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Artículo de método

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

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DOI:

10.3791/55335

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24 de febrero de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

En este artículo

Resumen

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Resumen

Un programa de regeneración endógena es iniciada por las células de Müller en el pez cebra adulto (Danio rerio) retina después del daño neuronal y la muerte. Las células de Müller volver a entrar en el ciclo celular y producen células progenitoras neuronales que se someten a las siguientes rondas de división celular y se diferencian en los tipos de células neuronales perdidos. Tanto las células de Müller y de células progenitoras neuronal núcleos replican su DNA y se someten a la mitosis en lugares distintos de la retina, es decir, que migran entre el basal capa interior Nuclear (INL) y la capa exterior Nuclear (ONL), respectivamente, en un proceso descrito como interkinetic La migración nuclear (INM). INM predominantemente se ha estudiado en la retina en desarrollo. Para examinar la dinámica del INM en el adulto regeneración de la retina del pez cebra en detalle, se requiere imágenes de células vivas de las células marcadas con fluorescencia las células de Müller / progenitoras neuronales. Aquí, proporcionamos las condiciones para aislar y retinas cultura dorsalesde Tg [GFA: nGFP] pez cebra mi2004 que fueron expuestos a una luz intensa constante durante 35 h. También se muestra que estos cultivos de retina son viables para llevar a cabo experimentos de imágenes de células vivas, la adquisición de imágenes de forma continua z-stack en todo el espesor de la retina explante para un máximo de 8 h utilizando microscopía multifotónica para monitorear el comportamiento migratorio de GFA: células positivas nGFP . Además, se describen los detalles para realizar el análisis posterior a la proyección de imagen para determinar la velocidad del INM apical y basal. En resumen, hemos establecido las condiciones para estudiar la dinámica del INM en un modelo adulto de la regeneración neuronal. Esto hará avanzar nuestra comprensión de este proceso celular crucial y nos permitirá determinar los mecanismos que controlan el INM.

Introducción

A diferencia de los seres humanos, el pez cebra (Danio rerio) exhiben una robusta respuesta de regeneración después de la muerte celular de neuronas de la retina 1, 2, 3, 4. Factor de necrosis tumoral α, una molécula de señalización que se libera de la muerte las neuronas de la retina induce las células de Müller residente en el basal capa interior Nuclear (INL) de la retina, a proliferar 5 y producir células progenitoras neuronales que siguen proliferando antes de la diferenciación en la célula neuronal tipos que murieron 2, 3, 4. Durante la fase proliferativa de la respuesta de la regeneración, los núcleos de las células de Müller y sus células progenitoras neuronales derivadas se someten a un patrón migratorio repetitivo en fase con el ciclo celular (interkinetic migración Nuclear, INM) 6 > 7. Los núcleos posicionado en la INL basal replicar su ADN antes de migrar a la capa exterior Nuclear (ONL) donde se dividen antes de que surjan los núcleos vuelven basalmente a la INL. Este proceso fue descrito por primera vez durante el desarrollo neuroepitelial utilizando métodos histológicos, mientras que los enfoques de formación de imágenes de células vivas después confirmaron la interpretación por Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Ambos enfoques de imagen histoquímicos y de células vivas se han utilizado para determinar los mecanismos INM y su función en el desarrollo de la retina incluyendo neuroepithelia 9, 11, 12, 13 subyacentes. Sin embargo, los mecanismos que regulan INM en el adulto regeneración de retina no han sido estudiados en mayor detallexref "> 6, 7. Células vivas imágenes será una forma muy valiosa para avanzar en el conocimiento de las vías de señalización que controlan el INM en la retina adulta regeneración.

Hasta hace poco tiempo, imágenes de células vivas del INM en la retina se limita a cualquiera de embriones de pez cebra en vivo o embriones de pollo o postnatal ratón explantes de retina 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mientras que los explantes de retina de animales adultos de una variedad de especies, incluyendo ratones, ratas y pez cebra han sido utilizados para diferentes enfoques biológicos celular 17, 18, 19, 20, experimentos de imágenes de células vivas utilizando explantes de retina jahan estado restringidos a breves períodos de tiempo y no han sido ejecutados de forma continua durante varias horas 21, 22. A continuación, describimos un protocolo detallado para la cultura retinas de pez cebra adultos de luz dañadas para llevar a cabo experimentos de imágenes de células vivas monitoreo INM usando microscopía multifotónica 6. Enfoques imágenes de células vivas son ventajosas respecto a los métodos inmunohistoquímicos en la investigación de los mecanismos que controlan el INM, como la dinámica del INM, por ejemplo, las velocidades pueden verse afectados en lugar de la ubicación de la mitosis, lo que potencialmente no ser detectado mediante inmunocitoquímica.

En el futuro, este método tiene también el potencial de ser modificado para estudiar otros procesos dinámicos durante la regeneración de la retina, tales como fagocitosis de morir fotorreceptores por las células de Müller o el comportamiento de microglia.

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Protocolo

Nota: El pez cebra fueron criados y mantenidos en las instalaciones de Notre Dame de pez cebra en el Centro de Ciencias de la Vida Freimann. Los métodos descritos en este manuscrito son aprobados por la Universidad de Notre Dame Cuidado de Animales y el empleo Comisión y están en conformidad con la declaración para el uso de animales en investigación de la visión por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología.

1. Soluciones

  1. Preparar 70% de etanol para esterilizar la campana de cultivo de tejido y cualquier equipo / reactivos que se transfieren en la campana de cultivo de tejido.
  2. Añadir 2 ml de 2-fenoxietanol a 1 L de agua del sistema (1: 500 2-fenoxietanol).
  3. Preparar 0,1 mM de NaHCO3, pH 8,0. Utilice una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de tamaño de poro 0,2 micras para esterilizar la solución en una campana de cultivo de tejidos esterilizada.
    NOTA: NaHCO 3 se usa para difundir de manera eficiente el adhesivo de células y tejidos a través de la superficie de cubreobjetos de fluorodishes (verpaso 3.2).
  4. Preparar 1,0 M CaCl 2 y 1,0 M MgCl 2. Esterilizar con una jeringa de 10 ml y filtro de jeringa de tamaño de poro de 0,2 micras en una campana de cultivo de tejidos esterilizada.
  5. Para preparar la Solución de sal de Hank equilibrada (HBSS), añadir estéril CaCl 2 y estéril MgCl 2 en 1X HBSS sin Ca 2 + / Mg2 +, sin rojo fenol a una concentración final de 1 mM cada uno. Trabajar en un ambiente estéril.
  6. Para preparar el medio de cultivo, se mezcla 50% 1x medio esencial mínimo (MEM) sin rojo de fenol, 25% HBSS que contiene CaCl 2 y MgCl 2 (ver sección 1.4), 25% suero de caballo (HS), 10 unidades / ml de penicilina, y 10 g de estreptomicina / ml. Trabajar en un ambiente estéril.
    NOTA: Evitar el medio que contiene rojo fenol, ya que autofluoresces, lo que afecta la señal a ruido. 23
  7. Preparar 10 ml de 1% agarosa de bajo punto de fusión en 1x MEM sin rojo fenol. Derretir agarosa / 1x MEM usando un microWCra. Preparar pequeños volúmenes de agarosa (por ejemplo, 10 ml) como recalentamiento repetitivo va a cambiar las concentraciones de iones debido a la evaporación de líquidos.
  8. Antes del cultivo, esterilizar los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en autoclave.

Paradigma 2. Luz-daños

  1. Dark-adaptación
    1. Colocar 2 - 3 Tg [GFA: nGFP] pez cebra mi2004 (u otro pez cebra transgénico de interés) a los 6 - 14 meses de edad en un ambiente desprovisto de luz por 14 días. Para más detalles, véase la referencia 2, 6, 24, 25.
  2. Coloque el tanque que contiene 2 - 3 pez cebra transgénico adaptada a la oscuridad en el agua del sistema entre dos lámparas fluorescentes que emiten luz de 2.800 lux 2, 6, 24, 25.
  3. Exponer el pez cebra a una luz intensa constante durante 35 h. Durante la exposición a la luz, asegurar que se mantiene la temperatura del agua entre el 31 - 33 ° C.

3. Preparación para el cultivo (En el Día de aislamiento de la retina)

  1. El uso de 70% de etanol, esterilizar la campana de cultivo de tejido y los componentes / herramientas que se transfieren en la campana de cultivo de tejido (por ejemplo, matraces que contenían MEM y HBSS, pipetas, puntas de pipeta estériles, etc.).
  2. Preparación de fluorodishes
    1. Cubra un fluorodish para cada retina con células y adhesivo tisular (véase la Tabla de Materiales).
    2. Diluir el adhesivo de células y tejidos en 0,1 mM NaHCO 3 a una concentración final de 70 mg / ml, se añaden 50 l a cada fluorodish y extender la solución en el centro de la fluorodish con una punta de pipeta 200 l (aproximadamente 1 - diámetro 1,2 cm ).
    3. Se incuban las fluorodishes recubiertas por 1 - 3 horas a RT; (Alternativamente, incubar O / N a 4 ° C).
    4. Retire la solución y enjuagar 3 veces con 500 l de 1x MEM para cada lavado. Para evitar los fluorodishes recubiertos se sequen, mantenerlas en MEM hasta explantes de retina están montados.
  3. Preparar medio de cultivo como se describe en el paso 1.6. El medio de cultivo se puede almacenar durante un máximo de 1 semana a 4 ° C.

4. Aislamiento y cultivo de explantes de retina

NOTA: El protocolo descrito a continuación es para el aislamiento de la retina dorsal, que es la región de la retina que es predominantemente lesionada por el paradigma-daño de la luz descrito. Por lo tanto, la proliferación inducida por el daño y el evento asociado de la migración nuclear interkinetic se producen en la retina dorsal. Sin embargo, el procedimiento de aislamiento se puede ajustar para producir regiones de la retina de acuerdo con los requisitos específicos de la pregunta investigador / investigación.

  1. La eutanasia a una sola luz dañado transgénico pez cebra unatiempo de ta en 1: 500 2-fenoxietanol.
  2. Retire MEM de una fluorodish con una pipeta 1.000 l de modo que sólo una fina capa de líquido permanece.
  3. Transferir el pez cebra en una toalla de papel seca, retire el ojo con un par de fórceps curvado Dumont (fórceps nº 5, ángulo de 45 °) y transferirlo a la fluorodish.
  4. El uso de un microscopio estereoscópico, orientar el ojo con la pupila en la hoja de la cubierta de la fluorodish de modo que la parte posterior del ojo con el nervio óptico es visible (Figura 1D).
  5. Con un par de tijeras McPherson-Vannas eliminar el nervio óptico, el corte cerca de la parte posterior del ojo. Además, eliminar el tejido conjuntivo que recubre el exterior del ojo.
  6. Mantenga el ojo entre su nasal y el lado temporal con un par de # 5 fórceps mientras que hacer una incisión en el tallo óptico por la perforación con una hoja de tijera a través de la lámina cribosa y corte a lo largo tanto de la nasal y los lados temporales del ojo (véase la Figura 1E , li segmentadonordeste).
  7. El uso de dos pares de pinzas # 5, uno para la celebración de la cara dorsal de la retina y el otro par para separar la ventral de la retina dorsal, tire del tejido.
    NOTA: Es recomendable orientar la retina dorsal para que la lente y la capa de células ganglionares de la cara del cubreobjetos, mientras que la esclerótica se enfrenta hacia arriba.
  8. Eliminar la esclerótica de la retina dorsal con un par de fórceps # 5, mientras se mantiene la lente que está conectado a la retina con un segundo par de pinzas # 5 (Figura 1H, I).
  9. Para extraer el objetivo, utilizar tijeras McPherson-Vannas y corte detrás de la lente sin dañar la retina (Figura 1I, J). A veces, la lente se separa en el paso 4.7. En este caso, retire la esclerótica cuidadosamente con unas pinzas mediante la celebración de la retina en un borde cortado con un segundo par de fórceps # 5.
  10. Retire el vítreo mientras se quita la lente sin dañar la retina. Aplanar la retina con la capa de células ganglionares frente a la hoja de la cubiertade la fluorodish (Figura 1L, M).
  11. Rodear la retina con 10 l de 1% de agarosa de bajo punto de fusión y dejar que la agarosa solidifique.
  12. Ver que la agarosa líquido no levanta la retina ya que incluso una ligera elevación podría afectar a la capacidad de concentrarse profundamente en el tejido. Si se observa elevación, utilizar una pipeta para eliminar de agarosa. Deje conjunto de agarosa residual antes de intentar añadir más.
  13. Repita el paso 4.12 varias veces antes de la adición de 1% de agarosa de bajo punto de fusión para cubrir toda la fluorodish. Una vez que la agarosa se ha solidificado, añadir 1,5 ml de medio de cultivo.
  14. Mantener el cultivo de explantes de retina en un ambiente de aire / 5% de CO 2 fijado en 32 ° C durante aproximadamente 12 h para permitir la retina para alejarse de los problemas que haya incurrido el procedimiento de aislamiento. Ajuste la temperatura a 32 ° C para mantener las retinas a la misma temperatura que el pez cebra-ligero tratado (véase el paso 2.3).

5. Multifotónica Microscopía

NOTA: Los experimentos realizados en este manuscrito se optimizaron para un microscopio multifotónica equipado con un láser de infrarrojos (véase la Tabla de Materiales), un 40X Apo larga distancia objetivo de inmersión en agua (NA 1,15), un escáner de galvanómetro y una cámara ambiental que contiene una inserción para cuatro 35 mm placas de Petri. Las imágenes fueron adquiridas con un detector no descanned (R-NDD).

  1. Antes de la formación de imágenes, equilibrar la cámara ambiental para lograr una atmósfera de aire / 5% de CO 2. Asegúrese de que los platos vacíos de Petri se insertan en el soporte para evitar las fugas de gas en la habitación.
  2. Encienda el sistema de microscopía.
  3. Una vez que se equilibra la cámara ambiental, añadir líquido de índice de refracción en la larga distancia objetivo de inmersión en agua 40X Apo (NA 1.15).
    NOTA: El líquido de índice de refracción con propiedades ópticas similares al agua se utiliza para evitar la evaporación de agua durante la formación de imágenes a largo plazo.
  4. Coloque la gripeorodishes con explantes de retina en la cámara. Usando la luz de campo claro, la posición de la muestra en el camino de la luz y traer la región media de la retina dorsal en el plano de enfoque.
  5. Utilice la luz de epifluorescencia GFP para centrarse en GFA: nGFP -positivo Müller glia núcleos (Figura 2 A, C).
    NOTA: Si explantes no están montados plana o agarosa acumulado bajo el explante, será difícil de enfocar sobre la GFAP: nGFP núcleos -positivos o que será fluorescente débilmente.
    1. Compruebe si se mueve a una región diferente dentro del mismo explante retina va a superar el problema de enfoque. De lo contrario pasar a un explante de la retina diferente.
  6. En el software de adquisición de imágenes, abra el 'A1 MP interfaz gráfica de usuario ", el" TiPad ", el" A1 compacto GUI' 'y las ventanas de adquisición de ND. Para imágenes multifotónica, asegúrese de que la opción "IR DDN 'se elige en el' A1 compacto GUI '.
  7. En el 'Ajustescampo de g ', seleccionar IR-DM para el espejo dicroico 1ª y elegir el filtro de paso de banda de 525/50 para la adquisición de fluorescencia de GFP.
  8. Encienda el láser de IR en la ventana con la etiqueta 'A1MP interfaz gráfica de usuario'. Tomará unos minutos para que el láser esté listo. Establecer la longitud de onda de 910 nm para excitar la fluorescencia de GFP y alinear el láser haciendo clic en el botón de 'alineamiento automático' en la ventana 'A1 MP interfaz gráfica de usuario'.
  9. Asegúrese de que salas y equipos luces se apagan o cubiertos antes de abrir el obturador en el 'A1 MP GUI' para evitar la sobreexposición del tubo fotomultiplicador. Para reducir los niveles de ruido, albergará el microscopio en un ambiente oscuro.
  10. Adquirir imágenes de un campo de visión de 300 x 300 píxeles, en un zoom de dos, y un tiempo de permanencia de píxel de 4,8 mu s / pixel. Aproximadamente configurar la potencia del láser, cambiando la «zona de adquisición" en el "A1MP interfaz gráfica de usuario" y la ganancia en la ventana 'A1 compacto GUI'.
  11. Configuración de la z-stack
    1. Se centran en la capa de células ganglionares para definir el plano focal de la parte superior de la pila Z en el 'Z' subventana dentro de la "ventana de adquisición ND '. Algunos GFAP: células positivas nGFP se encuentran normalmente en la capa de células ganglionares, lo que ayuda a identificar el límite basal de la retina (Figura 2A, D).
    2. Mover el plano focal a través del nivel de la ONL (Figura 2A, B), que se caracteriza por la presencia de GFAP débilmente marcado: células positivas nGFP que están alrededor y ampliada con relación a sus homólogos de la INL (Figura 2A, C) .
    3. Ajuste este plano que la parte inferior de la pila Z. Asegúrese de que toda la ONL serán fotografiadas (Figura 2A, B).
    4. Al experimentar los cambios de plano focal que requieren re-ajuste durante el período de formación de imágenes, haga doble clic en la posición media en la subventana 'z' para asignarlo como la posición de "casa". Cambiar a 'modo simétrico definido'y haga clic en "relativo".
    5. Establecer el tamaño z paso entre 0,7 a la 1 micra.
  12. corrección Z-intensidad:
    1. Aplicar correcciones z intensidad para compensar la pérdida de intensidad de los píxeles debido a la dispersión de la luz cuando se generan imágenes en capas profundas de los tejidos.
    2. Para configurar la corrección, abra la ventana de "corrección z intensidad". Para establecer el 'rango z-stack', seleccione 'De Dakota del Norte'.
    3. Haga clic en el plano focal de fondo en la ventana 'z intensidad de corrección' (en este caso, corresponde a la capa de células ganglionares) y ajustar la intensidad del láser ( "área de adquisición" en el "A1MP GUI ') y la ganancia (GUI compacto A1 ).
    4. Haga clic en la flecha al lado de los "valores z 'en la ventana' corrección z intensidad" para confirmar los ajustes que se muestran posteriormente en virtud de la configuración del dispositivo '' en la ventana 'corrección z intensidad "para el plano focal elegida.
    5. Repita el proceso para la media de unaplanos superiores nd, aumentando la potencia del láser y la ganancia. planos focales adicionales se pueden añadir en caso necesario. Véase la Tabla 1 para los ajustes de ganancia de láser y específicos para los experimentos de las figuras 2 - 4.
    6. Establecer la "zona de adquisición 'en la ventana' A1 MP interfaz gráfica de usuario '. Evitar la selección de un área de adquisición mayor que 15 y una ganancia mayor que 126 en el inicio de formación de imágenes para eludir photobleaching y el aumento de los niveles de ruido.
      NOTA: Como el láser y tubos fotomultiplicadores difieren entre los sistemas de microscopía láser, pruebas y ajustes de ganancia para obtener condiciones óptimas de imagen para el microscopio configurar evitando al mismo tiempo photobleaching.
    7. Elija 'corrección de intensidad relativa' en la ventana 'corrección z intensidad ".
  13. En la subventana '' series de tiempo en la ventana de 'adquisición ND', establecer la duración de 8 horas y el intervalo de 'sin demora'. A continuación, asegúrese de hacer clic en el 'Ejecutar z-corrección' en tél ventana secundaria 'z-stack' en el botón de la ventana 'adquisición ND' para adquirir las series de tiempo de 3-D.
  14. Mantener explantes de retina a una temperatura de 27-29 ° C durante toda la duración de adquisición de imágenes.
  15. Durante todo el período de adquisición de imágenes, si es necesario, vuelva a ajustar el nivel de potencia y la ganancia con el fin de mantener la calidad de la imagen para el análisis post-imágenes. Para los ajustes de realizar los pasos 5.11.2 - 5.11.4.
  16. Si los cambios de plano focal, pausar o detener la ejecución y realizar el paso 5.11 de nuevo.
    NOTA: Si se eligió 'relativa z-corrección' en el paso 5.12.7 y 5.11.4 se llevó a cabo el paso no debería ser necesario volver a ajustar los niveles de potencia y ganancia, a menos que se produjo extensa photobleaching.

6. Análisis de la velocidad

  1. Extraer el tiempo, el establecimiento de una región de interés en la imagen. Utilice la herramienta de 'tiempo de medición' y exportar los valores de tiempo a una hoja de cálculo.
  2. Recortar una región que contiene un diViding GFA: nGFP núcleo -positivo.
  3. Elige la región recortada de manera que contiene al menos un núcleo que no experimentan INM con el fin de establecer un punto de referencia para medir posteriormente las distancias que el núcleo divisoria emigraron en relación con la INL basal. NOTA: Para seleccionar un núcleo que permanece en el INL basal, que ayuda a preparar una reconstrucción en 3-D de las series de tiempo.
  4. Alternativamente, si un GFAP: se observa celular -positivo nGFP en el ONL durante todo el período de adquisición, utilice una línea vertical de longitud fija que abarca desde el núcleo ONL a la INL basal con el fin de identificar un punto de referencia.
  5. Uso de la función "Mostrar divisiones vista ', generar proyecciones ortogonales. Posteriormente, cambiar el modo de "rebanada" a la "proyección de intensidad máxima".
  6. Desactivar la vista de 'xy' de la máxima proyección ortogonal. Dependiendo de la orientación en la que la migración / núcleo dividiendo es mejor visible, unalso apagar bien el 'xz'- o la "visión yz'.
  7. Haga clic en la imagen restante con el botón derecho del ratón y extraer el "serie yz'-imagen con el '' xz 'o la función Crear nuevo documento desde este punto de vista'. Si es necesario, gire la imagen.
  8. Uso de la función "medición manual ', dibujar una línea horizontal a través de la imagen en el nivel inferior del núcleo que permanece en el INL basal y no sufre INM (= punto de referencia; Figura 4A - E, rojo línea horizontal).
  9. Medir la distancia entre la línea de referencia y el punto del núcleo de migración de las series de tiempo utilizando la herramienta de 'medición de línea "en el software de análisis (ver Figura 4A - E) basal.
  10. Una vez que la envoltura nuclear se rompe, medir la posición basal del soma si es identificable a raíz de la difusión de GFP en la célula entera.
  11. El uso de un software de hoja de cálculo, trazar la distancia de un nucleus migró contra el paso del tiempo (Figura 4F).
    1. Para determinar la velocidad de migración apical (a v), gráfico de las distancias recorridas por el período antes de rotura de la envuelta nuclear se produce (Figura 4G).
    2. Seleccione la serie de datos en el gráfico, haga clic con el ratón e insertar una curva de regresión lineal que incluye "y = mx + c 'la función correspondiente. La pendiente "m" en la función representa la velocidad, v un (Figura 4G).
    3. Repita los pasos 6.11.1 y 6.11.2 para la primera fase de la migración basal rápida para determinar la velocidad de migración basal, v b (Figura 4H).

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Resultados

El aislamiento de la retina de acuerdo con el procedimiento descrito en el esquema de la Figura 1 permite que el cultivo de una retina dorsal aplanado de adulto-luz dañado Tg [GFAP: nGFP] mi2004 pez cebra durante un período de al menos 24 h en un 5% de CO 2 / ambiente de aire. Estos explantes de retina montados en plano-se pueden utilizar para planos focales de imagen a nivel de tejidos profundos. Un ejemplo es las células de Müller / núcle...

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Discusión

Los estudios que investigan los mecanismos que regulan la regeneración de la retina del pez cebra adulto dañado fundamentalmente métodos usados inmuno 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. El establecimiento de las condiciones de cultivo de explantes de retina a y para realizar imágenes de células viv...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo proporcionado por William Archer y el Servicio Integrado de Notre Dame de imagen. Gracias especiales se dirigen a los técnicos Freimann Ciencias de la Vida por su continua ayuda y su cuidado y la cría del pez cebra. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Ojo de los NIH para DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) y el Centro de Investigación de pez cebra, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, IN.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pinzas Dumont #5Instrumentos de precisión mundiales14098
Pinzas Dumont #5, ángulo de 45 gradosInstrumentos de precisión mundiales14101
Tijeras McPherson-Vannas Instrumentos deprecisión mundiales501233
Fluordish Instrumentosprecisión mundialesFD35-100
Microscopio estereoscópicoNikon SMZ-1B:tipo similar de microscopio estereoscópico de disección funcionará
Seguridad Biológica Clase de gabinete tipo A2tipo equivalenteLabconco
incubadora de cultivo de tejidostipo equivalenteHEPA-class 100termocientífico
Lámparas fluorescentes Sylvania OSFP5835HOECOBulbtronics31850
0.2 y micro; m Filtro de jeringa AcrodiscVWR4192
Jeringa Luer-lok de 10 mlVWRBD309604
60 ml Jeringa Luer-lokVWRBD309653
NaHCO3FischerScientificS233-500
CaCl2ThermoScientificC79-500
MgCl2EMD Millipore5980
HBSS sin Ca2+/Mg2+, sin rojo fenol, GibcoThermoScientific14175-095
MEM sin rojo fenol, GibcoThermoScientific5100-038
Suero de caballo, inactivado por calorThermoScientific26050-070
penicilina/estreptomicinaVWR16777-164
Agarosa ultrapura de bajo punto de fusiónThermoScientific16520-100
etanol, absolutoThermoScientificBP2818-4
2-fenoxietanolSigma77699
Corning Cell-Tak celda y adhesivo tisular VWR354240
líquido de índice de refracción Cargille Lab1803Y
Nikon A1 equipado con un láser infrarrojo MaiTaiEl sistema equivalentea Nikon
agua de larga distancia 40X Apo (N.A. 1.15)
La cámara ambiental equipada con un inserto para placas de Petri de 35 mmel sistema equivalenteOkolab
con el softwarede análisis NISNikon
de El de funcionará El a funcionaráEl microscopio multifotónico funcionará con un objetivo de inmersión en , funcionará

Referencias

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