Los protocolos descritos aquí permiten el estudio de las propiedades eléctricas de las células excitables en las condiciones fisiológicas más no invasivas mediante el empleo de embriones de pez cebra en un sistema in vivo junto con un indicador de voltaje genéticamente codificado (GEVI) basado en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) expresado selectivamente en el tipo de célula de interés.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los protocolos descritos aquí están diseñados para permitir a los investigadores estudiar la comunicación celular sin alterar la integridad del entorno en el que se encuentran las células. En concreto, se han desarrollado para analizar la actividad eléctrica de las células excitables, como las neuronas espinales. En tal escenario, es crucial preservar la integridad de la célula espinal, pero también es importante preservar la anatomía y la forma fisiológica de los sistemas involucrados. De hecho, la comprensión de la manera en que funciona el sistema nervioso -y otros sistemas complejos- debe basarse en un enfoque sistémico. Por esta razón, se eligió el embrión vivo de pez cebra como sistema modelo, y se evaluaron los cambios de voltaje de la membrana de la neurona espinal sin interferir con las condiciones fisiológicas de los embriones.
Aquí, se describe un enfoque que combina el empleo de embriones de pez cebra con un biosensor basado en FRET. Los embriones de pez cebra se caracterizan por un sistema nervioso muy simplificado y son particularmente adecuados para aplicaciones de imagen gracias a su transparencia, lo que permite el empleo de indicadores de voltaje basados en fluorescencia en la membrana plasmática durante el desarrollo del pez cebra. La sinergia entre estos dos componentes permite analizar la actividad eléctrica de las células en organismos vivos intactos, sin perturbar el estado fisiológico. Por último, este enfoque no invasivo puede coexistir con otros análisis (por ejemplo, registros de movimientos espontáneos, como se muestra aquí).
Introducción
El análisis in vivo del componente sistémico permite a los científicos investigar el comportamiento celular de la manera más confiable. Esto es particularmente cierto cuando la actividad bajo escrutinio está fuertemente influenciada por las interacciones célula-célula (tanto contacto como no contacto), como en el sistema nervioso, donde los cambios de voltaje de la membrana impulsan la comunicación entre las células excitables. La comprensión de la información codificada por estas señales eléctricas es la clave para entender la forma en que el sistema nervioso funciona tanto en estados fisiológicos como en estados de enfermedad.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. pHuC_Mermaid Plásmido Generación
NOTA: Mermaid es un biosensor desarrollado mediante el acoplamiento del dominio de detección de voltaje (VSD) de la Ciona intestinalis (ahora Ciona robusta ) que contiene fosfatasa (Ci-VSP) con los fluoróforos del socio FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: donante) y una versión monomérica de la proteína fluorescente emisora de naranja Kusabira Orange (mKOk: acceptor). Para este biosensor, los cambios conformacionales del dominio VSD, inducidos por la despolarización de la membrana, aumentan la proximidad de las proteínas fluorescentes dadoras y aceptoras, aumentando así la transfer....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Un vector de expresión que portaba la secuencia codificante de biosensor Mermaid basada en FRET bajo el control del promotor pan-neuronal pHuC, que impulsa la síntesis de la proteína exclusivamente en el sistema nervioso, se suministró en huevos fertilizados de una sola célula por medio de una microinyección en Con el fin de obtener embriones transgénicos transitorios ( Figura 1 , Panel izquierdo). Después de dominar la técnica de microinyección, el po.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El protocolo presentado aquí nos permitió explorar la asociación entre las propiedades eléctricas de las neuronas motoras espinales embrionarias del pez cebra y el comportamiento de bobinado espontáneo, la primera actividad motora estereotípica, que aparece alrededor de 17 hpf de desarrollo embrionario y dura hasta 24 hpf 10 .
Nuestro enfoque proporciona a los investigadores una herramienta para estudiar el sistema neural de embriones intactos, preservando completamen.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores quieren agradecer a Simona Rodighiero su inestimable apoyo con el análisis de imágenes FRET.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa de bajo punto de fusión | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ ADN polimerasa | Agilent Technologies - División de productos Stratagene | 600389 | |
| T3 Imprimación universal | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV Gel y sistema de limpieza PCR | Promega | A9280 | |
| Imprimación universal SmaI | Sistema de vectores de expresión de mamíferos Eurofins | ||
| StrataClone / vector romo pCMV-SC | Agilent Technologies - División de Productos Stratagene | ||
| SmaI | New England Biolabs | R0141S | |
| T4 ADN ligasa | Promega | M1801 | |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 mm, plato de imágenes con fondo de vidrio | Pinza Ibidi | 81151 | |
| Sigma-Aldrich | F6521 | ||
| Microscopio estereoscópico | Leica Microsystems | M10 F | |
| Cámara digital | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | ||
| Microscopio confocal (invertido) | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Eppendorf | Femtojet | ||
| ImageJ macro Biosensor_FRET | |||
| Prisma GraphPad 6.0c | GraphPad Software, Inc |
Referencias
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physi....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
