La constricción aórtica mínimamente invasiva transversal en ratones

Resumen

Mínimamente invasiva constricción de la aorta transversal (MTC) conserva los elementos esenciales de la constricción de la aorta transversal regular (TAC) al tiempo que elimina el uso de un ventilador con intubación traqueal. Demuestra ser un método altamente deseable para los estudios de alto rendimiento de sobrecarga ventricular izquierda, sobre todo en estudios de traducción.

Resumen

Mínimamente invasiva constricción de la aorta transversal (MTC) es un método más deseable para la constricción de la aorta transversal en ratones que a tórax abierto constricción de la aorta transversal estándar (TAC). Aunque la constricción aórtica transversal es un método altamente funcional para la inducción de alta presión en el ventrículo izquierdo, que es un procedimiento más difícil y prolongado debido a su uso de la ventilación artificial con la intubación traqueal. TAC es a menudo también menos de supervivencia, como el método más reciente, MTAC, ni requiere el corte de las costillas y los músculos intercostales ni la intubación traqueal con una configuración de la ventilación. En MTAC, en oposición a una toracotomía para acceder a la cavidad torácica, el arco aórtico se alcanza a través de una incisión de línea media en el cuello anterior. La tiroides se tira hacia atrás para revelar la horquilla esternal. El esternón se corta posteriormente hasta el segundo nivel de costilla, y el arco aórtico se alcanza simplemente mediante la separación de los tejidos conectivos y el timo. Deallí, una sutura puede ser envuelto alrededor del arco y atado con un espaciador, y después el corte del esternón y de la piel se puede cerrar. MTAC es una manera mucho más rápida y menos invasivo para inducir la hipertensión ventricular izquierda y permite la posibilidad de que los estudios de alto rendimiento. El éxito de la constricción se puede verificar usando alta frecuencia ecocardiografía transtorácica, en particular de color Doppler y de la onda de impulsos Doppler, para determinar las velocidades de flujo del arco aórtico y la izquierda y la arteria carótida derecha, la dimensión de los vasos sanguíneos, y la función ventricular izquierda y la morfología. Una constricción éxito también dará lugar a cambios histopatológicos significativos, tales como la hipertrofia de células del músculo cardiaco con fibrosis intersticial y perivascular. A continuación, se describe el procedimiento de MTAC, lo que demuestra cómo los cambios en los flujos resultantes en las arterias carótidas pueden ser examinados con la ecocardiografía, morfología general, y los cambios histopatológicos en el corazón.

Introducción

El propósito general de este artículo es demostrar cómo transversal constricción de la aorta (TAC) en ratones puede ser modificado para producir una cirugía simple y más conveniente. TAC se introdujo por primera vez en 1991 ¹ y activar los biólogos moleculares para estudiar las vías celulares y moleculares que conducen a la hipertrofia en el ventrículo izquierdo y a la insuficiencia cardíaca, en particular en los pequeños animales con genomas manipulados ^{2, 3, 4, 5, 6.} A pesar de su eficacia en la producción de la sobrecarga de presión deseada, la técnica es en última instancia limitado por la dificultad en realizar el procedimiento y por su baja tasa de supervivencia. Un cirujano la realización de TAC debe ser capaz de realizar la intubación endotraqueal, una toracotomía, y el uso de la ventilación artificial con el fin de evitar el colapso pulmonar ^1.

contenido "> A menudo, se desea un método simple y menos invasiva. Como consecuencia, mínimamente invasiva constricción aórtica transversal (MTAC) fue ideado ^3. Aunque el resultado (en concreto, la hipertrofia ventricular izquierda) es el mismo, el procedimiento consiste en un número significativamente menor aparatos y menos daño a la animal. MTAC resulta ser un método conveniente que tiene una tasa de supervivencia mayor, por encima de 90%, y tiene un tiempo de operación de sólo de 15 a 25 min. los casos poco frecuentes de muerte después de la cirugía con éxito puede ser atribuible a demasiado constricción -tight del arco aórtico, dando como resultado la sobrecarga ventricular izquierda tremenda y la reducción fatal del suministro de sangre a los órganos críticos, tales como los riñones.

Después de que se completa el procedimiento, la ecocardiografía se puede utilizar para evaluar el éxito de las bandas y la morfología y la función cardíaca. Un sistema de ultrasonido de alta frecuencia se puede utilizar para medir el diámetro y los cambios de flujo en la izquierda y derechacarótida arterias, para visualizar la constricción del arco aórtico para mediciones de pico de velocidad de flujo, y para determinar el espesor de la pared del ventrículo izquierdo y los parámetros funcionales ^{7, 8.} Después de la eutanasia, los órganos también pueden ser recogidos para los estudios histopatológicos con hematoxilina y eosina y la tinción de colágeno Picrosirius, siendo esta última particularmente útil para la observación de la fibrosis.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices del Comité para el uso de animales vivos en la Enseñanza y la Investigación (CULATR) de la Universidad de Hong Kong.

1. Operación Preparación del Sitio

1. Desinfectar el lugar de la operación con alcohol isopropílico al 75%. Ajustar la temperatura almohadilla térmica a 37 ° C para evitar cambios en el ritmo cardíaco y respiratorio del sujeto animal.
2. Utilizar instrumentos quirúrgicos esterilizados en un esterilizador de desplazamiento por gravedad a 121 ° C durante 30 minutos o por otros métodos apropiados.
3. Tome 2 - 4 agujas de calibre 30 y les curva con un soporte de aguja, como se ve en la Figura 1, para hacer una herramienta para la ligadura y el tejido de separación y para el uso como un retractor. Montar ahora la aguja curvada en un aplicador de algodón para su uso en la cirugía.
4. Embotar una aguja de calibre 27 y la curva de 90º con el soporte de la aguja. Suavizar la punta por el roce de una superficie dura para hacer una 0,4 mm espaciador en etapa de ligación.

2. Preparación de los animales

1. Anestesiar a 2 meses de edad, de sexo masculino, 22-25 g de ratón C57BL / 6N con una mezcla de ketamina y xilazina adecuada en relación con el peso corporal: 100 mg / kg + 10 mg / kg ip Confirmar la anestesia con el reflejo pizca cola negativa .
2. Quitar el pelo en la parte anterior del cuello y el pecho con una aplicación de 2 a 3 min de la crema depilatoria. Retire la crema con agua tibia y un aplicador de algodón.
3. Aplicar pomada oftálmica o gel para los ojos de los animales para evitar la desecación de la córnea.
4. Colocar el animal sobre una almohadilla térmica en la posición supina y llevar a cabo el monitoreo intraoperatorio, asegurándose de mantener la documentación apropiada en cada intervalo de 15 minutos.
5. Utilice cinta de papel quirúrgico para asegurar las extremidades a la resistencia de calentamiento con el fin de mantener al animal en la posición correcta durante la cirugía.
6. Desinfectar la piel alternativamente con alcohol y solución de povidona yodada tres veces.
7. Use un dr estérilmono con un campo de operación expuesta para evitar la contaminación. Utilizar nuevos guantes estériles para cada ratón y según sea necesario.

3. Procedimiento de ligadura

1. Abra la piel del ratón en la posición de la línea media del cuello y el pecho con un bisturí.
2. Tire de la glándula tiroides hacia la cabeza separando suavemente los tejidos conectivos con tijeras de punta roma.
3. Se separa la capa muscular de la tráquea en la línea media hacia ambos lados con las agujas curvas.
4. Uso de las tijeras de punta roma, cortar el esternón a la segunda costilla (aproximadamente 5 mm). Abrir el corte con un retractor o pinzas curvas.
5. Separar los lóbulos del timo el uno del otro y la pared inferior del pecho mediante la separación del tejido conectivo con la aguja curvada; el arco aórtico transverso y dos arterias carótidas serán claramente visibles en este punto.
6. Coloque la aguja curva bajo el arco y perforar entre la pared del vaso y el tejido conectivo en el otro lado por pusHing la cabeza curvada hacia fuera.
7. Uso de la aguja curva, tirar de la sutura monofilamento 6-0 bajo el arco aórtico.
8. Coloque el espaciador en el bucle y fijar la sutura en su lugar con un doble nudo. Retire el espaciador con suavidad.
9. Confirmar una constricción éxito con la posición de nudo y cortar los extremos de la sutura.
10. Cierre de la pared torácica usando 6/0 sutura de seda con un simple patrón de sutura interrumpida. Cierre la piel con una sutura de monofilamento de 6/0 en un patrón de sutura continua.

4. Cuidado post-operatorio

1. Aplique una solución de povidona yodada al sitio de sutura y colocar al animal en una jaula pre-calentado para la recuperación y el seguimiento post-operatorio.
2. Inyectar buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg sc cada 12 h) después de que el animal ha recuperado la conciencia para aliviar el dolor y proporcionar el ratón con comida suave apropiada.
3. Devolver el animal a un 12 h luz / sala de ciclo de oscuridad después de la recuperación completa.

5.Ecocardiografía: Confirmación de ligadura exitosa y Medidas

1. Después de una semana, anestesiar el ratón previamente en bandas con 3-5% de isoflurano, para la inducción, y 1 a 1,5%, para el mantenimiento, con una tasa de 1 L / min de oxígeno de flujo.
2. Quitar el pelo en el pecho usando la crema depilatoria. eliminar completamente la crema con agua tibia y un aplicador de algodón.
3. Asegure el ratón en la posición supina a la plataforma de manejo de animales, mantenida a 37 ° C. Aplicar el gel de electrodos a las patas y papeles pegados a la almohadilla con electrodos.
4. Aplique el gel de ultrasonido en el pecho del ratón. Con una sonda de 40 MHz MS550D y un sistema de ultrasonido de alta frecuencia, realizar Doppler escaneado en color y Doppler de onda pulsada en las arterias carótidas izquierda y derecha, así como en el arco aórtico.
5. Usando el modo B, localizar el ventrículo izquierdo. El uso de M-Mode, la presión sistólica y diastólica espesor de pared se pueden medir. Uso Cine tienda y artículos enmarcados para guardar datos e imágenes según sea necesario.
6. Tcantar el modo B, localizar la arteria carótida común izquierda antes del punto de ramificación. Utilice impulsos de onda y de color Doppler para evaluar el flujo. Repita con la arteria carótida derecha en un punto similar. Guardar las imágenes en Cine tienda y artículos enmarcados modos de analizar más adelante.
7. Inclinar la plataforma de manejo de los animales en el extremo izquierdo de manera que el ratón está en posición de decúbito izquierdo. Coloque la sonda en el ratón, a 30 ° de desplazamiento desde una posición paralela a la cabeza en la posición paraesternal y manipular X e Y para encontrar el arco aórtico.
8. Busque la constricción. Utilice el modo Doppler color para hacer el sitio de la constricción más visible, como la sangre fluirá a través de un canal estrecho entre el punto donde las dos arterias carótidas se ramifican desde el arco aórtico.
9. Utilice impulsos de onda y de color Doppler para medir la velocidad de flujo máximo. Uso Cine tienda y artículos enmarcados para guardar datos e imágenes según sea necesario.
10. Deje que el animal se recupere en una almohadilla térmica en la posición prona.Devolver el animal a la jaula original en una sala de ciclo de 12 h de luz / oscuridad después de que se ha recuperado completamente de la anestesia.

Resultados

MTAC permite la inducción de hipertensión significativa en el ventrículo izquierdo de una manera oportuna.

Como se ve en la Figura 1, la preparación de las principales herramientas para el procedimiento es simple y mínima, que requiere sólo 2-4 agujas de calibre 30 a curvar y en su lugar con un tubo de poliuretano. El procedimiento quirúrgico en sí también es menos complicado, en comparación con TAC, y se pued...

Discusión

Rockman y sus colegas desarrollaron el primer método de constricción aórtica como método para estudiar la sobrecarga de presión en el corazón. Esta investigación permitió comenzar a descubrir las consecuencias celulares y moleculares de la hipertensión y la insuficiencia cardíaca ^1. Un método mejorado, mínimamente invasivo constricción aórtica transversal (MTAC), proporciona un método susceptible, dependiente del tiempo para la inducción de ventricular izquierda sobrecarga de presión y la insufic...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 inch 30 Gauge Needles	BD, Franklin Lakes, NJ 07417, USA.	305128	Curvada como en el procedimiento y Figura 1
>27 Aguja de calibre	BD, Franklin Lakes, NJ 07417, EE. UU.	301629	Hacer romo y liso para espaciador
6/0 Dafilon	B. Braun, 34212 Melsungen, Hessen, Alemania.	C0933066
6/0 Silkam	B. Braun, 34212 Melsungen, Hessen, Alemania.	C0762067
Guantes estériles	A.R. Medicom, Inc (Asia), Hong Kong.
algodón fuerte	Mannings, Quarry Bay, Hong Kong.		Centro comercial local
Depilatory Cream	Veet (Hong Kong), Kwun Tong, Kowloon, Hong Kong		Local Shopping Center
Lexer-Baby Scissor	FST, Columbia Británica V7H 0A6, Canadá.	14078-10
fórcep de iris curvado	FST, Columbia Británica V7H 0A6, Canadá.	11065-07
Micro Olsen-Hegar Needle Holder	WPI, Sarasota, FL 34240, EE. UU.	501989
Stereo Micrioscope	WPI, Sarasota, FL 34240, USA.	PZMIII-BS
strong>GenTeal Eye Gel	Novartis, East Hanover, NJ 07936, EE. UU.		Farmacia local
Heating Pad	Kent Scientific Corporation, Torrington, CT 06790, EE. UU.	DCT-20
Cinta quirúrgicaUnidad de Animales de	Laboratorio
Ketamina y Xilacina	Unidad Animales de Laboratorio
Betadina	Unidad Animales de Laboratorio
Buprenorfina	Unidad		de Animales de Laboratorio