Name: Un sistema de cultivo en 3D basado en Insertar rápido de filtro para la próstata primario Diferenciación Celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprende a establecer un sistema de cultivo 3D con insertos de filtro para células prostáticas primarias diferenciadas. Este método permite el aislamiento rápido de ARN, ADN y proteínas para investigación oncológica.

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Esta investigación fue apoyada por T32 (CA 9686-18) y TL1 (TL1TR001431) premios beca de formación post-doctoral (LT), del Departamento de Defensa PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), así como U01 PAR-12-095 (Kumar) y CA051008-21 P30 (Weiner). la fijación de la muestra, el seccionamiento y tinción se realizó en el Lombardi Comprehensive Cancer Center Histología y Tejidos de recursos compartidos. Agradecemos a Richard Schlegel útil para los debates. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Cáncer o los Institutos Nacionales de Salud.

1. Establecimiento de la célula 3D Sistema de cultivo Insertar <ol><li> Coloque 2 policarbonato insertos de cultivo celular en una orientación invertida (lado del filtro hacia arriba) en una placa de 6 pocillos (Figura 1A). </li><li> Aplicar una capa delgada de 0,1% de gelatina en agua a la parte inferior de la pieza de inserción y dejar secar (10-20 min) en una cabina de seguridad biológica para mantener la esterilidad. </li><li> Repita el paso 1.2 dos veces más para un total de 3 aplicaciones de gelatina al 0,1% en los insertos. NOTA: El recubrimiento de gelatina ayudará a la difusión límite entre las cámaras. </li><li> Para recoger los CRC primarias de condiciones de cultivo estándar, añadir 5 ml de PBS para lavar el frasco de cultivo. <ol><li> Tripsinizar las células utilizando (1 ml para un T-25 y 2 ml de una T-75) 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 min a 37 ° C. Golpear suavemente el lateral del matraz para ayudar a desalojar las células. A continuación, proceder para detener la reacción tripsina y recoger las células mediante la adición de 5 ml de DMEM completo. </li><li> Recoger<html> las células en un tubo de 15 ml. Centrifugar el tubo a 4 ° C y 188 xg y contar utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro. </li><li> Vuelva a suspender 600.000 CRC en 250 l de medios (CM) acondicionado y añadir a la inserción de cultivo orientada correctamente (lado del filtro hacia abajo) (Figura 1B). Esto se conoce como la cámara interior. Nota: CM es F-medio condicionado por células J2 irradiados y contiene 10 micras Y-27632 como se describió previamente 7, 8, 9, 11. </li></ol></li><li> Aplicar 2 ml de CM a la cámara exterior de la placa de 6 pocillos y se incuba a 37 ° C durante la noche (durante al menos 18 h). </li><li> Retire cuidadosamente la CM en la cámara interior con un 1 ml o pipeta 200 l y se añade lentamente medio de diferenciación (DM) a la cámara interior con una pipeta de 1 ml hasta completa. Tenga cuidado de no perturbar la capa de células. </li></ol>Le &quot;&gt; 2. Mantenimiento de las Culturas 3D <ol><li> Compruebe las culturas cada día. Las células sanas aparecen como se muestra en la Figura 2. </li><li> Cambiar el CM en la cámara exterior cada día o cada dos días dependiendo de la metabolismo de las células. </li><li> Cuando los medios de comunicación de la cámara cambia de color interior (amarillo), retire con cuidado los medios de comunicación en la cámara de filtro interior con un 1 ml o 200 l pipeta. </li><li> Aspirar los medios de comunicación en el pozo cámara de placa exterior 6 con una punta de aspiración. </li><li> Usando una pipeta de 1 ml, aplicar lentamente MS nueva a la cámara interior hasta que se llene. Tenga cuidado de no raspar o de otro modo desalojar a la capa de células. </li><li> Vuelva a colocar los medios de comunicación en la cámara exterior con 2 ml de CM fresco. </li><li> Mantener los cultivos durante 2 semanas, y luego proceder a la transformación para el aislamiento bimolecular deseada. NOTA: Cada fila de la placa de 6 pocillos, un total de seis inserciones (Figura 1B), debe ser procesado por experimento para adquirir suficientes células para DNA, ARN o proteína para el análisis. </li><li> Aspirar los medios de comunicación en la cámara exterior y enjuague con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Retirar con cuidado los medios de comunicación de la cámara interior con un 1 ml o 200 l pipeta y añadir 500 l de PBS. Evitar raspando o de otra manera perturbar las células de la membrana. </li><li> Aspirar PBS de la cámara exterior y con cuidado eliminar PBS de la cámara interior con un 1 ml o 200 l pipeta. Una vez que el PBS se ha eliminado, proceder directamente a la aplicación correspondiente se detalla a continuación. No permita que la membrana se seque. El cultivo puede mantenerse brevemente en el PBS hasta que la aplicación está listo para comenzar. </li></ol> 3. Tratamiento de los filtros para Pellet Banca <ol><li> Añadir 100 ml 0,25% de tripsina-EDTA a cada cámara interior y se incuba durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Brevemente y cuidadosamente agitan / raspan las células de la superficie de la membrana con una pipeta de 200 l mientras pipeteando arriba y abajo (evitar puncturing la membrana). Incubar durante 1 min a 37 ° C. </li><li> Añadir 250 l de CM a la primera cámara interior y la pipeta hacia arriba y abajo con suavidad para enjuagar el filtro. </li><li> Transferencia de células resuspendidas a la cámara de filtro adyacente que contiene las mismas condiciones de los medios y repetir pipeteando arriba y abajo. </li><li> Repita este procedimiento para cada una de las inserciones de una sola condición. Recoger y transferir las células a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Enjuague cada cámara interior con un 100-200 l adicional de CM para recoger cualquier resto de las células. Añadir al tubo de centrífuga de 1,5 ml en el paso 3.5. </li><li> Girar las células a 423 xg en una microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y se lava el sedimento celular una vez con 1000 l de PBS. </li><li> Girar de nuevo a 423 xg en una microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar el PBS y se congelan a -80 ° C para su uso posterior. </li></ol> 4. Tratamiento de los filtros para el ARN o ADN Aislamiento <ol&gt; <li> Añadir 200 l de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo o reactivo de extracción similar a la cámara interior y agitar brevemente las células en la superficie de la membrana pipeteando arriba y abajo. </li><li> Incubar en el reactivo de extracción de 5 min a temperatura ambiente con el exterior seco cámara. <ol><li> A medida que el filtro puede disociar de la pieza de inserción, lavar la membrana del filtro disociado pipeteando la solución de extracción arriba y abajo. Recoger la mayor cantidad de reactivo de extracción como sea posible por la inclinación de la placa de 6 pocillos y aspirar cualquier líquido residual. </li></ol></li><li> Siga el protocolo del fabricante para la purificación y la recuperación de ADN, ARN o proteína. </li></ol> 5. Tratamiento de los filtros para el aislamiento de proteínas <ol><li> Coloque el inserto de filtro en la placa de 6 pocillos en hielo. Para la cámara interior, añadir 10 l de tampón de lisis de proteína suplementado con fluoruro de 1 mM de sodio (NaF), 1 mM de vanadato de sodio (NAV), dithiothre 100 mMitol (TDT) y 100 l de cóctel anti-proteasa. </li><li> Agitar / raspar las células de la superficie de la membrana con una pipeta de 20 l mientras pipeteando arriba y abajo. Evitar la generación de burbujas en el tampón de lisis. </li><li> Incubar la placa de 6 pocillos con insertos de filtro en hielo durante 10 min. </li><li> Repetir el raspado y, a continuación enjuagar la superficie de la membrana con el tampón de lisis. </li><li> Recoge los lisados ​​de las inserciones 6 y transferir a un tubo de centrífuga de 1,5 ml en hielo. </li><li> Enjuague la primera membrana con un 10 l adicionales de tampón de lisis y la transferencia al siguiente filtro. </li><li> Repita el paso 5.6 para todas las inserciones, recogiendo cualquier solución tampón de lisis residual y añadir al tubo de 1,5 ml (paso 5.5). </li><li> Incubar la muestra en hielo durante 5 min más. </li><li> Giro a la máxima velocidad (16.873 xg en una centrífuga de mesa) durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Pipeta lisado sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 ml. </li><li> Procederá al análisis de la concentración de proteína o store lisados ​​a -80 ° C. </li></ol> 6. Proceso de H &amp; E y Inmuno-tinción <ol><li> Añadir 500 l y 1 ml de 10% NBF (formalina tamponada neutra) a la cámara interior y exterior y dejar incubar durante la noche a 4 ° C. </li><li> Aspirar el MNB de la cámara exterior y se añade 1 ml de agarosa de hidroxietilo (HEA) procesar gel a una centrífuga de 1,5 ml. fundir la agarosa lentamente en un horno de microondas usando baja potencia y repetida 10-20 s pulsos hasta que se derrita la agarosa. </li><li> Mantenga la HEA en un baño caliente de 37 ° C para evitar la solidificación hasta que esté listo para su uso. </li><li> Retire el NBF de la cámara interior y aplicar 25 l de HEA fundido a la cámara interior y permitir que la agarosa solidifique durante 2-5 min. </li><li> Húmedos almohadillas de espuma de histología 2 en NBF al 10% y coloca una almohadilla en un casete de incrustación (ver Figura 3D). </li><li> Utilizar un bisturí # 11 de la hoja (que tienen una pala de punta fina muy afilada) para anotar el filtro desde el lado inferior del insertocámara, liberando parcialmente de la cámara de inserción de plástico. </li><li> Coloque una pequeña cantidad (100-200 l) de NBF en una placa de Petri y sumergir el filtro parcialmente desalojado en el NBF (Figura 3A). </li><li> Con un escalpelo cuchilla # 10, presionar suavemente contra el medio del filtro, desde el interior de la cámara de inserción, para desalojar totalmente el filtro de la barrica de inserción (Figura 3B). Si hay alguna parte del filtro que todavía está unido al barril, cortar con el bisturí. </li><li> Cortar el filtro recubierto de HEA en un medio con el # 10 bisturí de hoja (Figura 3C). </li><li> Coloque cada medio del filtro sobre la almohadilla de espuma en el casete de histología preparado en la etapa 6.4 (Figura 3D). </li><li> Añadir el segundo NBF esponja empapada 10% a la casete, intercalando el filtro. </li><li> Snap sellar el casete, lugar en NBF, e incubar durante la noche. </li><li> filtros de proceso en bloques de parafina para el seccionamiento y tinción comodescrito previamente 12. </li></ol>

<ol><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li>
<li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li>
<li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li>
<li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li>
<li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li>
<li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26910887">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li>
<li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor%28s%29+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li>
<li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868(2015).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

líneas de células primarias son una plataforma importante y rápido desarrollo de la investigación del cáncer. El sistema de cultivo basado en 3d inserción de cultivo apoya la diferenciación de los CRC próstata primarios dentro de un plazo de dos semanas. El método del filtro CRC representa un nuevo método, el rendimiento medio para la investigación de próstata. modelos PDX ratón existentes consumen tiempo y son extremadamente caros, y muchas de las muestras de PDX no pueden crecer en cultivo, lo que limita la experiment...

La identificación y el uso de terapias contra el cáncer que se personalizan a los individuos son un objetivo principal en la investigación del cáncer. Recientemente, nuevos enfoques han sido desarrollados que permiten una mayor facilidad en el establecimiento de cultivos de células primarias, proporcionando potencialmente formas tanto de identificar y probar terapias personalizadas. Por ejemplo, la próstata basado en la R-espondina enfoque organoide 1 permite para el cultivo en tres dimensiones (3D) de las células normales y metastásicas de cáncer de próstata en una matriz extracelular comercial (por ejemplo, Matrigel), mientras que el Condicionalmente reprogramación de células método (CRC) desarrollado en Georgetown 2, 3 utiliza más condiciones de cultivo 2D estándar. Específicamente, la combinación de un inhibidor de la cinasa Rho (Y-27632) y células alimentadoras de fibroblastos murinos J2 irradiados conducen al cultivo indefinido de CRCs de queratinocitos 2. La metodología es CRCextremadamente robusto, con líneas de células primarias establecidas y mantenidas indefinidamente de la próstata y muchos otros tejidos epiteliales normales y malignos 3 con éxito. Es importante destacar que, nuestra tecnología CRC permitió la rápida identificación de la base etiológica de la papilomatosis respiratoria recurrente en un paciente que había fallado un número de tratamientos con fármacos anteriores. Además, el uso de los CRC normales y derivados del tumor, la identificación con éxito de un fármaco aprobado por la FDA, vorinostat, se hizo dos semanas después de la biopsia de tejido inicial. El paciente fue colocado en vorinostat, lo que resulta en el éxito del tratamiento de la enfermedad 4. La glándula de la próstata normal se compone de luminal, basal y las células neuroendocrinas raros 5. células luminales forman la capa epitelial columnar de la glándula y expresan el receptor de andrógenos (AR), así como otros marcadores luminales tales como citoqueratinas 8 y 18 y proantígeno específico de estado (PSA) 6. Por el contrario, las células basales se localizan debajo de la capa luminal y expresan citoqueratina 5 y p63, pero los niveles bajos de la AR 5. Nos 7, 8, 9 y otros 10 han utilizado con éxito los CRC de próstata en las investigaciones mecanicistas sensibilidad a los fármacos preclínicos. Sin embargo, cuando se cultivan bajo condiciones estándar de cultivo de tejidos 2D, estas células no totalmente acoplan AR señalización 10. Es importante destacar que, cuando se coloca debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes, los CRC recuperó próstata arquitectura y la función glandular normal, lo que indica que CRCs de próstata conservan su compromiso de linaje cuando se coloca en un ambiente permisivo. El desarrollo del sistema de cultivo celular a base de inserto de filtro aquí descrito permite la rápida (2 semanas) la diferenciación in vitro de CRC de la próstata como lo demuestra by el aumento de la expresión de los genes diana Ar y Ar, así como disminución de los niveles de p63. Los elementos filtrantes utilizados contienen membranas de policarbonato (tamaño de poro, 0,4 micras) que pueden apoyar el cultivo de células de mamíferos. El sistema, como se desarrolló, hace uso de CRCs de próstata normales y malignas, placas de cultivo de 6 pocillos y los insertos de filtro. Medios de cultivo celular acondicionado por células J2 11 se coloca en los medios de cámara y de próstata diferenciadores de fondo en la cámara superior. Las técnicas descritas en el presente documento apoyan la diferenciación de células de próstata luminal a menos de 2 semanas de duración, en consonancia con los objetivos de la medicina personalizada. También era imperativo desarrollar las metodologías que permitan el perfilado molecular, genética y celular completa de las culturas. Enfoques para el aislamiento de ADN, ARN y proteínas a partir de células liberadas de la superficie del filtro se han desarrollado y simplificado para el procesamiento de muestras exacta repetición. Finally, la metodología necesaria para retirar el filtro para permitir la incrustación, el corte y para H &amp; E, inmunohistoquímica y tinción de inmunofluorescencia, se describe completamente.

<table><tbody><tr><td>Insertos de cultivo Corning Costar Snapwell</td><td>Insertos de cultivo Corning</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Millicell</td><td>Millipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina 0,1% en agua</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Seguridad estéril Scapel 10 cuchilla</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí estándar estéril de 11 hojas</td><td>Integra Miltex</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Tampón de lisis y extracción</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de sodio</td><td>Fishcer Scientific</td><td>S299-100</td><td></td></tr><tr><td>Vanadato de sodio</td><td>Fishcer Scientific</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasas (AEBSF, aprotinina, bestatina, E-64, leupeptina y pepstatina A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Thermofisher Scientific 25030081</td><td>& nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Mezcla de nutrientes</td><td>Medios Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato Inhibidor de rocas</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermofisher Scientific PHG0315</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Toxina del cólera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel Gel de procesamiento de muestras ( hidroxietil agarosa (HEA))</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Apósito no adherente</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular</td><td>Sigma SIAL0167</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II Procesamiento de tejidos / Casetes de inclusión</td><td>Crystalgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema de cultivo en 3d basado en insertar rápido de filtro para la próstata primario diferenciación celular

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Las células reprogramadas condicionalmente (CRC) proporcionan un método sostenible para el cultivo celular primario y la capacidad de desarrollar extensos bancos de datos genéticos &quot;vivos&quot; de las líneas celulares derivadas del paciente. Para muchos tipos de células epiteliales, varios tres enfoques (3D) de cultivo dimensionales se han descrito que apoyan un estado diferenciado mejorado. Mientras CRCs conservan su compromiso de linaje en el tejido de la que son aislados, no logran expresar muchos de los marcadores de diferenciación asociados al tejido de origen cuando se cultivan bajo dos condiciones dimensional (2D) de cultivo normales. Para mejorar la aplicación de CRC pacientes derivados de la investigación del cáncer de próstata, un formato 3D cultura se ha definido que permite una diferenciación celular rápida (2 semanas en total) luminal tanto en las células epiteliales normales de la próstata y derivados del tumor. En este documento, un formato basado en inserto de filtro se describe para el cultivo y la diferenciación de los dos CRCs normales y malignos de próstata. Una dese proporcionan cola Descripción de los procedimientos requeridos para la recolección de células y procesamiento para la tinción inmunohistoquímica y de inmunofluorescencia. En conjunto el formato de la cultura 3D descrito, combinado con las líneas primarias de CRC, proporciona un medio importante para resaltar sistema de modelo de rendimiento para la investigación de próstata basada en muestras biológicas.

El sistema basado en el cultivo de células de inserción es un procedimiento relativamente simple y rápido para la producción de los cultivos 3D de CRCs de próstata que apoya la diferenciación de células luminal. Un esquema del sistema se muestra (Figura 1A) poner de relieve la aplicación del recubrimiento de gelatina a la superficie inferior del inserto de filtro. Los insertos solamente se vuelcan para la aplicación de la gelatina. En la Figura 1B los fi...

Aquí, presentamos un método para el establecimiento de un sistema rápido in vitro que apoya el cultivo tridimensional y la posterior diferenciación luminal de las células epiteliales primarias de la próstata.

Un sistema de cultivo en 3D basado en Insertar rápido de filtro para la próstata primario Diferenciación Celular

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

El objetivo general de este sistema de cultivo 3D basado en insertos con filtro para células primarias derivadas de pacientes es establecer un sistema de modelo in vitro más biológicamente relevante para la investigación del cáncer de próstata. Mediante el uso de células humanas primarias, este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del desarrollo prostático así como en el cáncer de próstata. La principal ventaja de esta técnica es que constituye una metodología in vitro relativamente rápida para el establecimiento de células primarias de próstata diferenciadas, que además permite el aislamiento rápido de biomoléculas tales como ARN, ADN y proteínas.La demostración visual de estos métodos es fundamental, ya que el procesamiento de células en el inserto de filtro para histología o para la recolección de ARN y proteínas es delicado y sensible al tiempo. Para ayudar a limitar la difusión entre las cámaras en una cabina de seguridad biológica, aplique una capa delgada de gelatina al 0,1 % en la cara inferior de los insertos y déjelos secar. Repita este procedimiento dos veces más.Luego, aplique las células a la cámara interna de los insertos recubiertos con gelatina y cultívelas durante hasta dos semanas. Después de dos semanas, aplique directamente los insertos con filtro cultivados a una de las aplicaciones posteriores adecuadas descritas a continuación. Para comenzar este procedimiento, aspire el PBS de la cámara externa y retire cuidadosamente el PBS de la cámara interna.Las cámaras de cultivo pueden mantenerse brevemente en PBS hasta que esté listo para comenzar el procedimiento, pero no permita que la membrana se seque. A continuación, agregue 100 microlitros de tripsina-EDTA al 0,25 % a cada cámara interna. Luego, incube durante cinco minutos a 37 grados Celsius.Luego, raspe brevemente y cuidadosamente las células en la superficie de la membrana con una pipeta de 200 microlitros mientras pipetea hacia arriba y hacia abajo. A continuación, incube durante un minuto a 37 grados Celsius. Después de un minuto, agregue 250 microlitros de medio condicionado a la primera cámara interna y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para enjuagar el filtro.Después de esta transferencia, pase las células resuspendidas a la cámara de filtro adyacente que contiene las mismas condiciones del medio y repita la pipetación hacia arriba y hacia abajo. Repita este procedimiento para cada uno de los insertos de una misma condición. Luego, recoja las células y transfiera a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.Lave cada cámara interna con un volumen adicional de 100 a 200 microlitros de medio condicionado para recoger las células restantes y añádalas al tubo centrífugo de 1,5 mililitros. A continuación, centrifugue las células en una microcentrífuga a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Posteriormente, aspire el sobrenadante y lave el sedimento celular una vez con 1.000 microlitros de PBS.Centrifugar las células nuevamente en una microcentrífuga a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Después de cinco minutos, aspirar el PBS y congelar la muestra a menos 80 grados Celsius para su uso posterior. En este procedimiento, agregar 200 microlitros de tiocianato de guanidinio fenol cloroformo o un reactivo de extracción similar a la cámara interna y agitar brevemente las células sobre la superficie de la membrana pipeteando hacia arriba y hacia abajo.Luego incubar las células en el reactivo de extracción durante cinco minutos a temperatura ambiente y dejar la cámara externa seca. Posteriormente, lavar la membrana de filtro pipeteando la solución de extracción hacia arriba y hacia abajo. Recoger la mayor cantidad posible del reactivo de extracción inclinando la placa de seis pocillos y aspirando cualquier líquido residual.Tenga en cuenta que el filtro puede disociarse del inserto. Lave la membrana del filtro disociada si está adherida. Luego, recoja la mayor cantidad posible del reactivo de extracción y siga el protocolo del fabricante para la purificación y recuperación de ADN, ARN o proteína.Debe tenerse cuidado al lavar las células y el filtro con tiocianato de guanidinio, ya que una agitación excesiva puede producir ARN de baja calidad. Para aislar proteína del inserto del filtro, coloque el inserto del filtro en la placa de seis pocillos sobre hielo. Luego, agregue 10 microlitros de tampón de lisis proteica a la cámara interna.Agite y raspe las células sobre la superficie de la membrana con una pipeta de 20 microlitros mientras pipetea hacia arriba y hacia abajo, evitando generar burbujas en el tampón de lisis. Posteriormente, incube la placa de seis pocillos con insertos de filtro sobre hielo durante diez minutos. Repita el raspado y luego enjuague la superficie de la membrana con el tampón de lisis.Recolecte los lisados de los seis insertos y transfiéralos a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros sobre hielo. A continuación, enjuague la primera membrana con un volumen adicional de 10 microlitros de tampón de lisis y transfiérala al siguiente filtro. Repita este procedimiento para todos los insertos de una condición experimental determinada, recolectando cualquier solución residual de tampón de lisis y añádala al tubo de 1,5 mililitros.Incube la muestra en hielo durante cinco minutos adicionales. Luego, centrifúguela a velocidad máxima durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Una vez finalizado, aspire el lisado y transfiéralo a un tubo nuevo de 1,5 milímetros.Luego, continúe con el análisis de la concentración de proteína o almacene los lisados a menos 80 grados Celsius. En este procedimiento, agregue 500 microlitros y un mililitro de NBF al 10 % a la cámara interna y externa, respectivamente. Incúbelos durante la noche a cuatro grados Celsius.Al día siguiente, aspire el NBF de la cámara externa y agregue un mililitro de gel de procesamiento HEA a un tubo de centrifuga de 1,5 mililitros. Derrita lentamente el agarosa en un microondas utilizando potencia baja y pulsos repetidos de 10 segundos hasta que el agarosa se haya fundido. Mantenga el HEA en un baño tibio a 37 grados Celsius para evitar la solidificación hasta que esté listo para usar.A continuación, retire el NBF de la cámara interna. Aplique 25 microlitros de HEA fundido a la cámara interna y deje que el agarosa se solidifique durante dos a cinco minutos. Luego, humedezca dos almohadillas de histología de espuma en NBF al 10% y coloque una almohadilla en un casete de inclusión.Proteger la integridad de las capas celulares en el inserto de filtro utilizando HistoGel es un paso crítico para preservar la capa celular intacta para el corte histológico. Posteriormente, utilice un escalpelo con hoja número 11 para rayar el filtro desde el lado inferior de la cámara de inserción de plástico, liberándolo parcialmente. Coloque 100-200 microlitros de NBF en una placa de Petri y sumerja el filtro parcialmente desprendido en el NBF.Con un escalpelo de hoja número 10, presione suavemente contra el centro del filtro desde el interior de la cámara del inserto para desalojar completamente el filtro del cilindro del inserto. Si hay alguna parte del filtro que aún esté adherida al cilindro, córtele con el escalpelo. Posteriormente, corte el filtro recubierto con HEA por la mitad.Coloque cada mitad del filtro sobre la almohadilla de espuma en la cubeta de histología preparada. A continuación, añada la segunda esponja empapada en FBN al 10 % a la cubeta, colocándola de modo que envuelva el filtro. Luego, cierre herméticamente la cubeta.Colóquelo en FBN e incube durante la noche. Esta imagen de campo brillante muestra estratos celulares multicapa sobre la membrana porosa. Se muestran las imágenes fluorescentes individuales de los núcleos, P63 y el receptor de andrógenos, así como la superposición de los tres marcadores de fluorescencia.Finalmente, se muestra una superposición compuesta de campo brillante e inmunofluorescencia, que establece la localización de la señal fluorescente en relación con las células y el filtro. Aquí se muestra una imagen de sección transversal de nuestro inserto de filtro, en comparación con las capas epiteliales ductales de una próstata intacta. Una vez dominada esta técnica, puede realizarse en dos semanas, con un aislamiento final de las células y el inserto de filtro o de la biomolécula deseada que toma menos de 30 minutos si se realiza adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar siempre tener precaución al trabajar con los insertos de filtro, para que no se produzca ningún daño en la capa celular ni en el filtro subyacente. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como blot de Western, microarrays de ARN y análisis de proteoma, con el fin de responder preguntas adicionales relacionadas con el análisis de rutas metabólicas y células cancerosas. Esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo del cáncer de próstata exploren mejor la biología prostática, así como los fundamentos del cáncer de próstata, utilizando células prostáticas primarias.Después de ver este video, debería tener una comprensión excelente de cómo configurar correctamente y recuperar células prostáticas primarias cultivadas a partir de este sistema de cultivo 3D.

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Investigación del cáncer

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