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Artículo de método

La medición y la modificación de acoplamiento de unidad en Male

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DOI:

10.3791/55291

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15 de febrero de 2017

 ,  ,  , 
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este artículo se describe un ensayo de comportamiento que utiliza la unidad de apareamiento masculino en Drosophila melanogaste R a estudiar la motivación. Usando este método, los investigadores pueden utilizar técnicas de neurogenéticas mosca avanzada para descubrir los mecanismos genéticos, moleculares y celulares que subyacen a esta motivación.

Resumen

A pesar de décadas de investigación, las bases neuronales y moleculares de los estados motivacionales siguen siendo un misterio. Recientemente hemos desarrollado una novela, reduccionista, y un sistema escalable para la investigación en profundidad de la motivación de utilizar la unidad de acoplamiento macho de Drosophila melanogaster (Drosophila), los métodos para los que detallamos aquí. El paradigma de comportamiento se centra en el descubrimiento de que la unidad de apareamiento masculino disminuye junto con la fertilidad a lo largo de cópulas repetidas y recupera más de ~ 3 d. En este sistema, las herramientas neurogenéticas potentes disponibles en la mosca convergen con la accesibilidad genética y diagrama de cableado putativo disponible para el comportamiento sexual. Esta convergencia permite un rápido aislamiento e interrogatorio de pequeñas poblaciones neuronales con funciones específicas de motivación. A continuación detallamos el diseño y ejecución del ensayo de saciedad que se utiliza para medir la motivación y alterar el cortejo en la mosca macho. Usando estoensayo, también demostramos que la unidad de apareamiento masculino baja puede ser superada mediante la estimulación de las neuronas dopaminérgicas. El ensayo de saciedad es simple, asequible y robusta a las influencias de los antecedentes genéticos. Esperamos que el ensayo de saciedad para generar muchos nuevos conocimientos sobre la neurobiología de los estados motivacionales.

Introducción

El trabajo en Drosophila ha proporcionado la penetración profunda y pionera en muchos fenómenos biológicos, incluyendo la naturaleza del gen 1, los principios del desarrollo embrionario 2, 3 ritmos circadianos, y el desarrollo y el cableado del sistema nervioso 4, 5, 6. La motivación sigue siendo mucho menos conocido que estos fenómenos, tal vez debido a las limitaciones de los sistemas que se han estudiado hasta el momento. La motivación en la mosca se estudia principalmente en el contexto de hambre, que presenta muchos retos debido a su extremadamente pequeña ingesta de alimentos por combate alimentación y exoesqueleto que impide signos manifiestos de la deposición de grasa. En consecuencia, hay una necesidad de ampliar los sistemas utilizados para estudiar la motivación en la marcha.

Se describe un marco de comportamiento para el estudio de la unidad de acoplamiento enDrosophila. Este sistema se aprovecha de las herramientas neurogenéticas en la mosca, así como la accesibilidad 7, 8, 9, 10, 11, 12 y la conectoma putativo de su circuito de dimorfismo sexual 8, 13. Además, gran parte de la innata 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 y aprendimos 22, 23, 24 circuitos sensorio-motor que controla el cortejo se ha trabajado de manera detallada, proporcionando una oportunidad únicapara localizar el nodo de circuito exacta sobre la que incide la motivación. Recientemente hemos informado de que, en la marcha, al igual que en los seres humanos, los niveles de dopamina son fundamentales para la unidad de acoplamiento 25, 26, 27. Hemos tenido acceso a la genética a nivel de circuito molecular- y detallada productora de dopamina y la recepción de las neuronas en la marcha, lo que facilita los análisis pertinentes de este fenómeno conservada usando los ensayos que aquí describimos 25.

Añadimos a los ensayos de comportamiento en Zhang et al. 25 una nueva arena de comportamiento plana que permite la creación de vídeo, lo que llamamos un ensayo de saciedad de 2 dimensiones (2-D), una mejora importante sobre los métodos anteriores. En consecuencia, el nuevo ensayo es más escalable y cuantificable, y por tanto más adecuado para pantallas genéticas de los genes y las neuronas implicadas en la motivación. Utilizamos este nuevo ensayo, junto con ensayos de cortejo y neurogemanipulaciones néticas, para demostrar cómo medir y alterar la unidad de acoplamiento de la marcha.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo describe la preparación (secciones 1 - 3), ejecución (Sección 4), y el análisis (Sección 4) de los ensayos de saciedad en 2-D. Luego, utilizando la estimulación dopaminérgica como ejemplo, la sección 5 muestra la forma de combinar la estimulación thermogenetic con los ensayos de saciedad 2-D para inducir hipersexualidad. Sección 6 describe 3 maneras de verificar los resultados de los ensayos de saciedad en 2-D. Por último, la sección 7 muestra cómo medir la recuperación de la unidad de apareamiento en las moscas macho.

1. La fabricación de 8 y 32 de la cámara de Arenas del Comportamiento

NOTA: Cada escenario conductual consiste en varias capas de láminas de plástico cortadas con láser se mantienen unidas por tornillos hexagonales y tuercas de mariposa en cada una de las cuatro esquinas (Figura 1A).

  1. Fabricar las capas de la arena. Fabricar cada capa usando un cortador láser para cortar láminas de plástico acrílico a la forma apropiada (véase la figura 1B, 1C de los productos).
    NOTA: Muchos institutio investigaciónns tienen cortadoras láser en sus talleres de máquinas o espacios fabricante. Si la institución tiene acceso a un cortador láser, continúe con los siguientes pasos. Si no es así, a continuación, siga las instrucciones del paso 1.2 en su lugar.
    1. Para cada capa, abra el patrón de diseño en el software de la cortadora láser.
      NOTA: Los diseños se pueden encontrar en los archivos PDF con nombres correspondientes (por ejemplo, 8-Sala Arena - Capa 2 - Doors.pdf) en el material suplementario 1. Este archivo también contiene anotaciones para el tipo de plástico que se utiliza (por ejemplo, 1 / 8 pulgadas (es decir, 3,175 mm) acrílico transparente). El espesor exacto de cada capa no es crítico. El requisito principal es permitir a 0,12 pulgadas (3 mm) o más de espacio vertical libre en las cámaras.
    2. Ajustar los ajustes del láser (energía, enfoque, etc.) para el tipo y grosor de plástico para ser utilizado. Coloque objetos de plástico en la cama cortador láser y ejecutar el cortador láser.
      NOTA: Esta configuración puede variar ampliamente basado en el láser cutteModelo R y la fuerza de su láser. Encuentra los ajustes adecuados en función de la experiencia pasada o al hacer cortes de prueba en el plástico de desecho. Los grabados profundos hexagonales se incluyen en el diseño al recreo las cabezas de los tornillos hexagonales. Esta característica permite una sola mano apriete de las tuercas de mariposa y permite a los escenarios para descansar plana sobre el banco (sin sobresalir cabezas de los tornillos). Sin embargo, haciendo grabados profundos es a menudo difícil de lograr, y requiere mucho tiempo, usando un cortador láser. Este paso es opcional y se puede omitir sin afectar los resultados de comportamiento.
    3. Al cortar el marco de la puerta (Capa 2, Figura 1 A), también utilizar la configuración de láser adecuados para grabar los números de cámara incluye en el diseño (como en la Figura 1B, 1C).
  2. Hacer un pedido con un fabricante de corte por láser en línea. Cargar todos los archivos de diseño de PDF para la arena de 8 y / o 32 de cámara y especificar el tipo de material (por ejemplo, 1/8 de pulgada (es decir, 3,175 mm) CLEAr acrílico) sobre la base de las anotaciones en los archivos. Los resultados aparecerán como en las figuras 1B (arena de 8 cámaras) y 1C (arena de 32 cámaras).
  3. Montar arenas utilizando cuatro tornillos de cabeza hexagonal y cuatro tuercas de mariposa para alinear y mantener unidas las capas de plástico (Figura 1A). Las arenas aparecerá como en la figura 1D, 1E (8-cámara) y la Figura 1F, 1G (32 cámaras).
    NOTA: La pared de alimentos (Capa 4 en la figura 1A) se utiliza sólo para ensayos de saciedad 2-D y se omite en arenas 32 de cámara, que se utilizan en ensayos de cortejo.

2. Preparación de Alimentos para 2-D saciedad Ensayo

NOTA: Debido a un ensayo de saciedad 2-D se extiende por 4,5 h, la mosca de alimentos se utiliza en la arena para proporcionar la nutrición y el agua. Este protocolo utiliza, pero no se limita a, la harina de maíz-agar convencional vuela alimentos.

  1. Parcialmente montar el campo de la saciedad 2-D (8-cámara) con capas 3 - 6(véase la Figura 1A para asignaciones de capa) y apretarlo con tuercas de mariposa y tornillos hexagonales.
  2. Coloque los alimentos frescos mosca en una botella limpia, apto para microondas. Añadir agua suficiente para cubrir la superficie inferior de la botella (Figura 2A).
  3. comida de microondas a máxima potencia durante 30 - 45 s. Comprobar el progreso y remover cada 15 s hasta que se derrita (Figura 2B). ¡PRECAUCIÓN! Fly alguna olla fácilmente sobre.
  4. Utilice una punta de pipeta embotado de 1.000 l (Figura 2C) para transferir lentamente ~ 1 ml derritió los alimentos en cada cámara (Figura 2D).
  5. Permita que los alimentos se vuelvan a solidificar a 4 ° C durante ~ 10 minutos (Figura 2E) antes de ensamblar completamente la arena (Figura 2F).
  6. Utilice la arena completado para experimentos (véase la Sección 4) o se almacena a 4 ° C.
  7. Almacenar la comida sobrante a 4 ° C y la reutilización.

3. Preparación Vírgenes Las hembras de la Conducta Ensayos

NOTA: 2-D ensayos de saciedad utilizan un gran número de moscas hembras vírgenes (~ 120 - 160 para un campo de comportamiento completo) que son difíciles de recoger usando métodos estándar. En esta sección se describe un enfoque alternativo utilizando el transgén hs-HID en el cromosoma Y 28, que ha sido utilizado con éxito en ensayos de cortejo 25, 29. La acción usada para generar hembras vírgenes de ojos blancos tiene el genotipo w1118 (X) / hs-HID (Y); + / +; + / + (Bloomington código RS 24638).

  1. Flip vuela en una nueva botella una vez 20 - 50% de las pupas han eclosed (véase la Figura 3A, por ejemplo) y hay suficientes machos (5 - 10) para propagar los valores.
  2. Choque térmico de la botella original en un baño de agua caliente 37 ° C durante 1 h para activar suficientemente hs-HID para matar a los machos (Figura 3B). Después del choque térmico, solamente las hembras eclose de estas botellas y así permanecerán hasta que la virgenensayos.
    NOTA: Asegúrese de que se calientan de manera uniforme todos los lados de la botella (véase la figura 3A para la línea de agua). Prolongar este tiempo para un máximo de 2 horas 1 hora si no es suficiente para practicar la eutanasia a todos los varones.
  3. Aislar hembras colectadas durante al menos 3 d antes de los experimentos para asegurarse de que son lo suficientemente mayor como para ser sexualmente receptivas 25, 29.
    NOTA: los machos para el cromosoma Y menos de vez en cuando surgen de esta población. Estos machos tienen ojos en blanco y no se ven afectados por el choque térmico, ya que no contienen el transgén hs-HID. No pueden producir esperma y por lo tanto no puede disminuir la receptividad en las hembras 30, 31.

4. Realización y anotando 2-D saciedad Ensayos

NOTA: Es importante controlar la edad del macho vuela como los cambios de unidad de acoplamiento con la edad. Este protocolo utiliza los machos que son 3 - 4 días de edad 25 .

  1. Ajustar la incubadora a la temperatura deseada (por ejemplo, 23 ° C para el estándar, los experimentos de RT) y humedad (> 30%). Para las incubadoras sin control de la humedad, dejando un vaso de agua en la incubadora es suficiente.
  2. Colocar una arena ensayo de saciedad 2-D en la incubadora durante ~ 30 min para equilibrar la temperatura y para evitar la condensación en las cámaras durante el curso del experimento. Las puertas giratorias deben estar en la posición abierta.
  3. Utilice un aspirador para aspirar mosca 32 15 - 20 hembras vírgenes en cada cámara de la arena (Figura 4).
    NOTA: Es importante que las hembras y los machos no se anestesian en el mismo día como el ensayo. En nuestra experiencia, si lo hace puede afectar la receptividad femenina y el comportamiento de apareamiento masculino.
  4. Aspirar 1 macho en cada cámara.
  5. Coloque la arena cargada en la incubadora bajo una videocámara de consumo normal (Figura 5) y el cine durante 4,5 h.
  6. Puntuación vídeos observando cuando cada mosca macho empieza y termina cada apareamiento (es decir, la cópula). Este paso puede llevar mucho tiempo al principio. Con la práctica, se puede marcar los vídeos a velocidad de 5x o superior.
    NOTA: Como moscas se aparean para ~ 20 min a ~ 23 ° C (más corta duración a temperaturas más altas) 29, uno puede leerlo a través de la primera 15 min de cada acoplamiento.
  7. Tras registrar todos los tiempos de apareamiento, sumar el número de apareamientos para cada mosca (ver resultados representativos).
  8. Utilice el código proporcionado para generar una ethogram. Ver material suplementario 2 para el código, instrucciones y datos de ejemplo.
  9. Utilice CO2 o temperatura fría para anestesiar las moscas antes de retirarlas.

5. El uso de la manipulación thermogenetic para revertir la saciedad en 2-D saciedad Ensayos

NOTA: Este protocolo pruebas si la estimulación thermogenetic de una población neuronal definida puede superar la sensación de saciedad. El Fli experimentales expresar el canal catiónico sensible al calor TRPA1 en poblaciones definidas de neuronas (UAS-TRPA1). Los pasos siguientes se aplican a la estimulación de las neuronas dopaminérgicas (TH-Gal4), que se ha demostrado para promover la unidad de acoplamiento 25. Estos pasos se pueden utilizar en conjunción con otros conductores neuronales para descubrir otras poblaciones que promueven la unidad de acoplamiento.

  1. Para inducir comportamientos de acoplamiento thermogenetically en las moscas saciadas, aumentar la temperatura de la incubadora (por ejemplo, de 23 ° C a 28,5 ° C) después de completar un experimento 4,5 h plena saciedad 2-D.
  2. Después de la incubadora alcanza la temperatura deseada, continuar la estimulación de calor y la puntuación de los apareamientos (es decir. Cópulas) de los machos durante 1 h (ver resultados representativos).
    NOTA: La temperatura y la duración de la estimulación puede variar en función del genotipo por lo que es necesario solucionar las condiciones óptimas que evitan que la sobreestimulación de las neuronas y seguir produciendo una robufenotipo st.

6. El uso de cortejo y la locomoción para Verificar Saciedad

NOTA: En esta sección se describen 3 métodos opcionales que se pueden utilizar para verificar los resultados de los ensayos de saciedad en 2-D. Ellos no son necesarios para cada ensayo.

  1. Utilizar ensayos de cortejo para verificar la saciedad.
    1. Aspirar un macho y una hembra virgen en cada una de las 32 cámaras en una arena de cortejo.
    2. Filmar las moscas de ~ 20 min utilizando una videocámara de consumo normal.
    3. Puntuación del índice de cortejo (CI) para cuantificar el cortejo 25; esta es la fracción de tiempo de la realización de comportamiento de cortejo (canto, siguiente, etc.) y el apareamiento (es decir, la copulación) sobre una ventana de 5 min. Esta ventana se inicia desde la primera instancia del comportamiento de cortejo. Si una mosca macho no se inicia el cortejo en el primero 15 min, su CI es 0. Naïve WT moscas deben mostrar un CI mayor de 0.9, mientras que una mosca completamente saciado debe tener un CI bElow 0.2. Otras medidas de cortejo también pueden ser considerados 23, 33.
  2. Anotando el cortejo en ensayos de saciedad 2-D
    1. Puntuación de la cantidad de tiempo que una mosca macho gasta cortejo, durante un período de tiempo de un ensayo de saciedad 2-D (por ejemplo, la primera h). El cortejo se define como el macho de realizar cualquier etapa del ritual (cantando, siguiendo, etc.). A diferencia de en la Sección 6.1.3, este paso no incluye el tiempo de apareamiento el macho pasa.
    2. Dividir el tiempo de cortejo anterior por el tiempo total que el macho no se aparea (es decir, no copular) en el mismo período de tiempo. Por ejemplo, si una mosca macho tribunales para 15 min y compañeros durante 20 minutos sobre la primera h, la proporción es de 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. La relación se muestra como "Fracción de tiempo en el cortejo nonmating" en resultados representativos.
  3. Usando el ensayo de locomoción para evaluar agotamiento
    1. Parcialmente montar el 32-Arena de cámara con todas las partes, pero la hoja de contraste.
    2. Aspirar una mosca macho (no hay moscas hembras) en cada una de las 32 cámaras en una arena de cortejo.
    3. Filmar las moscas de ~ 10 min utilizando una videocámara de consumo normal.
    4. Realizar un seguimiento de las moscas con el plugin MTrack2 en ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).

7. Recuperación de acoplamiento de unidad después de 2-D saciedad Ensayo

  1. Realizar un ensayo de saciedad 2-D como se describe en la Sección 4, pero aspirar el macho despega al final del ensayo.
  2. Aislar las moscas macho a 23 ° C para el número deseado de días.
  3. Realizar un ensayo de saciedad 2-D con los machos recuperados y anotar sus apareamientos (es decir, cópulas) por tan sólo 1 hora (ver resultados representativos).

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Resultados

Para la caracterización de la unidad de apareamiento de Drosophila, 3 días de edad, WT Cantón-S machos se probaron en un ensayo de saciedad 2-D. En el transcurso del ensayo (4,5 h), los machos se aparean un promedio de 4,8 ± 0,3 (media ± error estándar de la media, SEM) veces. Apareamientos inician sobre todo en las primeras 2 h (78%) (Figura 6A, 6B) y se vuelven menos frecuentes a medida que avanza el ensayo (Figura 6A, 6B). Esta disminución no...

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Discusión

Estados motivacionales pueden ser saciados, mantienen, y se recuperaron 34. Presentamos un ensayo de saciedad 2-D de forma rápida y robusta que mide todos estos aspectos de apareamiento unidad en la marcha. Este ensayo se abre la posibilidad de utilizar manipulaciones genéticas mosca avanzada para estudiar los componentes moleculares y de circuito de un comportamiento motivado.

El ensayo de saciedad se basa en la capacidad del varón a la corte con éxito y copular, y p...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Mike Crickmore, Dragana Rogulja y Michelle Frank por sus comentarios sobre el manuscrito. Pavel Gorelik proporcionó soporte técnico para la fabricación de las arenas conductuales. Este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de Mike Crickmore y también cuenta con el apoyo de la Fundación Whitehall (Investigadora principal: Dragana Rogulja). S.X.Z. es becario Stuart H.Q. y Victoria Quan en la Facultad de Medicina de Harvard.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acrílico transparente de 1/16 de pulgadaMcMaster-Carr8589K12Se utiliza para hacer estadios; consulte el Material Suplementario 1 para los diseños.
Acrílico transparente de 1/8 de pulgadaMcMaster-Carr8589K42Se utiliza para hacer estadios; consulte el Material Suplementario 1 para los diseños.
Acrílico transparente de 3/16 de pulgadaMcMaster-Carr8560K219Se utiliza para hacer estadios; consulte el Material Suplementario 1 para los diseños.
Delrin negro de 1/32 pulgadasMcMaster-Carr8575K132Se utiliza para hacer arenas; consulte el Material Suplementario 1 para los diseños.
Tornillos hexagonales, 1 pulgada de largo (50x)McMaster-Carr92314A115 Se utiliza para hacer arenas. Se puede reemplazar por tornillos de 3/4 de pulgada (92314A113, McMaster-Carr) para arenas de 32 cámaras.
Tuercas de mariposa (25x)McMaster-Carr92741A100Se utiliza para hacer arenas. Se puede reemplazar por tuercas hexagonales normales (90480A005, McMaster-Carr).
VideocámaraCanonVixia HF R700Puede ser reemplazada por cualquier computadora de consumo.

Referencias

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