Un sistema de cultivo en 3D basado en Insertar rápido de filtro para la próstata primario Diferenciación Celular

El objetivo general de este sistema de cultivo 3D basado en insertos de filtro para células primarias derivadas de pacientes es establecer un sistema de modelo in vitro más relevante biológicamente para la investigación del cáncer de próstata. Mediante el uso de células humanas primarias, este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del desarrollo de la próstata, así como en el cáncer de próstata. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de una metodología in vitro relativamente rápida para el establecimiento de células prostáticas primarias diferenciadas que también permite el aislamiento rápido de biomoléculas como ARN, ADN y proteínas.

La demostración visual de estos métodos es fundamental, ya que el procesamiento de las células en el inserto del filtro para la histología o para la recolección de ARN y proteínas es delicado y sensible al tiempo. Para ayudar a limitar la difusión entre las cámaras en una cabina de seguridad biológica, aplique una capa delgada de gelatina al 0,1% en la parte inferior de los insertos y déjelos secar. Repita este procedimiento dos veces más.

A continuación, aplique las células en la cámara interior de los insertos recubiertos de gelatina y cultívelas durante un máximo de dos semanas. Después de dos semanas, aplique los insertos de filtro cultivados directamente a una de las aplicaciones posteriores apropiadas que se detallan a continuación. Para comenzar este procedimiento, aspire el PBS de la cámara exterior y retírelo con cuidado de la cámara interior.

Los insertos cultivados se pueden mantener brevemente en PBS hasta que la aplicación esté lista para comenzar, pero no permita que la membrana se seque. A continuación, añada 100 microlitros de EDTA de tripsina al 0,25% en cada cámara interior. Luego incubarlos durante cinco minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, raspe breve y cuidadosamente las células de la superficie de la membrana con una pipeta de 200 microlitros mientras pipetea hacia arriba y hacia abajo. Luego incubarlos durante un minuto a 37 grados centígrados. Después de un minuto, agregue 250 microlitros de medio acondicionado a la primera cámara interna y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para enjuagar el filtro.

Después de esto, transfiera las celdas resuspendidas a la cámara de filtro adyacente que contenga las mismas condiciones de medio y repita el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Repita este procedimiento para cada una de las inserciones de una sola condición. A continuación, recoge las células y transfiérelas a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.

Enjuague cada cámara interna con 100 a 200 microlitros adicionales de medios acondicionados para recolectar las celdas restantes y agréguelas al tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, haga girar las células en una microcentrífuga a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, aspire el sobrenadante y lave el pellet celular una vez con 1.000 microlitros de PBS.

Vuelva a girar las células en una microcentrífuga a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de cinco minutos, aspire el PBS y congele la muestra a menos 80 grados centígrados para su uso posterior. En este procedimiento, agregue 200 microlitros de tiocianato de guanidinio, fenol, cloroformo o un reactivo de extracción similar a la cámara interna y agite brevemente las células en la superficie de la membrana pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

A continuación, incubar las células en el reactivo de extracción durante cinco minutos a temperatura ambiente y dejar seca la cámara exterior. A continuación, lave la membrana del filtro pipeteando la solución de extracción hacia arriba y hacia abajo. Recoja la mayor cantidad posible de reactivo de extracción inclinando la placa de seis pocillos y aspirando cualquier líquido residual.

Tenga en cuenta que el filtro puede disociarse del inserto. Lave la membrana del filtro disociada si está colocada. A continuación, recoja la mayor cantidad posible de reactivo de extracción y siga el protocolo del fabricante para la purificación y recuperación de ADN, ARN o proteína.

Se debe tener cuidado al lavar las células y filtrar con tiocianato de guanidinio, ya que una agitación excesiva puede producir ARN de mala calidad. Para aislar la proteína del inserto del filtro, coloque el inserto del filtro en la placa de seis pocillos sobre hielo. A continuación, añada 10 microlitros de tampón de lisis de proteínas a la cámara interior.

Agite y raspe las células en la superficie de la membrana con una pipeta de 20 microlitros mientras pipetea hacia arriba y hacia abajo y evite generar burbujas en el tampón de lisis. Después, incube la placa de seis pocillos con insertos de filtro en hielo durante diez minutos. Repita el raspado y luego enjuague la superficie de la membrana con el tampón de lisis.

Recoja los lisados de los seis insertos y transfiéralos a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros con hielo. A continuación, enjuague la primera membrana con 10 microlitros adicionales de tampón de lisis y transfiérala al siguiente filtro. Repita este procedimiento para todos los insertos de una condición experimental dada, recolectando cualquier solución tampón de lisis residual y agréguela al tubo de 1,5 mililitros.

Incube la muestra en hielo durante cinco minutos más. A continuación, gíralo a máxima velocidad durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez finalizado, pipetee el lisado en un tubo nuevo de 1,5 milímetros.

A continuación, proceda al análisis de la concentración de proteínas o almacene los lisados a menos 80 grados centígrados. En este procedimiento, agregue 500 microlitros y un mililitro de NBF al 10% a la cámara interna y externa respectivamente. Incubarlos durante la noche a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, aspire NBF de la cámara exterior y agregue un mililitro de gel de procesamiento HEA a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Derrita lentamente la agarosa en un microondas a baja potencia y repita pulsos de 10 segundos hasta que la agarosa se derrita. Mantenga el HEA en un baño tibio a 37 grados centígrados para evitar la solidificación hasta que esté listo para usar.

A continuación, retire el NBF de la cámara interior. Aplique 25 microlitros de HEA fundido en la cámara interior y deje que la agarosa se solidifique durante dos a cinco minutos. A continuación, humedezca dos almohadillas de histología de espuma en NBF al 10% y coloque una almohadilla en un casete de inclusión.

Salvaguardar la integridad de las capas celulares en el inserto del filtro utilizando HistoGel es un paso crítico para la preservación de la capa celular intacta para el corte histológico. Después de eso, use un bisturí de hoja número 11 para marcar el filtro desde la parte inferior de la cámara del inserto de plástico, liberándolo parcialmente. Coloque 100-200 microlitros de NBF en una placa de Petri y sumerja el filtro parcialmente desplazado en el NBF.

Con un bisturí de cuchilla número 10, presione suavemente contra el centro del filtro desde el interior de la cámara de inserción para desalojar completamente el filtro del cilindro de inserción. Si hay alguna parte del filtro que todavía esté unida al barril, córtala con el bisturí. A continuación, corte el filtro recubierto de HEA por la mitad.

Coloque cada mitad del filtro en la almohadilla de espuma en el casete de histología preparado. A continuación, añade la segunda esponja empapada al 10%NBF en el casete, intercalando el filtro. A continuación, selle el casete.

Colócalo en NBF e incubalo durante la noche. Esta imagen de campo claro muestra estratos celulares de múltiples capas en la parte superior de la membrana porosa. Se muestran las imágenes fluorescentes individuales para los núcleos, P63 y el receptor de andrógenos, así como la fusión de los tres marcadores de fluorescencia.

Por último, se muestra una superposición compuesta de campo claro e inmunofluorescencia, que establece la localización de la señal fluorescente en relación con las células y el filtro. Aquí se muestra una imagen transversal de nuestro inserto filtrante, en comparación con las capas epiteliales ductales de una próstata intacta. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos semanas, con un aislamiento final de las células y el inserto de filtro o la biomolécula deseada en menos de 30 minutos si se realiza correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar siempre tener cuidado al trabajar con los insertos de filtro, para que no se dañe la capa celular o el filtro subyacente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los Western blots, los microarrays de ARN y los análisis de proteomas, para responder a preguntas adicionales relacionadas con el análisis de vías y las células cancerosas. Esta técnica ayudará a allanar el camino para que los investigadores en el campo del cáncer de próstata exploren mejor la biología de la próstata, así como los fundamentos del cáncer de próstata utilizando células prostáticas primarias.

Después de ver este video, debería tener una excelente comprensión de cómo configurar y recuperar correctamente las células prostáticas primarias cultivadas de este sistema de cultivo en 3D.