra normal	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Suero
Anticuerpo CD8 anti-ratón Anticuerpo CD8	de rata Invitrogen		MCD0800 Cerebros de mosca inmunotinción
Anticuerpo anti-DsRed anticuerpo	Clonetech	632496	Cerebros de mosca con inmunotinción
Anticuerpo anti-Brp en ratones	Estudios de desarrollo Banco de hibridomas	nc82	Cerebros de mosca con
inmunotinciónAnticuerpo IgG anti-rata de cabra conjugado con Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Cerebros de mosca inmunostain Anticuerpo
IgG anti-conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Cerebros de mosca con inmunotinción
Anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Cerebros de mosca inmunostain
Reactivo antidecoloración de oro SlowFade	Sondas moleculares	S36936	Monte cerebros de mosca y proteja el apagado de la fluorescencia
Placa puntual de vidrio de depresión PYREX 9	Corning	7220-85	Diseccionar, enjuagar, lavar e inmunoteñir cerebros de mosca Kit de
elastómero de silicona Sylgard 184	World Precision Instruments	SYLG184	Hacer platos Sylgard negros para proteger las pinzas durante la disección del cerebro
Carbón activado	Sigma-Aldrich	242276-250G	Hacer platos Sylgard negros
Pinzas Dumont #5	Fine Science Herramientas	11252-30	Diseccionar y montar cerebros de mosca
Micro portaobjetos	Corning	2948-75x25	Montar cerebros de mosca Micro
cubreobjetos Nº 1.5	VWR International	48366-205	Montar cerebros de mosca
Esmalte de uñas	Proveedor local	no disponible	Sellar micro cubreobjetos en microportaobjetos
Incubadora	LTI603	Kansin Instruments	vuela a 25 ° C
(u otros proveedores)
Baño de agua	Kansin Instruments	WB212-B2	Inducir choque térmico en moscas a 37 ° C
(u otros proveedores)
Agitador orbital	Kansin Instruments	OS701	Lavado e inmunotinción de cerebros de mosca
(u otros proveedores)
Microscopio de disección	Leica	EZ4	Clasificación, cruce y transferencia de moscas; Diseccionar, enjuagar, lavar e inmunoteñir cerebros de mosca
Microscopio confocal	Zeiss (u otros proveedores	)LSM 700 (u otros modelos)	Imagen Clones
de MARCM Software de procesamiento de imágenes 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	no disponible	Pilas de proyectos de software de procesamiento de imágenes confocales
2 (e.g., ImageJ)	no disponible	no disponible	Recuento del número de células de los clones de tsMARCM

de cerebros de mosca inmunotinción La cultura de