Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

Summary

Planta las conexiones intercelulares, los plasmodesmos (Pd), juegan un papel central en la planta las interacciones planta-virus y fisiología. Crítica para el transporte de Pd son clasificación señales que dirigen las proteínas a Pd. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de estas secuencias es todavía en su infancia. Se describe una estrategia para identificar señales de localización de Pd en proteínas orientada a Pd.

Abstract

Plasmodesmos (Pd) son las conexiones de la célula a célula que funcionan como puertas de enlace a través del cual se transportan las moléculas grandes y pequeñas entre las células vegetales. Considerando que el transporte de Pd de pequeñas moléculas, como iones y agua, se presume para ocurrir pasivamente, transporte célula a célula de las macromoléculas biológicas, tales proteínas, probablemente se produce mediante un mecanismo activo que involucra señales específicas de focalización en la molécula transportada. La escasez de señales de localización identificados plasmodesmos (Pd) (PLSs) ha restringido severamente la comprensión de la proteína-clasificación vías implicadas en la planta transporte macromolecular de la célula a célula y la comunicación. De una amplia variedad de plantas endógenas y virales proteínas conocidas al tráfico a través de la Pd, PLSs sólo tres han divulgado hasta la fecha, todas ellas de proteínas endógenas de la planta. Por lo tanto, es importante desarrollar una estrategia experimental confiable y sistemática para identificar una secuencia funcional de PLS, que es necesario y suficiente para apuntar Pd, directamente en la vida de las células de la planta. Aquí, describimos una estrategia de este tipo utilizando como paradigma de la proteína de movimiento célula a célula (MP) del virus del mosaico del tabaco (TMV). Estos experimentos, que identificaron y caracterizaron el primer planta PLS viral, puede ser adaptados para el descubrimiento de secuencias PLS en proteínas más orientada a Pd.

Introduction

Plasmodesmos (Pd) funcionan como conductos para el transporte intercelular de los reguladores claves del desarrollo de la planta y la morfogénesis, que van desde factores de transcripción a ARNm y pequeñas moléculas de ARN. Además, esta capacidad de transporte macromolecular de la EP es utilizada por la mayoría virus de planta para su diseminación intercelular durante la infección; para desplazarse por Pd, virus de plantas han evolucionado las proteínas especializadas, como proteínas de movimiento (MPs), que se dirigen específicamente a Pd^1,2,3,4<....

Protocol

1. Material vegetal

1. Elección de especies vegetales
2. Uso de la especie de planta nativa de la proteína de interés, es decir, uno que codifica esta proteína proteínas endógenas o que representa el huésped natural para el patógeno para las proteínas virales. Además, las especies seleccionadas deben ser susceptibles del elegido método de transformación genética transitoria.
   Nota: Los estudios emplean rutinariamente Nicotiana benthamiana, que representa un buen anfitrión para TMV y se transforma eficientemente por la técnica de transformación genética mediada por Agrobacterium, es decir, agroinfiltration (ver paso 3). Las pl....

Results

Los datos representativos, que fielmente ilustran los resultados esperados de los protocolos descritos e identifican la TMV MP PLS, se adaptan de Yuan et al. ²¹. figura 1A resume primero principales construcciones expresando el MP de TMV larga duración (1-268), TMV MP PLS (formada por los primeros 50 residuos de aminoácidos de la proteína, 1-50), y la alanina análisis derivados de V4A fusionado al CFP (generado como se describe en pasos 2........

Discussion

Este protocolo tiene cuatro componentes fundamentales: el concepto de identificación de una secuencia que es necesario y suficiente para apuntar a Pd, división sistemática de la proteína de interés en los fragmentos que se reducen progresivamente en longitud, la prueba de fusión fragmentos de una proteína autofluorescent que sirve como etiqueta y como carga macromolecular y análisis funcional de EP objetivo en la vida de la planta tejidos después de la expresión transitoria de las proteínas de fusión probado. Tenga en cu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio de barrido láser confocal (CLSM)	Zeiss	LSM5	Cualquier CLSM con capacidades similares es apropiado
Software Zen para la obtención de imágenes de microscopio confocal	Zeiss	versión 2009	El software debe ser compatible con el CLSM utilizado por el
kit de mutagénesis dirigida al sitio Quickchange II	Agilent	200523
Acetosiringona	Sigma-Aldrich	D134406
MES	Sigma-Aldrich	69892
Jeringas sin agujas	BD	309659
MgCl2	FisherScientific	M33-500
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S4014
Rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A0166