Aquí, se muestra un enfoque enzimático para aislar hepatocitos primarios de ratones adultos, y se describe la cuantificación de una respuesta inflamatoria mediante ELISA y PCR en tiempo real.
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Artículo de método
La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El hígado juega un papel decisivo en la regulación de la inflamación sistémica. En la enfermedad renal crónica, en particular, el hígado reacciona en respuesta al medio urémico, estrés oxidativo, endotoxemia y la disminución del aclaramiento de circulación de citocinas proinflamatorias mediante la producción de un gran número de reactivos de fase aguda. herramientas experimentales para el estudio de la inflamación y el papel fundamental de los hepatocitos son cruciales para comprender la regulación y la contribución de citocinas hepáticas a una respuesta de fase aguda sistémica y un escenario pro-inflamatoria prolongada, especialmente en un entorno complejo como la enfermedad renal crónica. Desde el estudio de complejos mecanismos de la inflamación in vivo sigue siendo un reto, uso intensivo de recursos y por lo general requiere el uso de animales transgénicos, hepatocitos aislados primarios proporcionan una herramienta robusta para obtener información mecanicista en la respuesta de fase aguda hepática. Dado que esta técnica in vitro cuenta con costes moderados, alta reproducibilidad y el conocimiento técnico común, hepatocitos aislados primarios también se pueden utilizar fácilmente como un criterio de selección. A continuación, describimos un método basado en enzimática para aislar hepatocitos murinos primarios, y se describe la evaluación de una respuesta inflamatoria en estas células utilizando ELISA y cuantitativa en tiempo real PCR.
Introducción
La enfermedad renal crónica (ERC) se puede definir como un estado de inflamación aguda y crónica 1. En los pacientes con enfermedad renal crónica, los niveles séricos del factor de crecimiento de fibroblastos hormona fosfatúrica 23 (FGF23) aumentan progresivamente con el fin de mantener la homeostasis del fosfato sérico 2. Aumento de los niveles de FGF23 en suero se asocian de forma independiente con la morbilidad y la mortalidad cardiovascular en los pacientes que inician el tratamiento de hemodiálisis 3, 4. Además, varios estudios clínicos han demostrado una f....
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Protocolo
Todos los animales protocolos y procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Miami Miller School of Medicine.
1. Preparación
- medios de perfusión hepática de precalentamiento y el hígado digerir los medios de comunicación en un baño de agua a 37 ° C.
- Configurar una bomba de perfusión (30 ml / min). Cuidadosamente llenar previamente el sistema de tubos de la bomba con los medios de la perfusión del hígado. Evitar las burbujas de aire en el sistema y preparar el microscopio estereotáctica.
- Escudo placas de cultivo celu....
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Resultados
Histología
Imágenes de microscopía de luz representativos de células aisladas y cultivadas primarias se representan en la Figura 1A. El análisis inmunocitoquímico demuestra que los hepatocitos aislados altamente expresan albúmina (rojo), así como el factor de crecimiento de fibroblastos receptor 4 (FGFR4) (verde). Los núcleos se tiñeron con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (azul). (Figura 1B).
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Discusión
Aislamiento de hepatocitos primarios de ratones es una herramienta rápida, de bajo costo y fiable para estudiar las respuestas inflamatorias ex vivo. Si se realiza correctamente, los resultados pueden ser fácilmente generados y reproducen de una manera oportuna y rentable. Los siguientes puntos deben ser cuidadosamente evaluados con el fin de garantizar un éxito en el aislamiento.
La incisión quirúrgica y la canulación de la vena cava inferior se deben realizar bajo anestesia genera.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01HL128714 a CF) y (F31DK10236101 a KS) y la American Heart Association (CF y AG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Consumibles | |||
| celdas fuerte 70 μ m Colador de celdas de nylon | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Tubo cónico de polipropileno | Falcon | 352098 | |
| 100 Aplicadores con punta de algodón de 6 pulgadas | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Jeringa de Insulina 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Plato de Cultivo de Tejidos 100 x 20 mm Estilo | Corning | 353003 | |
| 6 pocillos Cluster de Cultivo Celular | Costar | 3516 | |
| 5/0 Seda Quirúrgica Trenzada Negra (100 yardas) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Equipment | |||
| perfusión | Gilson | F155007 | |
| Kits de hemacitómetro, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Cubreobjetos de hemacitómetro, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Tijeras quirúrgicas - afiladas/romas | F.S.T. | 14001-12 | |
| Tijeras de iris-ToughCut recta | F.S.T. | 14058-11 | |
| Pinzas Dumont SS-45 | F.S.T. | 11203-25 | |
| Pinza de Tejido para Estudiantes | F.S.T. | 991121-12 | |
| Nombre | Compañía | Número de catálogo | Comentarios |
| Reactivos | |||
| Solución ácido acético, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurano, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xilacina 100 mg/mL | AnaSed Inyectable | 139-236 | |
| Medio de Willams E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Medio de perfusión hepática (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Medio de digestión hepática (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Suplementos primarios de descongelación y colocación de hepatocitos Life | Technologies | CM3000 | |
| Suplementos de mantenimiento de hepatocitos primarios Life | Technologies | CM4000 | |
| Tampón de fosfato solución salina (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Colágeno tipo 1 | Corning | 354236 | |
| solución de azul de tripano | VWR | 45000-717 |
Referencias
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth f....
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