Un sistema de cultivo en 3D basado en Insertar rápido de filtro para la próstata primario Diferenciación Celular

La identificación y el uso de terapias contra el cáncer que se personalizan a los individuos son un objetivo principal en la investigación del cáncer. Recientemente, nuevos enfoques han sido desarrollados que permiten una mayor facilidad en el establecimiento de cultivos de células primarias, proporcionando potencialmente formas tanto de identificar y probar terapias personalizadas. Por ejemplo, la próstata basado en la R-espondina enfoque organoide ¹ permite para el cultivo en tres dimensiones (3D) de las células normales y metastásicas de cáncer de próstata en una matriz extracelular comercial (por ejemplo, Matrigel), mientras que el Condicionalmente reprogramación de células método (CRC) desarrollado en Georgetown ^{2, 3} utiliza más condiciones de cultivo 2D estándar. Específicamente, la combinación de un inhibidor de la cinasa Rho (Y-27632) y células alimentadoras de fibroblastos murinos J2 irradiados conducen al cultivo indefinido de CRCs de queratinocitos ^2. La metodología es CRCextremadamente robusto, con líneas de células primarias establecidas y mantenidas indefinidamente de la próstata y muchos otros tejidos epiteliales normales y malignos ³ con éxito. Es importante destacar que, nuestra tecnología CRC permitió la rápida identificación de la base etiológica de la papilomatosis respiratoria recurrente en un paciente que había fallado un número de tratamientos con fármacos anteriores. Además, el uso de los CRC normales y derivados del tumor, la identificación con éxito de un fármaco aprobado por la FDA, vorinostat, se hizo dos semanas después de la biopsia de tejido inicial. El paciente fue colocado en vorinostat, lo que resulta en el éxito del tratamiento de la enfermedad ^4.

La glándula de la próstata normal se compone de luminal, basal y las células neuroendocrinas raros ^5. células luminales forman la capa epitelial columnar de la glándula y expresan el receptor de andrógenos (AR), así como otros marcadores luminales tales como citoqueratinas 8 y 18 y proantígeno específico de estado (PSA) ^6. Por el contrario, las células basales se localizan debajo de la capa luminal y expresan citoqueratina 5 y p63, pero los niveles bajos de la AR ^5. Nos ^{7, 8, 9} y otros ¹⁰ han utilizado con éxito los CRC de próstata en las investigaciones mecanicistas sensibilidad a los fármacos preclínicos. Sin embargo, cuando se cultivan bajo condiciones estándar de cultivo de tejidos 2D, estas células no totalmente acoplan AR señalización ^10. Es importante destacar que, cuando se coloca debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes, los CRC recuperó próstata arquitectura y la función glandular normal, lo que indica que CRCs de próstata conservan su compromiso de linaje cuando se coloca en un ambiente permisivo. El desarrollo del sistema de cultivo celular a base de inserto de filtro aquí descrito permite la rápida (2 semanas) la diferenciación in vitro de CRC de la próstata como lo demuestra by el aumento de la expresión de los genes diana Ar y Ar, así como disminución de los niveles de p63.

Los elementos filtrantes utilizados contienen membranas de policarbonato (tamaño de poro, 0,4 micras) que pueden apoyar el cultivo de células de mamíferos. El sistema, como se desarrolló, hace uso de CRCs de próstata normales y malignas, placas de cultivo de 6 pocillos y los insertos de filtro. Medios de cultivo celular acondicionado por células J2 ¹¹ se coloca en los medios de cámara y de próstata diferenciadores de fondo en la cámara superior. Las técnicas descritas en el presente documento apoyan la diferenciación de células de próstata luminal a menos de 2 semanas de duración, en consonancia con los objetivos de la medicina personalizada. También era imperativo desarrollar las metodologías que permitan el perfilado molecular, genética y celular completa de las culturas. Enfoques para el aislamiento de ADN, ARN y proteínas a partir de células liberadas de la superficie del filtro se han desarrollado y simplificado para el procesamiento de muestras exacta repetición. Finally, la metodología necesaria para retirar el filtro para permitir la incrustación, el corte y para H & E, inmunohistoquímica y tinción de inmunofluorescencia, se describe completamente.

1. Establecimiento de la célula 3D Sistema de cultivo Insertar

1. Coloque 2 policarbonato insertos de cultivo celular en una orientación invertida (lado del filtro hacia arriba) en una placa de 6 pocillos (Figura 1A).
2. Aplicar una capa delgada de 0,1% de gelatina en agua a la parte inferior de la pieza de inserción y dejar secar (10-20 min) en una cabina de seguridad biológica para mantener la esterilidad.
3. Repita el paso 1.2 dos veces más para un total de 3 aplicaciones de gelatina al 0,1% en los insertos.
   NOTA: El recubrimiento de gelatina ayudará a la difusión límite entre las cámaras.
4. Para recoger los CRC primarias de condiciones de cultivo estándar, añadir 5 ml de PBS para lavar el frasco de cultivo.
   1. Tripsinizar las células utilizando (1 ml para un T-25 y 2 ml de una T-75) 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 min a 37 ° C. Golpear suavemente el lateral del matraz para ayudar a desalojar las células. A continuación, proceder para detener la reacción tripsina y recoger las células mediante la adición de 5 ml de DMEM completo.
   2. Recoger las células en un tubo de 15 ml. Centrifugar el tubo a 4 ° C y 188 xg y contar utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
   3. Vuelva a suspender 600.000 CRC en 250 l de medios (CM) acondicionado y añadir a la inserción de cultivo orientada correctamente (lado del filtro hacia abajo) (Figura 1B). Esto se conoce como la cámara interior.
      Nota: CM es F-medio condicionado por células J2 irradiados y contiene 10 micras Y-27632 como se describió previamente ^{7, 8, 9, 11.}
5. Aplicar 2 ml de CM a la cámara exterior de la placa de 6 pocillos y se incuba a 37 ° C durante la noche (durante al menos 18 h).
6. Retire cuidadosamente la CM en la cámara interior con un 1 ml o pipeta 200 l y se añade lentamente medio de diferenciación (DM) a la cámara interior con una pipeta de 1 ml hasta completa. Tenga cuidado de no perturbar la capa de células.

1. Compruebe las culturas cada día. Las células sanas aparecen como se muestra en la Figura 2.
2. Cambiar el CM en la cámara exterior cada día o cada dos días dependiendo de la metabolismo de las células.
3. Cuando los medios de comunicación de la cámara cambia de color interior (amarillo), retire con cuidado los medios de comunicación en la cámara de filtro interior con un 1 ml o 200 l pipeta.
4. Aspirar los medios de comunicación en el pozo cámara de placa exterior 6 con una punta de aspiración.
5. Usando una pipeta de 1 ml, aplicar lentamente MS nueva a la cámara interior hasta que se llene. Tenga cuidado de no raspar o de otro modo desalojar a la capa de células.
6. Vuelva a colocar los medios de comunicación en la cámara exterior con 2 ml de CM fresco.
7. Mantener los cultivos durante 2 semanas, y luego proceder a la transformación para el aislamiento bimolecular deseada.
   NOTA: Cada fila de la placa de 6 pocillos, un total de seis inserciones (Figura 1B), debe ser procesado por experimento para adquirir suficientes células para DNA, ARN o proteína para el análisis.
8. Aspirar los medios de comunicación en la cámara exterior y enjuague con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
9. Retirar con cuidado los medios de comunicación de la cámara interior con un 1 ml o 200 l pipeta y añadir 500 l de PBS. Evitar raspando o de otra manera perturbar las células de la membrana.
10. Aspirar PBS de la cámara exterior y con cuidado eliminar PBS de la cámara interior con un 1 ml o 200 l pipeta. Una vez que el PBS se ha eliminado, proceder directamente a la aplicación correspondiente se detalla a continuación. No permita que la membrana se seque. El cultivo puede mantenerse brevemente en el PBS hasta que la aplicación está listo para comenzar.

3. Tratamiento de los filtros para Pellet Banca

1. Añadir 100 ml 0,25% de tripsina-EDTA a cada cámara interior y se incuba durante 5 min a 37 ° C.
2. Brevemente y cuidadosamente agitan / raspan las células de la superficie de la membrana con una pipeta de 200 l mientras pipeteando arriba y abajo (evitar puncturing la membrana). Incubar durante 1 min a 37 ° C.
3. Añadir 250 l de CM a la primera cámara interior y la pipeta hacia arriba y abajo con suavidad para enjuagar el filtro.
4. Transferencia de células resuspendidas a la cámara de filtro adyacente que contiene las mismas condiciones de los medios y repetir pipeteando arriba y abajo.
5. Repita este procedimiento para cada una de las inserciones de una sola condición. Recoger y transferir las células a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
6. Enjuague cada cámara interior con un 100-200 l adicional de CM para recoger cualquier resto de las células. Añadir al tubo de centrífuga de 1,5 ml en el paso 3.5.
7. Girar las células a 423 xg en una microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min.
8. Aspirar el sobrenadante y se lava el sedimento celular una vez con 1000 l de PBS.
9. Girar de nuevo a 423 xg en una microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min.
10. Aspirar el PBS y se congelan a -80 ° C para su uso posterior.

4. Tratamiento de los filtros para el ARN o ADN Aislamiento

El sistema basado en el cultivo de células de inserción es un procedimiento relativamente simple y rápido para la producción de los cultivos 3D de CRCs de próstata que apoya la diferenciación de células luminal. Un esquema del sistema se muestra (Figura 1A) poner de relieve la aplicación del recubrimiento de gelatina a la superficie inferior del inserto de filtro. Los insertos solamente se vuelcan para la aplicación de la gelatina. En la Figura 1B los filtros están en la orientación apropiada para el cultivo. El uso de un inserto de células transparentes, se muestra una imagen representativa de una cultura sana 3D CRC de próstata (10 veces) (Figura 2). La densa estratificación de CRC sanos demostrado es típico después del establecimiento y se puede visualizar mediante microscopía de luz estándar. Durante el establecimiento inicial, es crítico para visualizar la capa de células formadas para garantizar que el método es compatible con una línea celular dada y que la unión adecuada y laYering de las células se han producido.

HEA se aplica a la parte interior de la pieza de inserción como se describe anteriormente. Después de la aplicación de la HEA, se debe tener cuidado al anotar el filtro para quitarlo de la inserción (Figuras 3A, 3B). En todas las etapas (Figuras 3A-3D), la atención también deben tomarse medidas para minimizar el movimiento innecesario de la capa de HEA en el filtro con las células. La capa de CRC puede ser fácilmente alterada y dañado durante la transferencia a la H & E casete (Figura 3D). Después de la escisión del filtro recubierto de HEA desde el barril de plástico (Figuras 3A-3C), el filtro puede ser reducido a la mitad y se procesa para seccionar y tinción utilizando cassettes de inclusión estándar (Figura 3D). Dividiendo el filtro por la mitad es importante aprovechar al máximo la superficie disponible para la sección transversal en H & E y SI.

tinción de inmunofluorescenciaasí como de campo brillante (BF) se recogieron imágenes de las células cultivadas sobre la capa de filtro usando un microscopio confocal con capacidades de ESD (unidad de digitalización de disco) de disco giratorio. Los resultados representativos para la histología y tinción H & E se muestran en una sección transversal del inserto de filtro y las células (20X) (Figura 4). Con el cuidado adecuado, se demuestra que una capa de CRC en los cartuchos de filtro puede ser seccionadas y teñidas, ya que es una práctica estándar para el estudio histológico del tejido. Durante el corte, es posible que el CRC que se desprendan del filtro como una capa intacta de células como se ha demostrado (Figura 4). La imagen muestra BF estratos de células de múltiples capas en la parte superior de la membrana porosa (Figura 5A). Las imágenes individuales fluorescentes para núcleos (DAPI, la Figura 5B), p63 (Figura 5C) y la AR (Figura 5D) se muestran, como es la fusión de los tres marcadores de fluorescencia (Figura 5E). Por último, un composite BF y SI se muestra superposición (Figura 5F), el establecimiento de la localización de la señal de fluorescencia con respecto a las células y el filtro. La superposición de la mancha DAPI con el p63 SI tinción demuestra claramente algunas células todavía en un estado proliferativo. La localización de AR SI tinción en el núcleo es indicativo de reactivación funcional de AR en células de la próstata.

Una comparación entre la IF de nuestro sistema de inserción de filtro y un tejido de la próstata en sección se muestra (Figuras 6A, 6B) para demostrar la similitud en el desarrollo de nuestra capa CRC inserto a la del epitelio prostático. El conducto de próstata muestra la expresión de p63, en consonancia con las células basales de próstata. tinción de p63 también se ve en las CRCs sobre el inserto. Se observó un mayor porcentaje de células que expresan p63 en nuestra inserción en comparación con la sección de tejido intacto. Además, tanto nuclear y citoplásmica AR se ven en la tis próstata demandar sección y mientras que los CRCs en el programa inserto de filtro expresión menos en general AR, tanto la expresión AR nuclear y tinción citoplásmica es vista, similar a la próstata intacta.

Figura 1: Imágenes representativas de la placa de cultivo de 6 pocillos y Insertar que componen el sistema de cultivo 3D. (A) insertos invertidos para la aplicación del recubrimiento de gelatina a la parte inferior del filtro (flecha). Una imagen más grande de la pieza de inserción y el filtro es espectáculo (recuadro). (B) insertos colocados correctamente. Las cámaras interior y exterior del sistema se muestran (flechas). La fila en caja en B muestra cómo múltiples muestras se obtienen para una determinada condición experimental. A la conclusión del periodo de crecimiento 2 semanas estos insertos se pueden agruparon para obtener material suficiente para el análisis."Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: una imagen representativa de una capa de sana CRC sembradas sobre un filtro de membrana transparente se muestra. Ambas cámaras interior y exterior contenían medio condicionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: una imagen representativa de un filtro Reducido a la mitad en dos secciones y se colocaron en un casete de parafina para incrustar. (A) Colocar el filtro con recubrimiento HEA después de anotar y antes de la retirada. (B) El inserto de filtro liberado del barril de policarbonato. ( (D) La colocación correcta y la orientación de las dos mitades en el interior del casete de la incrustación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Una sección teñida Cruz Representante H & E del cartucho del filtro y Células (20X). Se muestran tanto la membrana (parte inferior) y la capa de células (arriba). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Una serie de Representante campo brillante (BF) e inmunofluorescencia (IF) Imágenes deLas células se seccionaron en el filtro (40X). se muestran secciones transversales del filtro y las células. Una imagen BF sin teñir de las células en la superficie del filtro (5A) se acompaña de imágenes para el núcleo DAPI manchado (5B) y la tinción de inmunofluorescencia de dos proteínas diferentes, p63 (5C) y el receptor de andrógenos (AR, 5D). Una superposición de material compuesto de las secciones de células (5E, F) define la localización de las señales de IF en el contexto de las células y de filtro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Un representante de inmunofluorescencia (IF) Imagen de células seccionados en el filtro contra una sección de próstata epitelio de tejidos (20X).Una imagen de la sección transversal de nuestra inserción del filtro se muestra (Figura 6A) en comparación con las capas del epitelio ductal de una próstata intacta (Figura 6B). La tinción de p63, la AR y el núcleo se llevó a cabo como en la Figura 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.