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Artículo de método

Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

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DOI:

10.3791/55301

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15 de agosto de 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology, Cornell University

En este artículo

Resumen

Planta las conexiones intercelulares, los plasmodesmos (Pd), juegan un papel central en la planta las interacciones planta-virus y fisiología. Crítica para el transporte de Pd son clasificación señales que dirigen las proteínas a Pd. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de estas secuencias es todavía en su infancia. Se describe una estrategia para identificar señales de localización de Pd en proteínas orientada a Pd.

Resumen

Plasmodesmos (Pd) son las conexiones de la célula a célula que funcionan como puertas de enlace a través del cual se transportan las moléculas grandes y pequeñas entre las células vegetales. Considerando que el transporte de Pd de pequeñas moléculas, como iones y agua, se presume para ocurrir pasivamente, transporte célula a célula de las macromoléculas biológicas, tales proteínas, probablemente se produce mediante un mecanismo activo que involucra señales específicas de focalización en la molécula transportada. La escasez de señales de localización identificados plasmodesmos (Pd) (PLSs) ha restringido severamente la comprensión de la proteína-clasificación vías implicadas en la planta transporte macromolecular de la célula a célula y la comunicación. De una amplia variedad de plantas endógenas y virales proteínas conocidas al tráfico a través de la Pd, PLSs sólo tres han divulgado hasta la fecha, todas ellas de proteínas endógenas de la planta. Por lo tanto, es importante desarrollar una estrategia experimental confiable y sistemática para identificar una secuencia funcional de PLS, que es necesario y suficiente para apuntar Pd, directamente en la vida de las células de la planta. Aquí, describimos una estrategia de este tipo utilizando como paradigma de la proteína de movimiento célula a célula (MP) del virus del mosaico del tabaco (TMV). Estos experimentos, que identificaron y caracterizaron el primer planta PLS viral, puede ser adaptados para el descubrimiento de secuencias PLS en proteínas más orientada a Pd.

Introducción

Plasmodesmos (Pd) funcionan como conductos para el transporte intercelular de los reguladores claves del desarrollo de la planta y la morfogénesis, que van desde factores de transcripción a ARNm y pequeñas moléculas de ARN. Además, esta capacidad de transporte macromolecular de la EP es utilizada por la mayoría virus de planta para su diseminación intercelular durante la infección; para desplazarse por Pd, virus de plantas han evolucionado las proteínas especializadas, como proteínas de movimiento (MPs), que se dirigen específicamente a Pd1,2,3,4,5,6 , 7. vías moleculares de transporte Pd probablemente están íntimamente interconectadas con las secuencias específicas que atacan las proteínas transportadas en estas vías. Así, la identificación de estas señales de localización de Pd (PLSs) puede ser diagnóstico de la vía de transporte Pd correspondiente. Esto es por analogía de Pd transporte8, por ejemplo, la importación nuclear diferentes caminos, que pueden ser específicos para diferentes localización nuclear (NLS) de señal secuencias9,10. Conceptualmente, la NLSs y PLSs representan no escindibles subcelulares dirigidos a secuencias necesarias y suficientes para dirigir. Sin embargo, a diferencia de la NLSs11, la información de la secuencia sobre PLSs es severamente limitada. Específicamente, solamente cuatro secuencias de la proteína involucradas en la orientación de la Pd se han divulgado, con todos ellos derivados de proteínas endógenas de la planta. La primera está representada por un dominio de homeobox de KN112 – un factor de transcripción que se desplaza de las capas internas de la célula a la epidermis de la planta hoja13 – y sus homólogos de KNOX14. El segundo también es de un factor de transcripción, Dof, que contiene una supuesta PLS calificó el tráfico intercelular (IT) tema15. Es la tercera secuencia de la proteína de membrana de PDLP1 residente en plasmodesmos tipo 1, y está representado por un dominio transmembrana16. Por último, el cuarto Pd a secuencia fue divulgado recientemente de glicosilfosfatidilinositol (GPI)-proteínas ancladas y está representada por la modificación de glicosilfosfatidilinositol (GPI) señal17.

Curiosamente, hasta hace poco, no PLSs se han divulgado para MPs virales. Estudios previos indicaron la presencia de supuestas secuencias PLS en planta MPs virales18,19, pero no verdadera PLS, es decir, una secuencia de aminoácidos mínimo necesaria y suficiente para Pd contra una carga sin relación () molécula e.g., PPC) ha sido identificada en un MP viral. Sin embargo una de estas proteínas, MP del virus del mosaico del tabaco (TMV), fue el primero que Pd localización y transporte han sido demostrado20.

Para hacer frente a este vacío, hemos desarrollado una estrategia experimental para identificar TMV MP PLS. Esta estrategia se basa en tres conceptos. (i) define PLS como una secuencia de aminoácidos mínimo que es necesario y suficiente para apuntar de la proteína a Pd21. (ii) porque la MP del TMV Pd se dirige primero y luego se transloca a través de estos canales22, apuntamos a desacoplar estos dos actividades e identificando el PLS de buena fe, que funciona sólo para apuntar Pd y no para el transporte posterior. (iii) se analizaron PLS identificado para residuos de aminoácidos importantes para su EP dirigidos a la actividad, ya sea estructural o funcional. Usando este acercamiento, delineó una secuencia 50-amino ácida del residuo en el amino terminal de la MP del TMV que actúa como auténtico PLS. Esto se hace produciendo una serie de fragmentos de la MP del TMV que satura toda la longitud de la proteína, marcado su carboxilo-termini con PPC y transitoriamente expresarlos en los tejidos vegetales. Localización de la PD de cada uno de los fragmentos prueba determinó coexpressing con una proteína del marcador de Pd, PDCB1 (proteína 1 de Unión Callosa Pd)23. El fragmento más pequeño que todavía había localizado en Pd, pero no lo hizo atravesar Pd, era considerado para representar PLS. Finalmente, lo PLS fue alanina-explorado para determinar los residuos de aminoácidos clave para su estructura o función.

Mientras que aquí ilustramos este enfoque describiendo la identificación de la MP del TMV PLS, pueden ser empleado para descubrir PLSs en cualquier otras proteínas orientada a Pd, ya sea codificado por patógenos o por las plantas Esto es porque nuestro método no aprovechar cualquier características únicas de las MPs virales con respecto a su capacidad de destino a Pd.

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Protocolo

1. Material vegetal

  1. Elección de especies vegetales
  2. Uso de la especie de planta nativa de la proteína de interés, es decir, uno que codifica esta proteína proteínas endógenas o que representa el huésped natural para el patógeno para las proteínas virales. Además, las especies seleccionadas deben ser susceptibles del elegido método de transformación genética transitoria.
    Nota: Los estudios emplean rutinariamente Nicotiana benthamiana, que representa un buen anfitrión para TMV y se transforma eficientemente por la técnica de transformación genética mediada por Agrobacterium, es decir, agroinfiltration (ver paso 3). Las plantas de N. benthamiana también se cultivan fácilmente y tienen hojas grandes, que son fácilmente inoculadas por Agrobacterium y fácilmente analizadas por microscopia confocal.
  3. Crecimiento de las plantas
    1. Planta semillas de N. benthamiana en suelo mojado en alta densidad. Mantenerlas en una cámara de ambiente controlado en 20-25 ° c bajo 16 h de luz ~ 75 μmol de fotones m-2 s-1 y 8 h de oscuridad. Después de que el diámetro de euphyll llega a 0,5 cm, cuidadosamente transfiera las plantas de semillero a macetas más grandes y continuar el crecimiento en la misma cámara en las mismas condiciones.
    2. Mantener las plantas hasta que crecen a 4-8-hojas dentro de 4 semanas cuando las hojas más grandes son 4-6 cm de diámetro; en este momento, pueden ser utilizados para agroinfiltration (ver paso 3).
      Nota: Importante, no utilice las plantas si comenzaron a florecer porque, en esta etapa del desarrollo, la arquitectura de la hoja varía a menudo24,25, a veces lleva a resultados inconsistentes.

2. construcción del Vector de expresión

  1. Elección del sistema de la expresión
    1. Elegir la expresión sistema, es decir, vectores y vectores método de entrega, más adecuado para la expresión de la proteína de interés en las especies de plantas estudiadas.
      Nota: En ocasiones, tales combinaciones específicas de proteína/especies probadas pueden requieren vectores específicos y vectores método de entrega para la expresión óptima y función de la proteína de interés. De plantas dicotiledóneas más, sin embargo, seleccionar plásmidos binarios como vectores de expresión y agroinfiltration como sistema de entrega.
  2. Proteína fluorescente etiquetado
    1. Etiqueta fluorescente cada proteína expresada para el análisis de su distribución subcelular22, incluyendo localización de Pd.
      Nota: Emplear proteínas autofluorescent, como PPC y DsRed2, como etiquetas. Etiqueta de la proteína prueba con PPC y coexpresan con un DsRed2 gratis. Funciones CFP como etiqueta y como una molécula de carga no relacionadas con virus. Funciones DsRed2 para calibrar la eficiencia global de la expresión transitoria y, por ser la célula autónoma, para identificar la célula inicialmente transformada; Esta última función es importante al evaluar el movimiento célula a célula de proteínas prueba potencialmente no celular-autónomos. Para coexpression con el marcador de Pd PDCB1, que también es la célula autónoma, etiqueta de la proteína prueba con el CFP y PDCB1 con DsRed2.
    2. Como regla general, fusible de la etiqueta de autofluorescent para la terminal carboxilo de la proteína expresada. Sin embargo, si las exposiciones tagged proteína prueba larga duración dirigidos a Pd, traslado la etiqueta al término amino de la proteína.
    3. Copia las secuencias de codificación de las proteínas para ser probado en un vector de expresión conveniente de la planta.
      Nota: Hay muchos vectores de expresión plantas que permiten etiquetado fluorescente. Utilizamos una serie de pSAT plásmidos26 o algunos de sus derivados27,28, que son convenientes para la clonación de la secuencia de interés directamente en marco con las etiquetas autofluorescent sugerido (ver paso 2.2.1) en ambos amino- y orientaciones del carboxilo terminal.
    4. Transferir cada cassette de expresión en un vector binario de Agrobacterium.
      Nota: Aunque construcciones basadas en pSAT son adecuadas para la entrega de la biolística directa en los tejidos vegetales, agroinfiltration, que es el método de transformación recomendado aquí (ver paso 3), requiere que el casete de expresión que se encuentra entre el T-ADN las fronteras de un binario vector29.
      Nota: Todos los vectores pSAT están diseñados para permitir dicha transferencia al pPZP RCS2 multigénica expresión vector binario26,30 por un solo paso de clonación mediante nucleasas de corte raro AscI-PpoI-SceI, -CeuI, PspI PI y PI-TliI 26. investigadores que prefieren utilizar la clonación recombinatorial, p. ej., usando sitios heterólogos lox 31pueden emplear pSAT vector variantes26,27.
    5. Para coexpression, transferencia de dos casetes de expresión, por ejemplo, proteína-PPC probada y DsRed2 o probado proteína-CFP y DsRed2 PDCB1 (ver punto 2.1), el mismo vector binario RCS2 pPZP.
      Nota: Como alternativa, culturas de Agrobacterium albergar constructos binarios individuales se pueden mezclar juntos para infiltración en N. benthamiana (ver paso 3.1).

3. Agroinfiltration

  1. Añadir 1 μg de un plásmido pPZP RCS2 basado en cultura de paso 2.2.5 a 100 μl de células competentes de cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105 o GV3101 preparado descrito32, incubar en hielo por 30 min, flash-congelación en nitrógeno líquido durante 1 minuto, y incubar a 28 ° C durante 15 minutos.
    1. Luego, añadir 1 mL de medio LB (10 G/l triptona, extracto de levadura 5 g/L y 10 g/L de NaCl) a la mezcla de células competentes e incubar a 28 ° C por 2 h. vuelta hacia abajo de las células a 3.000 x g durante 1 min, volver a suspenderlas en 0,2 mL de LB y placas de LB agar suplementado con antibióticos apropiados (p. ej., espectinomicina 100 mg/L y 50 mg/L rifampicina pPZP RSC2 basado en vectores26,30). Crezca a 28 ° C durante 48 h, hasta colonias individuales son visibles.
  2. Recoger y placa varias colonias individuales sobre una placa fresca de agar LB (ver paso 3.1), crecen en 28 ° C durante 48 h y tomar una pequeña cantidad de bacterias para el análisis por PCR de Colonia33 para confirmar la presencia de los constructos binarios específicos.
  3. Crecer cada colonia de Agrobacterium con el constructo de interés durante la noche a 28 ° C en 5 mL de medio LB suplementado con antibióticos apropiados (ver paso 3.1.1). Centrifugar las células a 3.000 x g y vuelva a suspenderlos OD600= 0,5 en agroinfiltration buffer (10 mM de MgCl2, 10 mM MES (pH 5.6), 150 μm acetosiringona). Incubar por 2 h a temperatura ambiente.
    1. Si se utiliza una mezcla de plásmidos binarios en lugar de un plásmido de expresión multigénica solo para el coexpression de proteína, mezcla las culturas de célula correspondientes en proporción de 1:1 v/v antes de la infiltración. Luego Incube las células a 28 ° C por 2 h.
  4. Cargar el inóculo en una jeringa de plástico de 1 mL y sale de la boquilla de la jeringa (sin aguja) contra la epidermis inferior (abaxial) de los completamente maduros N. benthamiana de la prensa. Sostenga la hoja con un dedo enguantado en la cara adaxial34,35.
    1. Introducir el Agrobacterium en medio de la infiltración por inyección lenta. Para la significación estadística, infiltrarse en varias hojas en cada planta.
      Nota: Tenga en cuenta que las hojas más viejas no se utilizan como no rinden niveles de expresión coherente.
    2. Inocular hojas todo in situ. Mantener la planta infiltrada hasta la observación como se describe en el paso 1.2.

4. confocal microscopio

  1. Use una cuchilla para cortar cada hoja en fragmentos entre las venas 24-48 h después de la infiltración, (dependiendo de la eficacia de la expresión transitoria de la proteína específica de la prueba); el tamaño de cada rebanada de tejido debe ser tal que el segmento está totalmente cubierto por el vidrio de cubierta (22 mm x 40 m m) usado para microscopía.
  2. Deslizan las láminas de la hoja en el objeto con la superficie abaxial de la hoja hacia arriba, coloque una gota de agua en el segmento de hoja y cubrir con la cubierta de vidrio. Inmovilizar el vidrio de cubierta con pequeños trozos de cinta en cada lado.
  3. Observar los tejidos agroinfiltrated bajo un microscopio confocal de escaneo láser y grabar las imágenes resultantes.
    1. En primer lugar, utilice un objetivo de 10 X para identificar las células con la señal y luego usar 63 x objetivo de observaciones más detalladas.
    2. Uso el 458 nm longitud de onda un láser de ion argón para excitar PPC y 543 nm para excitar DsRed2. Guarde todos los ajustes para la adquisición de la imagen, es decir, intensidad de laser y photomultiplier tubo (PMT) ajustes, entre experimentos. En promedio, examinar las células de 100-120 para cada condición experimental.

5. identificación de los PLS

  1. Diagnosticar la localización de la proteína prueba utilizando microscopio confocal (sección 4). Comprobar si la proteína probada tiene el característico patrón punteado periférico25,36,37,38,39,40,41 y colocalizes con el marcador de Pd PDCB123. Esto indica que la proteína probada más probable es que contiene secuencias PLS.
  2. Después de confirmación de la actividad PLS de proteínas probadas, progresivamente subdividir su marco de lectura abierto (ORF) (número de genbank BAF93925.1) en fragmentos más pequeños, autofluorescently, (por ejemplo, PCP) etiqueta cada uno de ellos y analizar su localización subcelular como se describe en el paso 4. Inicialmente, se recomienda el tamaño de 100 residuos de aminoácidos para cada fragmento subdividido.
  3. Subdividir aún más los fragmentos truncados que tienen la actividad PLS y compruebe su localización subcelular como se describe en el paso 4 hasta el fragmento más pequeño que todavía se localiza a Pd, es decir, es suficiente para el transporte de la carga de etiqueta autofluorescent EP, se identifica. Este fragmento se supone para representar la secuencia PLS.
  4. Eliminar el supuesta PLS de la proteína prueba integral, es decir, la parte restante de la proteína prueba sin supuesta PLS autofluorescent etiqueta del fusible y determinar la localización subcelular de la proteína del mutante resultante como se describe en el paso 4. Si esta proteína mutante que carece del supuesta PLS no logra localizar a Pd, esto indicará que el identificado PLS no es solamente suficiente (véase paso 5.3), pero también necesario para el transporte de la Pd de la proteína prueba.
  5. Agroinfiltrate las hojas con una mezcla de culturas de Agrobacterium albergar la expresión construyen para el CFP-tagged PLS y DsRed2 libre (véase el paso 3.3). Observar el tejido infiltrado con microscopio confocal con objetivo de 10 x con la misma configuración en el paso 4.3.
  6. Puntuación de las celdas que contienen señales de PPC y DsRed2 como células inicialmente infiltradas y marcar las células adyacentes que contenía sólo la señal de la política pesquera común que ese movimiento de exposición.
    Nota: Este paso examina el PLS identificado por su potencial capacidad de movimiento de célula a célula; Esto es porque muchas proteínas que Pd (mayoría incluya planta de MPs virales) también se mueven a través de la Pd a las células vecinas. La concentración de Agrobacterium utilizada para la infiltración depende de la eficacia de la expresión de diferentes estructuras respectivamente. Para agroinfiltration, asegúrese de utilizar la dilución de la cultura de célula que garantiza (i) transformación de las células, dejando las células adyacentes transformaciones, (ii) alcanza una eficacia similar de la expresión. Por ejemplo, nuestros experimentos utilizan OD600 de 0.01 y 0.005 para la expresión de CFP-tagged PLS y DsRed2 libre, respectivamente.

6. identificación de residuos clave PLS con alanina análisis42

  1. Utilizar protocolos de PCR para amplificar el PLS codificación secuencia empleando a un par de cartillas diseñadas para contener la mutación deseada, es decir, sustitución del residuo del aminoácido blanco con alanina, alrededor de la región central de cada cartilla, como se describe 21. llevar a cabo el primer diseño y el uso del kit de mutagénesis sitio-dirigida por mutagénesis sitio-dirigida según las instrucciones del fabricante.
  2. Purificar los productos resultantes de la polimerización en cadena usando cualquier estándar kit de purificación de DNA y digerirlos a 37 ° C con DpnI para eliminar el parental (es decir, no transformado) desnaturalizado y hemimethylated la DNA. Esto enfriar durante 5 min a temperatura ambiente (no con hielo). Luego transformar la mezcla directamente en células competentes de e. coli 43e identificar colonias con las construcciones mutantes deseadas como se describe en el paso 3.2.
  3. Introducir las construcciones mutantes en el vector binario tal como se describe en el paso 2.2.4 realizar agroinfiltration como se describe en el paso 3 y evaluar Pd dirigido a como se describe en los pasos 4 y 5.1.

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Resultados

Los datos representativos, que fielmente ilustran los resultados esperados de los protocolos descritos e identifican la TMV MP PLS, se adaptan de Yuan et al. 21. figura 1A resume primero principales construcciones expresando el MP de TMV larga duración (1-268), TMV MP PLS (formada por los primeros 50 residuos de aminoácidos de la proteína, 1-50), y la alanina análisis derivados de V4A fusionado al CFP (generado como se describe en pasos 2....

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Discusión

Este protocolo tiene cuatro componentes fundamentales: el concepto de identificación de una secuencia que es necesario y suficiente para apuntar a Pd, división sistemática de la proteína de interés en los fragmentos que se reducen progresivamente en longitud, la prueba de fusión fragmentos de una proteína autofluorescent que sirve como etiqueta y como carga macromolecular y análisis funcional de EP objetivo en la vida de la planta tejidos después de la expresión transitoria de las proteínas de fusión probado. Tenga en cu...

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Divulgaciones

No hay conflicto de interés declarado.

Agradecimientos

La falta de espacio, hemos citado sobre todo artículos de revisión, y pedimos disculpas a nuestros colegas cuyo trabajo original no fue citado. El trabajo en el laboratorio de V.C. es apoyado por becas del NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD y BSF a V.C., y el laboratorio de SGL es apoyado por los NIH y los fondos de los departamentos de Fitopatología y biología planta-microorganismo a SGL

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio de barrido láser confocal (CLSM)ZeissLSM5Cualquier CLSM con capacidades similares es apropiado
Software Zen para la obtención de imágenes de microscopio confocalZeissversión 2009El software debe ser compatible con el CLSM utilizado por el
kit de mutagénesis dirigida al sitio Quickchange II Agilent200523
AcetosiringonaSigma-AldrichD134406
MESSigma-Aldrich69892
Jeringas sin agujasBD309659
MgCl2FisherScientificM33-500
Spectinomycin Sigma-AldrichS4014
RifampicinaSigma-AldrichR3501
Ampicilina Sigma-AldrichA0166

Referencias

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