El uso de cultivos de neuroesferas primarias estudian primaria cilios

Resumen

El cilio primario es fundamentalmente importante en la proliferación neuronal de células progenitoras, la diferenciación neuronal, y la función neuronal adulto. A continuación, describimos un método para estudiar ciliogenesis y el tráfico de proteínas de señalización a los cilios en las células madre / progenitoras neuronales y neuronas diferenciadas utilizando cultivos de neuroesferas primarias.

Resumen

El cilio primario es fundamentalmente importante para la proliferación de células madre/progenitoras neurales y para la diferenciación neuronal durante la vida embrionaria, postnatal y adulta. Además, la mayoría de las neuronas diferenciadas poseen cilios primarios que albergan receptores de señalización, como los receptores acoplados a proteínas G, y moléculas de señalización, como las adenilil ciclasas. El cilio primario determina la actividad de múltiples vías de desarrollo, incluida la vía sónica del erizo durante el desarrollo neuronal embrionario, y también funciona en la promoción de la señalización subcelular compartimentada durante la función neuronal adulta. Como era de esperar, los defectos en la biogénesis y la función del cilio primario se han relacionado con anomalías del desarrollo del cerebro, obesidad central y déficits de aprendizaje y memoria. Por lo tanto, es imperativo estudiar la biogénesis primaria del cilio y el tráfico ciliar en el contexto de las células madre/progenitoras neurales y las neuronas diferenciadas. Sin embargo, los métodos de cultivo de neuronas primarias requieren una experiencia considerable y no son susceptibles de ciclos de congelación y descongelación. En este protocolo, discutimos los métodos de cultivo para poblaciones mixtas de células madre/progenitoras neurales utilizando neuroesferas primarias. Los métodos de cultivo basados en la neurosfera proporcionan los beneficios combinados del estudio de las células madre/progenitoras neurales primarias: capacidad para múltiples pasajes y ciclos de congelación-descongelación, potencial de diferenciación en neuronas/glía y transfectabilidad. Es importante destacar que determinamos que las células madre/progenitoras neurales derivadas de la neurosfera y las neuronas diferenciadas se cilian en cultivo y localizan moléculas de señalización relevantes para la función ciliar en estos compartimentos. Utilizando estos cultivos, describimos más a fondo los métodos para estudiar la ciliogénesis y el tráfico ciliar en células madre/progenitoras neurales y neuronas diferenciadas. Estos métodos basados en la neurosfera nos permiten estudiar las vías celulares reguladas por los cilios, incluido el receptor acoplado a la proteína G y la señalización sónica del erizo, en el contexto de las células madre/progenitoras neurales y las neuronas diferenciadas.

Introducción

El cilio primario es un compartimento subcelular dinámica basada en microtúbulos que funciona como una antena sensorial en la coordinación de vías de señalización celulares, incluyendo la vía de Sonic Hedgehog (Shh) durante el desarrollo neuronal embrionario ^{1, 2,} y la señalización subcelular compartimentada en la función neuronal adulto ^{3, 4} . Señalización de componentes de estas vías, tales como el receptor de Shh Patched ^5; el activador vía de Smoothened (Smo) ^6; y Gpr161 ^7, un....

Protocolo

1. Aislamiento de neuroesferas del cerebro de ratón adulto

1. La eutanasia a un ratón adulto (alrededor de 2 meses de edad) por una sobredosis de isoflurano. Vuelva a comprobar que el ratón ha dejado de respirar y diseccionar inmediatamente después de la muerte.
2. Con unas tijeras, hacer una incisión en la línea media para abrir el cráneo. Retire el cerebro.
3. Coloque el cerebro en PBS frío en un plato de 10 cm en hielo. Siga todo el montaje el método de disección para obtener la SVZ desde el ventrículo lateral ^48.
4. Coloque el ventrículo lateral en un tubo de 1,5 ml, añadir 500 l de 0,05% de tripsina-EDTA en PB....

Resultados

Después de sembrar las células de la SVZ en medio NSC durante una semana, neuroesferas flotantes se observaron (Figura 2A). Los tamaños de las esferas variaron entre 50 y 200! M. Para examinar si las esferas se derivan de las células madre / progenitoras neurales, las neuroesferas se sembraron en PLL- y cubreobjetos en medio NSC recubiertas con laminina durante 2 días. Luego fueron inmunoti~neron contra el marcador / célula progenitora madre neurales, nestina. Se necesit.......

Discusión

A continuación, se describe un método para generar y mantener los cultivos de neuroesferas de SVZ ratón adulto. Unos pocos puntos pertinentes con respecto a los cultivos son las siguientes. En primer lugar, los tamaños de las esferas son típicamente entre 50 - 200 micras. En nuestra experiencia, cuando un neurosphere se hace más grande de 300 m de diámetro, el momento óptimo para los pases se ha perdido. Estas esferas grandes contienen las células muertas en el núcleo. En segundo lugar, como neuroesferas se utilizan com.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubreobjetos redondos de 12 mm	Fisherbrand	12-545-80
Placa de 24 pocillos	Falcon	353047
4% paraformaldehído (PFA)	Affymetrix	19943
Tubo de 50 mL	Falcon	352098
placa de Petri de 95 mm x 15 mm, tapa deslizante	Fisherbrand	FB0875714G	Plato de 10 cm
70 µ colador de células m	Falcon	352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Burro Anti-Conejo IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	711-545-152	Burro anti Conejo, Alexa 488 anticuerpo secundario
Arl13B, Clon N295B/66	Neuromab	AB_11000053
B-27 Suplemento (50X), sin suero			Centrífuga
	ThermoFisher Scientific 17504001 B27Thermo scientific	ST 40R
Vial criogénico	Corning	430488
DAPI	Sigma	D9542-10MG
Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino	Sigma	D5025-15KU	Dnase I
Dimetilsulfóxido Sigma		D8418-100ML	DMSO
Moldes de muestras de vinilo desechables	Sakura Tissue-Tek Cryomold	4565	10 mm x 10 mm x 5 mm
Solución salina tamponada con fosfato Dulbecco 10X, modificada, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, líquida, filtrada estérilmente, apta para cultivo celular	Sigma	D1408-500ML	DPBS
Dumont #5 Pinzas	Herramientas de ciencia fina	11254-20
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma	F9026-500ML
Solución	Fluoromount-GSolución de montaje Southern Biotech	0100-01
GFAP	DAKO	Z0334
Anticuerpo secundario anti ratón de cabra IgG1, conjugado Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21127	ratón de cabra IgG1, anticuerpo secundario Alexa 555 Anticuerpo secundario
cabra anti ratón IgG2a Anticuerpo secundario, Alexa Fluor 555 conjugado	ThermoFisher Scientific	A-21137	IgG2a anti ratón de cabra, Alexa 555 anticuerpo secundario
Gpr161	hecho en casa	N/A
humano bFGF	Sigma	F0291	FGF
hemocitómetro	Hausser Scientific	0,100 mm de profundidad	mejorado
Neubauer Isothesia	Henry Schein	NDC 11695-0500-2	Laminina de isofluorano
de Engelbreth-Holm-Swarm Membrana basal para sarcoma	Sigma	L2020	Laminina
L-Glutamina (200 mM)	Sigma	G7513
Lipofectamina 3000 Reactivo de transfección	ThermoFisher Scientific	L3000
Mr. Frosty	Nalgene	5100-0036
Suplemento N-2 (100X)	ThermoFisher Scientific	17502001	N2
Medio neurobasal	Gibco	21103-049
Suero de burro normal	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
OCT	Sakura Tissue-Tek	4583	OCT
Penicilina-Estreptomicina	Sigma	P4333-100ML
Poly-L-Lisina (PLL)	Sigma	P4707
Proteína EGF humana recombinante, sistemas CF	R y D	236-EG-200
Tijera	Herramientas de ciencia fina	14060-10
Portaobjetos de microscopio Superfrost plus	Fisher scientific	12-550-15	portaobjetos
Triton X-100	Bio-Rad	161-0407
Solución de tripsina-EDTA (10X)	Sigma	T4174-100	Tripsina
COSTAR Placa de 6 pocillos, con tapa Fondo plano Superficie de fijación ultra baja Poliestireno, estéril	Corning	3471 Corning 3471	Placa de 6 pocillos
β-tubulina III	Covance	MMS-435P	TUJ1

anti de compuesto EGF