Method Article

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

DOI:

10.3791/55345

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Institute of Immunology, Section Molecular Immunology, University of Heidelberg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos un completo flujo de trabajo para el análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmunes entre las células de T humanas primarias y células presentadoras de antígeno. El método se basa en imágenes por citometría de flujo, que permite la adquisición y evaluación de varias imágenes de miles de células en un período relativamente corto de tiempo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sinapsis inmunológica es el área de la comunicación entre las células T y células presentadoras de antígeno (APC). Las células T polarizan receptores de la superficie y proteínas hacia la sinapsis inmune para asegurar a un enlace estable y señal de cambio. Microscopía confocal, TIRF o resolución súper clásico se han utilizado para el estudio de la sinapsis inmune. Puesto que estos métodos requieren la adquisición de la imagen manual y cuantificación desperdiciador de tiempo, la proyección de imagen de eventos raros es difícil. Aquí, describimos un flujo de trabajo que permite el análisis morfológico de decenas de miles de células. Sinapsis inmunológicas son inducidas entre las células primarias humanas T en preparaciones de pan-leucocitos y células de Staphylococcus aureus enterotoxina B SEB cargado Raji como CPA. Adquisición de imágenes se realiza con imágenes de citometría de flujo, también llamado microscopia en flujo, que combina características de un citómetro de flujo y un microscopio de fluorescencia. Se proporciona una completa estrategia bloquea para identificar parejas de la célula de T/APC y analizando la sinapsis inmune. Este flujo de trabajo permite el análisis de inmune sinapsis en preparaciones de pan-leucocito no purificada y por lo tanto requiere solamente un pequeño volumen de sangre (es decir,, 1 mL), puede aplicarse a muestras de pacientes. Importante, varias muestras pueden ser preparadas, medidas y analizadas en paralelo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células T son los principales reguladores del sistema inmune adaptativo y se activan a través de péptidos antigénicos que se presentan en el contexto de los complejos de histocompatibilidad (MHC). Completa activación de células T requiere dos señales, la señal de la competencia por el receptor de células T específicas de antígeno (TCR) / CD3 complejo y la señal costimulatory a través receptores accesorios. Ambas señales se generan a través de la interacción directa de las células T con el antígeno que presenta las células (APCs). Madura APC proporcionará la señal de la competencia para la activación de células T a través de complejos MHC-péptido, y expresan ligandos coestimuladoras (e.g., CD80 o CD86) para asegurar la progresión de la activación de células T1. Una función importante de la coestimulación es la reorganización de la actina citoesqueleto2,3,4. La F-actina cortical es relativamente estática en reposo las células de T. Estimulación de células T a través de cojinete de antígeno APC conduce a un profundo reordenamiento del citoesqueleto de actina. Dinámica de la actina (es decir,, rápida actinia polimerización/despolimerización los círculos) permite a las células T crear las fuerzas que se utilizan para el transporte de proteínas u organelos, por ejemplo. Además, el citoesqueleto de actina es importante para el desarrollo de una especial zona de contacto entre las células de T y APC, llamado la sinapsis inmune. Debido a la importancia del citoesqueleto de actina a la sinapsis inmune, se ha convertido en esencial para el desarrollo de métodos para cuantificar los cambios en el citoesqueleto de actina de T las células5,6,7,8 , 9.

Por medio de la ayuda de citoesqueleto de actina, proteínas de señalización y receptores de la superficie están segregadas en grupos de activación supramolecular (SMACs) dentro de la sinapsis inmune. La estabilidad de la sinapsis inmune está garantizada por la Unión de los receptores a paquetes de F-actina que aumentan la elasticidad del citoesqueleto de actina. Formación de sinapsis inmune ha demostrado ser crítica para la generación de la respuesta inmune adaptativa. Los efectos perjudiciales de una formación de la sinapsis inmune defectuoso en vivo primero fueron observados en pacientes que sufren de Wiskott Aldrich síndrome (WAS), una enfermedad en que polimerización de la actina y, simultáneamente, formación de la sinapsis inmune son perturbados10 . FUE de pacientes pueden sufrir de eczema, infecciones recurrentes severas, enfermedades autoinmunes y melanomas. A pesar de este hallazgo, en la actualidad no se sabe si la formación de la sinapsis inmune es diferente en las células de T de individuos sanos y pacientes que sufren de defectos inmunes o enfermedades autoinmunes.

Microscopía de fluorescencia, incluyendo confocal, TIRF y microscopia de la estupendo-resolución, fueron utilizados para descubrir la arquitectura de la sinapsis inmune11,12,13,14. La alta resolución de estos sistemas y la posibilidad de realizar proyección de imagen de células vivas permiten la recopilación de información exacta, spatio-temporal sobre el citoesqueleto de actina y las proteínas de superficie o intracelulares en la sinapsis inmune. Sin embargo, muchos resultados, se basan en el análisis de sólo unas pocas decenas de células T. Además, las células de T deben ser purificadas para estos tipos de microscopía de fluorescencia. Sin embargo, para muchas cuestiones de investigación, el uso de las células no purificadas en lugar de la resolución más alta posible es de suma importancia. Esto es relevante si se analizan las células de T de los pacientes, ya que la cantidad de sangre donada es limitada y podría ser la necesidad de procesar muchas muestras en paralelo.

Establecimos métodos microscópicos que permiten el análisis del citoesqueleto de actina en la sinapsis inmune en el sistema humano15,16,17. Estos métodos se basan en imágenes de citometría de flujo, también llamado de flujo microscopía18. Como un híbrido entre multiespectral flujo cytometry y fluorescencia microscopía, citometría de flujo de imágenes tiene sus fortalezas en el análisis de parámetros morfológicos y la localización de la proteína en las poblaciones celulares heterogéneas, como pan-leucocitos de la sangre periférica. Presentamos una metodología que nos permite cuantificar la F-actina en conjugados del T-cell/APC de células T humanas de muestras de sangre entera, sin la necesidad de purificación lentas y costosas medidas17. La técnica presentada aquí comprende el flujo de trabajo conjunto, de obtener la muestra de sangre para la cuantificación de la F-actina en la sinapsis inmune.

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Protocol

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1. preparación de los Pan-leucocitos

  1. Extraer 1 mL de sangre periférica de un donante sano (o paciente) en una jeringa heparinizada. Asegúrese de tener la aprobación por la Comisión responsable del ética para la donación de sangre.
  2. Mezclar 1 mL de periférico humano sangre con 30 mL de tampón de lisis ACK (150 m m de NH4Cl, 1 mM KHCO3y 0.1 mM EDTA, pH 7.0) en un tubo de 50 mL e incubar durante 8 minutos a temperatura ambiente.
  3. Llenar los tubos con PBS y centrifugar a 300 x g durante 6 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 30 mL de tampón de lisis ACK.
  4. Repita los pasos 1.2 y 1.3 hasta que el sobrenadante esté claro. Por último, lavar las células en PBS, centrifugar a 300 x g durante 6 min a temperatura ambiente y resuspender el precipitado de células en 2 mL de medio de cultivo (RPMI1640 + 10% FCS). Incube las células a 37 ° C durante 60 minutos.

2. carga de Raji células con SEB

  1. Preparar dos tubos Falcon de 15 mL con 1.5 x 106 células Raji por tubo. Desactivación de las células (300 x g durante 6 min a temperatura ambiente) y descarte el sobrenadante.
  2. Resuspender las células en medio residual (sobre 50-100 μL), añadir 1,9 μl (1,9 μg) SEB, incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos agregar 5 mL de medio de cultivo, desactivación de las células (300 x g durante 6 min a temperatura ambiente) y resuspender el precipitado en el medio de cultivo (RPMI 1640 + 10% FCS) con una densidad de 1 x 106 células/mL.

3. inducción de la sinapsis inmunes y Protocolo de tinción

  1. Pipetear 500 μl de la preparación de las células Raji cargado de SEB en un tubo de FACS y 500 μl de la preparación de células Raji descargadas en otro tubo de FACS. Añadir 650 μl de leucocitos de pan a cada tubo y rotación de las células (300 x g durante 10 min a temperatura ambiente). Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 150 μL de medio de cultivo (RPMI1640 + 10% FCS). Incubar a 37 ° C (típicamente 45 minutos).
  2. Vórtice suavemente las células (10 s a 1.000 rpm) y añadir 1,5 mL de paraformaldehido (1.5%) durante el vórtice para fijar las células. Detener la fijación mediante la adición de 1 mL de PBS + 1% de BSA. Sedimenten las células (300 x g durante 10 min a temperatura ambiente y resuspensión el precipitado de células en 1 mL de PBS + BSA 1% después de incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  3. Pellets (300 x g durante 10 min a temperatura ambiente) y resuspender las células en 100 μl de PBS BSA 1% + 0.1% saponina durante 15 min a temperatura ambiente para permeabilizar las células (placa de 96 pocillos, en forma de U).
  4. Lavar las células en PBS + BSA 1% + 0.1% saponina con centrifugación (300 x g durante 10 min a temperatura ambiente) y resuspender el pellet celular en 50 μl de PBS BSA 1% + 0.1% de saponina que contiene anticuerpos marcado con el fluoróforo o compuestos (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1: 150) y DAPI (1:3, 000)).
  5. Incubar las células en la temperatura ambiente en oscuridad durante 30 minutos lavar las células 3 veces añadiendo 1 mL de PBS + BSA 1% + 0.1% de saponina. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Re-resuspender las células en 60 μL de PBS para la proyección de imagen de citometría de flujo.

4. imagen adquisición utilizando un citómetro de flujo

Nota: El siguiente imagen adquisición procedimiento y análisis de datos se basan en imágenes de citometría de flujo utilizando software como imagestream (IS100), INSPIRE y IDEAS. Sin embargo, se puede utilizar otro software de citómetros y análisis de flujo.

  1. Abra el software de análisis en el equipo conectado al citómetro de flujo de imagen y haga clic en inicializar fluídicas del menú del instrumento. Aplicar los granos en el puerto correcto cuando se le pida hacerlo.
  2. Cargar la plantilla predeterminada en el menú Archivo y haga clic en configuración de carrera. Elegir cuentas desde el menú desplegable de ver.
  3. Ajustar el iluminador de campo brillante haciendo clic en ajustar intensidad si el valor está por debajo de 200.
  4. Ejecutar la calibración y prueba de rutina en la pestaña de ayuda haciendo clic en Inicio todos.
  5. Haga clic en bloqueo/descarga/carga y aplicar las muestras en el puerto izquierdo cuando se le pida hacerlo. Después de las células en el citómetro de flujo de carga, abrir el clasificador celular y ajuste los valores como sigue: límite superior de intensidad de pico en 1.022 para cada canal, máxima intensidad límite inferior a los 50 para el canal 2 (DAPI) y canal 5 (CD3-Pe-TxR), límite inferior de la zona a 50 para canal 1 (dispersión de lado) y límite superior a 1.500.
  6. Cambiar la energía del laser de la excitación a 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) y 647 nm (90 mW) en la ficha Configuración.
  7. Cambiar el menú desplegable de ver entre las células y los granos para evaluar los ajustes de energía celular clasificador y láser.
    Nota: Asegúrese de que todas las células y células parejas se encuentran el punto de vista de la célula y que grupos de células, desechos e imágenes con pixeles saturados se encuentran en la vista de residuos cambiando los clasificadores celulares o las potencias de láser de excitación.
  8. Definir el nombre de la muestra y la cantidad de imágenes para adquirir (15.000 – 25.000 muestras) y 500 para los controles de compensación en la ficha de configuración haga clic en ejecutar/Setup para iniciar la adquisición.

5. Análisis de datos

  1. Transferir los archivos de imagen raw (.rif) el equipo de análisis de datos y abra el software de análisis.
  2. Producir una matriz de compensación siguiendo las instrucciones de la lista desplegable de compensación. Guardar la matriz de compensación como comp_Date.ctm.
  3. Abrir un archivo de imagen raw de muestra (.rif) y aplicar el comp_Date.ctm en la ventana que aparece para producir los archivos de imagen compensada (.cif) y el archivo de análisis de datos por defecto (.daf).
  4. Abra el archivo de la imagen compensada. Convertir las imágenes a modo de color y ajustar las tablas lookup para obtener óptimos colores visibles en la barra de herramientas de propiedades de la galería de imagen. Obtener una imagen RGB combinado con la ficha compuesta de la barra de propiedades de la galería de imagen.
  5. Abra el administrador de la máscara de la lista desplegable de análisis. Crear máscaras para definir las células T y la sinapsis inmune, como sigue:
    1. Seleccione la máscara del T-cell: "(Fill (Threshold_Ch05, 60)." Seleccione la máscara de Valle: "Valley(Ch02,3)." Seleccione la máscara de sinapsis del T-cell: "máscara del T-cell y Valle (M02, Ch02, 3)."
  6. Abra el administrador de la característica de la lista desplegable de análisis. Calcular las siguientes características:
    1. Para la total expresión de CD3 en linfocitos T, seleccione "Intensity_T-cells_Ch5." Por el importe total de la F-actina en las células T, seleccione "Intensity_T-cells_Ch6." Para la expresión de CD3 en la sinapsis inmune, seleccionar «células Intensity_T synapse_Ch5.» Por la cantidad de F-actina en la sinapsis inmune, seleccionar «células Intensity_T synapse_Ch6.»
    2. Para calcular el área de la célula de T, seleccionar "Células de Area_T." Para calcular el área de la sinapsis inmune de células T, seleccione "sinapsis de la célula de Area_T."
  7. Determinar la F-actina y el enriquecimiento de CD3 en la sinapsis inmune mediante el uso de la ecuación en el administrador de la característica:
    figure-protocol-1
  8. Aplique la siguiente estrategia bloquea mediante histogramas y diagramas de punto de la zona de análisis (para más detalles, véase referencias 17 y 19):
    1. Deseche las células fuera de enfoque mediante el trazado de la "RMS_M2_Ch2 gradiente" en un histograma; Ajuste el umbral en 15.
    2. Parcela el SSC versus CD3 intensidad en una trama de puntos. Encuentra una puerta en eventos de CD3-positive.
    3. Trama de la "proporción" de M02 (tinción DAPI) versus el área de M02 (tinción Dapi). Puerta en camisetas T-célula y célula de parejas en consecuencia. Corregir para parejas celular verdadera usando el área de la máscara de la sinapsis, como se describió anteriormente17,19.
    4. Determinar la cantidad de F-actina en células T de las parejas del T-cell/APC y camisetas T-cell y el porcentaje de la F-actina en la sinapsis inmune.

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Results

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Una meta importante del método descrito aquí es la cuantificación de enriquecimiento de proteína (por ejemplo,, F-actina) en la sinapsis inmune entre sustituta APC (células Raji) y células de T en pan-leucocitos tomadas de muestras de sangre humana de bajo volumen (1 mL). La captura de pantalla en la figura 1 da una descripción de la estrategia bloquea crítica de este método. Muestra la galería de imágenes a la izquierda y el área de análisis de la derecha (

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Discussion

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El flujo de trabajo aquí presentado permite la cuantificación de la sinapsis inmunes entre las células T humanas (ex vivo) y APC. En particular, pan de lisis de eritrocitos-leucocitos fueron utilizados como fuentes de T-cell, haciendo pasos de purificación del T-cell prescindible. La línea de celular del linfoma de células B Raji sirve como sustituto APCs. Esto tiene ventajas significativas, ya que permite las comparaciones entre los donantes de sangre del lado de la sinapsis inmune T-cell. Además, DCs autólogo están ape...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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El trabajo fue financiado por el Consejo de investigación alemán (DFG) con subvenciones. SFB-938-M y SA 393/3-4.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
>Multifuge 3 SRHeraeus
RPMI 1640LifeTechnologies#11875085500 mL
FCSPan Biotech#3302-P101102
Tubo de fondo redondo de poliestirenoFalcon#3520545 mL
KulturflascheThermo Scientific#178883
Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoSigmaD8662
Albúmina sérica bovinaRoth#8076.3
SaponinaSigmaS7900
ParaformaldehídoSigma Aldrich#16005
FACS Wash SaponinaPBS 1% BSA 0.15 Saponina
ReaktiosgefaBSarstedt72.699.0020.5 mL
Speed BeadAmnis#400041
Minishaker MS1IKA Works  MS1
MikrotiterplatteGreiner Bio One#65010196U
Enterotoxina SEBSigma AldrichS4881
DAPISigma AldrichD95421:3000
CD3-PeTxRInvitrogenMHCD03171:30
Phalloidin-AF647Sondas molecularesA222871:150
IS100AmnisCitómetro de flujo por imágenes
IDEASAmnisSoftware
INSPIREAmnisSoftware

References

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