Describimos ensayos discontinuos sensibles basados en gel para examinar la cinética de la iniciación de la hebra rezagada utilizando las proteínas de replicación del bacteriófago T7.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Cinética de la síntesis de ADN de hebra Quedando
En este artículo
Resumen
Resumen
Aquí proporcionamos protocolos para el examen cinético de la síntesis de ADN de hebra rezagada in vitro por las proteínas de replicación del bacteriófago T7. El replisoma T7 es uno de los sistemas de replicación más simples que se conocen, compuesto por solo cuatro proteínas, lo que es una característica atractiva para los experimentos bioquímicos. Se hace especial hincapié en la síntesis de cebadores de ribonucleótidos por la primasa-helicasa T7, que son utilizados por la ADN polimerasa para iniciar la síntesis de ADN. Debido a que los mecanismos de replicación del ADN se conservan a lo largo de la evolución, estos protocolos deberían ser aplicables, o útiles como trampolín conceptual, para los investigadores que utilizan otros sistemas modelo. Los protocolos descritos aquí son altamente sensibles y un investigador experimentado puede realizar estos experimentos y obtener datos para su análisis en aproximadamente un día. El único equipo especializado requerido es un instrumento de flujo de enfriamiento rápido, pero este equipo es relativamente común y está disponible en varias fuentes comerciales. Sin embargo, los principales inconvenientes de estos ensayos incluyen el uso de radiactividad y el rendimiento relativamente bajo.
Introducción
La replicación del ADN es una característica conservada de toda la vida celular. Mientras que la identidad y el número de componentes de replicación varían ampliamente, los mecanismos generales se comparten a través de la evolución 1. A continuación, describimos, experimentos cinéticos discontinuos a base de gel, utilizando sustratos radiactivos, dirigidas a la comprensión de la cinética de la síntesis de ADN de hebra retrasada in vitro por los componentes de la replisome T7. La maquinaria de replicación del bacteriófago T7 es muy simple, que consiste en sólo cuatro proteínas (la ADN polimerasa, GP5, y su factor de procesividad, E....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: Siga todas las normativas institucionales con respecto al uso seguro y la eliminación de los materiales radiactivos, incluyendo pero no limitado a, el uso de equipo de protección personal, como guantes, gafas de seguridad, ropa de laboratorio, y escudos de acrílico adecuados.
NOTA: El tampón estándar consta de 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM de glutamato de potasio, DTT 5 mM, EDTA 0,1 mM (este tampón se pre-hizo a una concentración 5x) y 0,3 mM de cada dNTP. Proteínas de replicación de T7 se purifican como se describe 8, 9, 10. ADN de una so....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los resultados mostrados en la Figura 1A se obtuvieron como se describe en el paso 1 del protocolo, es decir, mediante el muestreo de forma manual una reacción de síntesis del cebador catalizada por la GP4 en condiciones de múltiples volumen de negocios. Aquí, una gama de productos después de la electroforesis en gel se puede observar mediante el uso de CTP marcada con 32 P en la α-posición en reacciones de síntesis de cebadores
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El factor más importante en la realización de estos experimentos es la disponibilidad de enzima purificada de gran actividad. Durante nuestro trabajo con GP4, por ejemplo, se encontró que el almacenamiento de la enzima purificada en tampón (20 mM de fosfato de potasio, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) que contiene 50% de glicerol a -20 ° C conduce a una reducción en la actividad específica del preparado durante unos meses. Por lo tanto, ahora flash congelación pequeñas alícuotas de gp4 purificada en 25 mM Tris-HCl, pH 7,5.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio C.C.R. por sus comentarios y a S. Moskowitz por la preparación de la figura. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Grants F32GM101761 (A.J.H.) y GM54397 (C.C.R.).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cristales preestablecidos Tris pH 7.5 | SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| Ácido L-glutámico sal potásica monohidrato | SIGMA | G1501 | |
| Cloruro de magnesio hexahidratado | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-ditiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Dodecil Sulfato de sodio | MP Biomedicals | 811030 | |
| Ethylenedinitrilo) Ácido tetraacético, sal disódica, dihidratado | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radiactivo, tomar medidas |
| de protección[γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radiactivo, tomar medidas de protección |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | cuatro dNTPs parte del conjunto de |
| 100 mM ATP y CTP | Epicentre | RN02825 | parte del conjunto NTP |
| construcciones de ssDNA | Tecnologías de ADN integradas | N/A | secuencias personalizadas |
| metanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamida | Thermo Scientific | 17899 | |
| azul de bromofenol | SIGMA | B8026 | |
| Cylene Xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrilamida | SIGMA | A9099 | Tóxico |
| N,N′ -Methylenebisacrylamida | SIGMA | M7279 | nocivo |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Ácido bórico | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Instrumento de flujo de enfriamiento rápido | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Explorador de Kintek | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Software Synergy | N/A |
Referencias
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
