Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

Resumen

Aquí, describimos un completo flujo de trabajo para el análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmunes entre las células de T humanas primarias y células presentadoras de antígeno. El método se basa en imágenes por citometría de flujo, que permite la adquisición y evaluación de varias imágenes de miles de células en un período relativamente corto de tiempo.

Resumen

La sinapsis inmunológica es el área de la comunicación entre las células T y células presentadoras de antígeno (APC). Las células T polarizan receptores de la superficie y proteínas hacia la sinapsis inmune para asegurar a un enlace estable y señal de cambio. Microscopía confocal, TIRF o resolución súper clásico se han utilizado para el estudio de la sinapsis inmune. Puesto que estos métodos requieren la adquisición de la imagen manual y cuantificación desperdiciador de tiempo, la proyección de imagen de eventos raros es difícil. Aquí, describimos un flujo de trabajo que permite el análisis morfológico de decenas de miles de células. Sinapsis inmunológicas son inducidas entre las células primarias humanas T en preparaciones de pan-leucocitos y células de Staphylococcus aureus enterotoxina B SEB cargado Raji como CPA. Adquisición de imágenes se realiza con imágenes de citometría de flujo, también llamado microscopia en flujo, que combina características de un citómetro de flujo y un microscopio de fluorescencia. Se proporciona una completa estrategia bloquea para identificar parejas de la célula de T/APC y analizando la sinapsis inmune. Este flujo de trabajo permite el análisis de inmune sinapsis en preparaciones de pan-leucocito no purificada y por lo tanto requiere solamente un pequeño volumen de sangre (es decir,, 1 mL), puede aplicarse a muestras de pacientes. Importante, varias muestras pueden ser preparadas, medidas y analizadas en paralelo.

Introducción

Las células T son los principales reguladores del sistema inmune adaptativo y se activan a través de péptidos antigénicos que se presentan en el contexto de los complejos de histocompatibilidad (MHC). Completa activación de células T requiere dos señales, la señal de la competencia por el receptor de células T específicas de antígeno (TCR) / CD3 complejo y la señal costimulatory a través receptores accesorios. Ambas señales se generan a través de la interacción directa de las células T con el antígeno que presenta las células (APCs). Madura APC proporcionará la señal de la competencia para la activación de células T a través de complejos MHC-péptido, y expresan ligand....

Protocolo

1. preparación de los Pan-leucocitos

1. Extraer 1 mL de sangre periférica de un donante sano (o paciente) en una jeringa heparinizada. Asegúrese de tener la aprobación por la Comisión responsable del ética para la donación de sangre.
2. Mezclar 1 mL de periférico humano sangre con 30 mL de tampón de lisis ACK (150 m m de NH₄Cl, 1 mM KHCO₃y 0.1 mM EDTA, pH 7.0) en un tubo de 50 mL e incubar durante 8 minutos a temperatura ambiente.
3. Llenar los tubos con PBS y centrifugar a 300 x g durante 6 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 30 mL de tampón de lisis ACK.
4. Repita los pasos 1.2 y....

Resultados

Una meta importante del método descrito aquí es la cuantificación de enriquecimiento de proteína (por ejemplo,, F-actina) en la sinapsis inmune entre sustituta APC (células Raji) y células de T en pan-leucocitos tomadas de muestras de sangre humana de bajo volumen (1 mL). La captura de pantalla en la figura 1 da una descripción de la estrategia bloquea crítica de este método. Muestra la galería de imágenes a la izquierda y el área de análisis de la derecha (

Discusión

El flujo de trabajo aquí presentado permite la cuantificación de la sinapsis inmunes entre las células T humanas (ex vivo) y APC. En particular, pan de lisis de eritrocitos-leucocitos fueron utilizados como fuentes de T-cell, haciendo pasos de purificación del T-cell prescindible. La línea de celular del linfoma de células B Raji sirve como sustituto APCs. Esto tiene ventajas significativas, ya que permite las comparaciones entre los donantes de sangre del lado de la sinapsis inmune T-cell. Además, DCs autólogo están ape.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
>Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 mL
FCS	Pan Biotech#3302-P101102
Tubo de fondo redondo de poliestireno	Falcon	#352054	5 mL
Kulturflasche	Thermo Scientific	#178883
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Sigma	D8662
Albúmina sérica bovina	Roth	#8076.3
Saponina	Sigma	S7900
Paraformaldehído	Sigma Aldrich	#16005
FACS Wash Saponina		PBS 1% BSA 0.15 Saponina
ReaktiosgefaB	Sarstedt	72.699.002	0.5 mL
Speed Bead	Amnis	#400041
Minishaker MS1	IKA Works	MS1
Mikrotiterplatte	Greiner Bio One	#650101	96U
Enterotoxina SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	1:3000
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	1:30
Phalloidin-AF647	Sondas moleculares	A22287	1:150
IS100	Amnis		Citómetro de flujo por imágenes
IDEAS	Amnis		Software
INSPIRE	Amnis		Software