Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

Manuela Lahne; Ryne A. Gorsuch; Craig M. Nelson; David R. Hyde

doi:10.3791/55335

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Artículo de método

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

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DOI:

10.3791/55335

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24 de febrero de 2017

Manuela Lahne¹ , Ryne A. Gorsuch¹ , Craig M. Nelson¹^,² , David R. Hyde¹

¹Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, ²Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

En este artículo

Resumen

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Resumen

Un programa de regeneración endógena es iniciada por las células de Müller en el pez cebra adulto (Danio rerio) retina después del daño neuronal y la muerte. Las células de Müller volver a entrar en el ciclo celular y producen células progenitoras neuronales que se someten a las siguientes rondas de división celular y se diferencian en los tipos de células neuronales perdidos. Tanto las células de Müller y de células progenitoras neuronal núcleos replican su DNA y se someten a la mitosis en lugares distintos de la retina, es decir, que migran entre el basal capa interior Nuclear (INL) y la capa exterior Nuclear (ONL), respectivamente, en un proceso descrito como interkinetic La migración nuclear (INM). INM predominantemente se ha estudiado en la retina en desarrollo. Para examinar la dinámica del INM en el adulto regeneración de la retina del pez cebra en detalle, se requiere imágenes de células vivas de las células marcadas con fluorescencia las células de Müller / progenitoras neuronales. Aquí, proporcionamos las condiciones para aislar y retinas cultura dorsalesde Tg [GFA: nGFP] pez cebra ^mi2004 que fueron expuestos a una luz intensa constante durante 35 h. También se muestra que estos cultivos de retina son viables para llevar a cabo experimentos de imágenes de células vivas, la adquisición de imágenes de forma continua z-stack en todo el espesor de la retina explante para un máximo de 8 h utilizando microscopía multifotónica para monitorear el comportamiento migratorio de GFA: células positivas nGFP . Además, se describen los detalles para realizar el análisis posterior a la proyección de imagen para determinar la velocidad del INM apical y basal. En resumen, hemos establecido las condiciones para estudiar la dinámica del INM en un modelo adulto de la regeneración neuronal. Esto hará avanzar nuestra comprensión de este proceso celular crucial y nos permitirá determinar los mecanismos que controlan el INM.

Introducción

A diferencia de los seres humanos, el pez cebra (Danio rerio) exhiben una robusta respuesta de regeneración después de la muerte celular de neuronas de la retina ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^4. Factor de necrosis tumoral α, una molécula de señalización que se libera de la muerte las neuronas de la retina induce las células de Müller residente en el basal capa interior Nuclear (INL) de la retina, a proliferar ⁵ y producir células progenitoras neuronales que siguen proliferando antes de la diferenciación en la célula neuronal tip....