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Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

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DOI:

10.3791/55297

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26 de junio de 2017

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1Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, 2Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, 3Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, 4Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los protocolos descritos aquí permiten el estudio de las propiedades eléctricas de las células excitables en las condiciones fisiológicas más no invasivas mediante el empleo de embriones de pez cebra en un sistema in vivo junto con un indicador de voltaje genéticamente codificado (GEVI) basado en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) expresado selectivamente en el tipo de célula de interés.

Resumen

Los protocolos descritos aquí están diseñados para permitir a los investigadores estudiar la comunicación celular sin alterar la integridad del entorno en el que se encuentran las células. En concreto, se han desarrollado para analizar la actividad eléctrica de las células excitables, como las neuronas espinales. En tal escenario, es crucial preservar la integridad de la célula espinal, pero también es importante preservar la anatomía y la forma fisiológica de los sistemas involucrados. De hecho, la comprensión de la manera en que funciona el sistema nervioso -y otros sistemas complejos- debe basarse en un enfoque sistémico. Por esta razón, se eligió el embrión vivo de pez cebra como sistema modelo, y se evaluaron los cambios de voltaje de la membrana de la neurona espinal sin interferir con las condiciones fisiológicas de los embriones.

Aquí, se describe un enfoque que combina el empleo de embriones de pez cebra con un biosensor basado en FRET. Los embriones de pez cebra se caracterizan por un sistema nervioso muy simplificado y son particularmente adecuados para aplicaciones de imagen gracias a su transparencia, lo que permite el empleo de indicadores de voltaje basados en fluorescencia en la membrana plasmática durante el desarrollo del pez cebra. La sinergia entre estos dos componentes permite analizar la actividad eléctrica de las células en organismos vivos intactos, sin perturbar el estado fisiológico. Por último, este enfoque no invasivo puede coexistir con otros análisis (por ejemplo, registros de movimientos espontáneos, como se muestra aquí).

Introducción

El análisis in vivo del componente sistémico permite a los científicos investigar el comportamiento celular de la manera más confiable. Esto es particularmente cierto cuando la actividad bajo escrutinio está fuertemente influenciada por las interacciones célula-célula (tanto contacto como no contacto), como en el sistema nervioso, donde los cambios de voltaje de la membrana impulsan la comunicación entre las células excitables. La comprensión de la información codificada por estas señales eléctricas es la clave para entender la forma en que el sistema nervioso funciona tanto en estados fisiológicos como en estados de enfermedad.

Con el fin de estudiar las propiedades eléctricas de las células en las condiciones fisiológicas más no invasivas, varios indicadores de voltaje genéticamente codificados se han desarrollado recientemente 1 . A diferencia de las generaciones anteriores de sensores de voltaje óptico (principalmente sensibles a la tensión) 2 , las GEVI permiten análisis in vivo del sistema neural intacto, ySu expresión puede limitarse a tipos o poblaciones de células específicas.

El embrión de pez cebra es el "sustrato" in vivo de elección para aprovechar el gran potencial atribuido a los GEVI. De hecho, gracias a su claridad óptica y su sistema nervioso simplificado pero evolutivamente conservado, el modelo de pez cebra permite la identificación y manipulación directa de cada componente celular en una red. De hecho, el empleo de la GEVI basada en FRET Mermaid 3 condujo a la identificación de las alteraciones pre-sintomáticas en el comportamiento de la neurona motora espinal en un modelo de pez cebra de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) [ 4] .

El siguiente protocolo in vivo describe cómo monitorear las propiedades eléctricas de las neuronas motoras espinales en embriones intactos de pez cebra que expresan Mermaid de una manera neuronal específica. Por otra parte, se demuestra cómo farmacológicamente inducida chanEstas propiedades eléctricas pueden asociarse con alteraciones en la frecuencia de las bobinas espontáneas embrionarias, la actividad motora estereotípica que caracteriza el comportamiento del movimiento del pez cebra en etapas muy tempranas de desarrollo.

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Protocolo

1. pHuC_Mermaid Plásmido Generación

NOTA: Mermaid es un biosensor desarrollado mediante el acoplamiento del dominio de detección de voltaje (VSD) de la Ciona intestinalis (ahora Ciona robusta ) que contiene fosfatasa (Ci-VSP) con los fluoróforos del socio FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: donante) y una versión monomérica de la proteína fluorescente emisora ​​de naranja Kusabira Orange (mKOk: acceptor). Para este biosensor, los cambios conformacionales del dominio VSD, inducidos por la despolarización de la membrana, aumentan la proximidad de las proteínas fluorescentes dadoras y aceptoras, aumentando así la transferencia de energía entre ellas (aumentando la relación FRET) 3 . El VSD asegura la localización eficiente del biosensor en la membrana plasmática. La expresión neuronal del biosensor (en la médula espinal, la señal es detectable tanto en interneuronas como en neuronas motoras) se logra clonando la sirena opEn marco de lectura (ORF) bajo el pez cebra pan-neuronal promotor HuC [ 6] .

  1. Se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el ORF Mermaid del plásmido 3 de la sirena pCS4 + con la polimerasa de ADN Pfu (corrección) utilizando el cebador T3 Universal y el cebador Mermaid Sma I (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) para insertar un sitio de restricción SmaI aguas arriba De la Sirena ORF.
    1. Utilizar la siguiente mezcla de PCR: 0,5 μl de DNA polimerasa Pfu, 7,5 μl del tampón 10x específico, 1 μl de dNTP 10 mM, 2,5 μl de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,5 μl (50 ng) de la preparación de plásmido y 1 Μl de soluciones madre de 20 μM de cada cebador en un volumen total de 50 μl.
    2. Calentar la mezcla de PCR durante 15 s a 95 ° C, cebar durante 15 s a 50 ° C, y alargar durante 4 min a 72 ° C durante un total de 35 ciclos.
  2. Gel-purificar el concreto específicoPCR usando un kit comercial de purificación de gel, siguiendo el protocolo del fabricante.
  3. Clonar el fragmento de ADN en el vector blunt pCMV-SC siguiendo el protocolo del fabricante.
  4. Linearizar el plásmido positivo Mermaid (denominado pCMV-SC_Mermaid) con la enzima de restricción Sma I para la siguiente inserción del promotor HuC.
    1. Establecer la reacción de restricción de la siguiente manera: 0,5 μ l (10 U) de la enzima de restricción Sma I, 2 μ l del kit 10 x tampón, y 5 μ g de ADN plasmídico en un volumen total de 20 μ l. Incubar la reacción a 25 ° C durante 1 h.
  5. Gel-purificar el plásmido digerido utilizando un kit comercial de purificación de gel siguiendo el protocolo del fabricante.
  6. PCR-amplificar el promotor HuC (pHuC), con Pfu ADN polimerasa y zebrafish ADN genómico como plantilla, utilizando un par de HuC-primers específicos (HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA y HuCproM-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) y abarcando una región de 3.150 pb aguas arriba del ATG.
    1. Se preparó la mezcla de PCR usando el siguiente esquema: 0,5 μl de DNA polimerasa Pfu, 7,5 μl del tampón 10x específico, 1 μl de dNTP 10 mM, 2,5 μl de DMSO, 200 ng de ADN genómico y 1 μl de 20 μM Stock de cada cebador en un volumen total de 50 μl.
    2. Después de un paso inicial de 2 min a 95 ° C, calentar la mezcla de PCR durante 15 s a 95 ° C, cebar durante 15 s a 50 ° C, y alargarla durante 4 min a 72 ° C durante un total de 35 ciclos .
  7. Purificar con gel el producto de PCR blunt específico usando un kit comercial de purificación de gel siguiendo el protocolo del fabricante.
  8. Ligar una cantidad equimolar del pCMV-SC_Mermaid purificado (etapa 1.5) y del ADN de pHuC (etapa 1.7) usando 1 μl de T4 DNA ligasa y 1 μl del tampón 10X específico en un volumen total de 10 μl. Incubar la reacción durante 16 h a4ºC.
  9. Transformar una alícuota de células competentes con 5 μl de la reacción de ligación (paso 1.8) siguiendo las instrucciones del fabricante.
  10. Seleccionar los clones pHuC positivos (pHuC_Mermaid) con el promotor insertado en la orientación apropiada por una doble digestión Sal I- Eco RV (el sitio de restricción Sal I se ha insertado antes del fragmento promotor en la etapa 1.6, mientras que el sitio de restricción Eco RV Se sitúa aguas abajo de la región de poliadenilación, PolyA, del plásmido pCMV-SC).
    1. Establecer la reacción de restricción de la siguiente manera: 0,5 μ l (10 U) de ambos Sal I y Eco RV enzimas de restricción, 2 μ l del kit10X buffer, y 1 μ g de pHuC_Mermaid ADN en un volumen total de 20 μL. Incubar la reacción a 37 ° C durante 1 h. Ejecutar las reacciones sobre un gel de agarosa.

2. Microinyección de embriones

  1. Transferir el fertilizado por ejemploGs obtenido de cebra salvaje de tipo salvaje (cepa AB) o Sod1-G93R adulto 4 a una placa de Petri de 10 mm usando una pipeta de plástico.
  2. Enjuague los embriones en agua de pescado fría (4 ° C) e inmediatamente microinyúdalos en la yema con 200 μg de plásmido pHuC_Mermaid usando un microinyector (para una descripción general y detallada del procedimiento de microinyección, ver Referencias 7 y 8).
  3. Utilizando una pipeta de plástico, transfiera los embriones a una placa de Petri y los incube en agua de pescado a 28 ° C hasta que alcancen la etapa de desarrollo deseada (20-24 h después de la fertilización, hpf) para los siguientes análisis.

3. Análisis espontáneo de la cola de cola

NOTA: Evaluar el comportamiento espontáneo de enrollamiento de la cola en embriones de 20-24 hpf con o sin el riluzol del fármaco.

  1. Transferir un embrión a una placa de Petri redonda de 90 mm llena de agua de pescado que contenga 0,2% de DMSO (vehículo riluzol) y descomprímala manualmente usando twO pinzas de joyería con puntas afiladas. Incubar el embrión durante 5 min.
  2. Detectar el enrollamiento de cola a RT durante una grabación de vídeo de 1 minuto usando una cámara digital montada en un estereomicroscopio. Adquiera series temporales con una resolución de 30 fotogramas por segundo.
  3. Calcule la frecuencia de las bobinas espontáneas de la cola contando el número de curvas (tanto contralateral como ipsilateral) por unidad de tiempo.
  4. Para evaluar el efecto del fármaco riluzol, utilice suavemente una pipeta Pasteur de plástico para transferir el embrión a una nueva placa de Petri de 90 mm llena de agua de pescado que contenga riluzol 5 μM.
    1. Incubar el embrión durante 5 minutos antes de grabar un video de 1 minuto y realizar el análisis de comportamiento como el anterior.

4. Configuración de imágenes para la visualización de biosensores de sirena en embriones vivos: detección simultánea de señales de donantes y aceptoras

  1. Montar los embriones de 20 - 24 hpf en 1% de agarosa de bajo punto de fusión en agua de pescado al37 ° C dentro de un plato de imagen de fondo de vidrio de 35 mm. Oriente los embriones en sus lados. Espere hasta que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente.
  2. Transferir el plato de imagen a la etapa de un confocal invertido montado en un microscopio invertido. Identificar las neuronas motrices que expresan el biosensor con un objetivo 20X (0.7 apertura numérica, NA) mediante la excitación de la mUKG con la línea de 488 nm de láser de argón y el registro de su emisión entre 495 y 525 nm.
  3. Para una medición de FRET, excite mUKG, el donante del par FRET, con la línea láser de 488 nm. Detecta simultáneamente, con un escáner resonante que opera a 8.000 Hz en el modo bidireccional, la fluorescencia emitida por el donante (entre 495 y 525 nm) y la fluorescencia emitida por el receptor mKOk (entre 550 y 650 nm, canal FRET). Si está disponible, utilice el láser de 473 nm.
    NOTA: La eficiencia de excitación del donante se reducirá ligeramente (85% en lugar de 93% con 488 nm), pero la excitación cruzada del aceptor será(Del 17% con el 488 nm al 9% con línea láser de 473 nm).
  4. Para reducir la fototoxicidad y el blanqueo con fluoróforos, minimice la iluminación de la muestra reduciendo la potencia de la línea láser (en la ventana de la trayectoria del haz del software de adquisición).
  5. Optimice la excitación para que coincida con los parámetros de ganancia y compensación que se establecen al comienzo del experimento y se mantienen constantes durante toda la sesión. Para ajustar el offset, cambie el color de la imagen a los valores de intensidad (usando la tabla de búsqueda Q) y, mientras escanea con el láser apagado, gire la perilla de desplazamiento (offset inteligente) para que los píxeles de fondo tengan una intensidad ligeramente Mayor que cero. Con la misma tabla de consulta, encendiendo el láser durante la exploración, gire la perilla de ganancia (ganancia inteligente) para maximizar la relación señal-ruido, teniendo cuidado de evitar píxeles saturados.
  6. Usando un agujero abierto (2 unidades aireadas), adquiera imágenes de 16 bits para proporcionar un rango dinámico suficiente para el cuantitativoE análisis. Evite promediar para aumentar la velocidad de adquisición y para minimizar el fotoblanqueo.
  7. En la ventana de adquisición de software, seleccione un tamaño de campo de imagen de 512 x 64 píxeles (tamaño de píxel: 605 nm) en el menú desplegable.
  8. Desde la ventana del modo de adquisición, seleccione xyt (lapso de tiempo en un solo plano xy) desde el menú desplegable y registre los cambios en el voltaje de la neurona espinal embrionaria mediante la adquisición de un solo plano xy, estableciendo los parámetros de adquisición para grabar una imagen cada 30 Ms durante 1 min.
  9. Para evaluar el efecto de la administración de riluzol en la despolarización de la membrana en la misma neurona, adquirir un nuevo conjunto de datos 5 min después de la adición de agua de pescado que contiene 5 μ M riluzol.
  10. Para el análisis FRET, utilice la macro ImageJ Biosensor_FRET (que expresa biosensores FRET de cadena sencilla.
  11. Evaluar la relación de FRET de membrana basal de cada neurona en t 1 como ((FRET media - FRET fondo) / (Donante medio - Donante de fondo)), donde FRET y DonO intensidad media es la intensidad media de fluorescencia calculada en la misma región de interés (ROI) dibujada alrededor de la célula para cada canal adquirido y FRET y donante de fondo es la intensidad de fluorescencia media calculada en un ROI del campo de visión sin la muestra fluorescente.
    NOTA: Una descripción detallada paso a paso del uso del plugin se puede encontrar en el sitio web www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret .
  12. Utilice un software gráfico para comparar la frecuencia, amplitud y duración de la despolarización entre diferentes paradigmas experimentales. Comparar dos grupos usando un test t de Student no pareado y considerar los valores medios como estadísticamente diferentes cuando P <0,05.

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Resultados

Un vector de expresión que portaba la secuencia codificante de biosensor Mermaid basada en FRET bajo el control del promotor pan-neuronal pHuC, que impulsa la síntesis de la proteína exclusivamente en el sistema nervioso, se suministró en huevos fertilizados de una sola célula por medio de una microinyección en Con el fin de obtener embriones transgénicos transitorios ( Figura 1 , Panel izquierdo). Después de dominar la técnica de microinyección, el po...

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Discusión

El protocolo presentado aquí nos permitió explorar la asociación entre las propiedades eléctricas de las neuronas motoras espinales embrionarias del pez cebra y el comportamiento de bobinado espontáneo, la primera actividad motora estereotípica, que aparece alrededor de 17 hpf de desarrollo embrionario y dura hasta 24 hpf 10 .

Nuestro enfoque proporciona a los investigadores una herramienta para estudiar el sistema neural de embriones intactos, preservando completamen...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer a Simona Rodighiero su inestimable apoyo con el análisis de imágenes FRET.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agarosa de bajo punto de fusión Sigma-AldrichA9414
DMSO Sigma-AldrichW387520
RiluzoleSigma-AldrichR116
Pfu Ultra HQ ADN polimerasa Agilent Technologies - División de productos Stratagene600389
T3 Imprimación universal Sigma-Aldrich
Wizard SV Gel y sistema de limpieza PCRPromegaA9280
Imprimación universal SmaI Sistema de vectores de expresión de mamíferos Eurofins
StrataClone / vector romo pCMV-SC Agilent Technologies - División de Productos Stratagene 
SmaI New England BiolabsR0141S
T4 ADN ligasaPromegaM1801
SalINew England BiolabsR0138S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
35 mm, plato de imágenes con fondo de vidrio Pinza Ibidi81151
Sigma-AldrichF6521
Microscopio estereoscópicoLeica MicrosystemsM10 F
Cámara digitalLeica MicrosystemsDFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 software Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4Apple
Microscopio confocal (invertido)Leica MicrosystemsTCS SP5
 Eppendorf Femtojet
ImageJ macro Biosensor_FRET 
Prisma GraphPad 6.0c GraphPad Software, Inc
240228Microinyector

Referencias

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
  2. Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
  4. Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515(2016).
  5. Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).
  6. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
  7. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  9. Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  10. Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
  11. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
  12. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
  13. Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566(2016).

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