Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Resumen

Describimos el establecimiento de tumores colorrectales ortotópicos mediante la inyección de células tumorales o organoides en el ciego de ratones y el subsiguiente aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de este modelo.

Resumen

A pesar de las ventajas de la fácil aplicabilidad y rentabilidad, los modelos de ratón subcutáneo tienen limitaciones severas y no simulan con precisión la biología tumoral y la diseminación de células tumorales. Se han introducido modelos de ratones ortotópicos para superar estas limitaciones; Sin embargo, estos modelos son técnicamente exigentes, especialmente en órganos huecos como el intestino grueso. Con el fin de producir tumores uniformes que crecen de forma fiable y metástasis, las técnicas estandarizadas de preparación e inyección de células tumorales son críticas.

Hemos desarrollado un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal (CRC) que desarrolla tumores muy uniformes y puede ser utilizado para estudios de biología de tumores, así como ensayos terapéuticos. Se inyectan células tumorales de tumores primarios, líneas de células bidimensionales (2D) o organoides tridimensionales (3D) en el ciego y, dependiendo del potencial metastásico de las células tumorales inyectadas, forman tumores altamente metastáticos. En adición,Los CTC se pueden encontrar regularmente. Aquí describimos la técnica de preparación de células tumorales tanto de líneas celulares 2D como de organoides 3D, así como el tejido tumoral primario, las técnicas quirúrgicas y de inyección, así como el aislamiento de CTCs de los ratones portadores de tumores y los consejos actuales para la resolución de problemas.

Introducción

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las causas más comunes de muerte por cáncer en los países occidentales. ¹ Mientras que el tumor primario a menudo puede ser resecado, la aparición de metástasis distantes empeora drásticamente el pronóstico y a menudo conduce a la muerte. ^{2 , 3} El correlato biológico de la metástasis son las células tumorales circulantes (CTC), que se separan del tumor, sobreviven en la circulación, se adhieren al epitelio en el órgano diana, invaden el órgano y en última instancia, crecen a nuevas lesiones. ⁴ Aunque se sabe que los CTC son de relevancia pronóstica, ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} su biología sólo se entiende en parte como resultado de su extrema rareza en la CRC. ¹⁰

Los modelos de ratón son un poderoso tOol para estudiar diversos aspectos de la biología del cáncer. Los modelos clásicos de tumores subcutáneos se producen mediante inyección subcutánea de células tumorales en ratones receptores, que pueden ser inmunocompetentes (si se utilizan células tumorales murinas singénicas) o inmunodeficientes. Los modelos de tumor subcutáneo son baratos y producen datos rápidamente; Su crecimiento tumoral de punto final puede ser medido fácilmente y no invasivamente. Sin embargo, el 88% de los nuevos compuestos que han demostrado actividad antitumoral en estos modelos fallan en ensayos clínicos. ¹¹ Esto es en parte debido a las diferencias entre especies entre humanos y ratones; Sin embargo, una gran parte de este fracaso se debe al bajo valor predictivo de los modelos de ratones subcutáneos.

Los modelos de ratones ortotópicos, en los que las células tumorales se inyectan en el órgano de origen y, por tanto, crecen en su microambiente original, se utilizan cada vez más en la investigación del cáncer. ^{11 , 12 , 13 , 14} Los modelos ortotópicos no sólo simulan las condiciones locales de crecimiento tumoral; Como resultado del sitio anatómicamente correcto del crecimiento tumoral, los modelos de ratón ortotópico también permiten la simulación realista de la metástasis y por lo tanto se usan para estudiar la biología del CTC ^{8 , 15 , 16} o su respuesta a diferentes tratamientos en la CRC. ^{13 , 17}

Una de las principales desventajas de los modelos de ratones ortotópicos es su complejidad técnica. Dependiendo del órgano en el que se van a inyectar las células, la curva de aprendizaje hasta que el experimentador es capaz de inducir tumores reproducibles es bastante larga. Esto se aplica especialmente a los modelos de cáncer colorrectal, ya que las células tumorales necesitan ser inyectadas en la pared intestinal, lo que a menudo produce perforación, pérdida de células tumorales o pérdida endoluminal de células tumorales. Esto unEl objetivo de este artículo es describir el método de preparación celular a partir de muestras de tejido primario, líneas celulares 2D y cultivo organoide 3D y su inyección en el ciego de ratones. La técnica descrita aquí conduce a tumores muy uniformes y, dependiendo de la biología tumoral de la línea celular utilizada para inyección, la formación reproducible de metástasis a distancia y CTC en los ratones receptores. ¹⁵

Protocolo

Los experimentos con animales presentados aquí fueron revisados ​​y permitidos de forma independiente por un Comité de Cuidado de Animales y Uso Animal institucional y gubernamental y fueron conducidos de acuerdo con las directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencias de Animales de Laboratorio (FELASA). Se tomaron todas las medidas posibles para minimizar el sufrimiento, incluyendo anestesia y analgesia o, si es necesario, eutanasia prematura.

1. Preparación de células y organoides

NOTA: Utilice un volumen de 20 μL con 100.000 células para cada inyección. Utilizar la matriz de la membrana basal (BMM) para evitar fugas y asegurar la inyección estandarizada. Para asegurar resultados reproducibles, realice ensayos de autenticación de líneas celulares ( por ejemplo , mediante perfiles STR) a intervalos regulares.

1. Preparación de suspensiones celulares primarias a partir de tejido fresco
   NOTA: Siempre trabaje bajo condiciones estériles. La transferencia inmediata de losEl tejido resecado de la sala de operaciones al laboratorio sobre hielo es necesario para asegurar la alta viabilidad de las células.
   El bienestar del paciente y el tratamiento óptimo deben ser siempre la primera prioridad. Por lo tanto, las muestras de tejido para la investigación deben obtenerse de una manera que no interfiera con el posterior tratamiento patológico y estadificación del tumor resecado. En la mayoría de los casos, por lo tanto, es razonable tener las muestras para la investigación obtenida por un patólogo entrenado con el fin de garantizar la no interferencia con el diagnóstico patológico.
   1. Inmediatamente después de la extracción estéril de la muestra resecada (idealmente ~ 1 cm ³ ), coloque la muestra de tejido en un tubo de 50 mL previamente llenado con 20-30 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Guarde el tubo en hielo y transfiéralo inmediatamente al laboratorio.
   2. Poner el tejido en una placa de Petri y lavar dos veces con un montón de PBS para eliminar la sangre restante.
   3. Cortar el tejido en trozos pequeños (~ 2-4 mm) con una scaLpel ( por ejemplo , con una cuchilla # 20 o # 36).
   4. Utilizar el disociador de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el fin de disociar aún más el tejido tumoral a una suspensión de una sola célula. Alternativamente, utilice otros protocolos de digestión enzimática del tumor.
   5. Contar las células de la suspensión de una sola célula resultante ( por ejemplo , en un contador de cuchillas o un hemocitómetro).
   6. Centrifugar (5 min a 1.500 xg) y lavar la suspensión celular dos veces con PBS.
   7. Resuspender las células en BMM a una concentración de 5 x 10 ⁶ células / mL y mantenerlos en hielo.
2. Preparación de líneas celulares para inyección
   1. Cultivar todas las líneas celulares de cáncer colorrectal en condiciones normales de cultivo (37 ° C, 5% CO ₂ ) y prepararlas el día de la cirugía.
   2. Cosechar las células de acuerdo con los protocolos de cultivo de células estándar, contar las células ( por ejemplo , en un contador de cuchara o un hemocitómetro) y calcular la demandaCantidad necesaria para todas las inyecciones dependiendo del número de animales a inyectar.
   3. Prepare 3-5x del volumen realmente necesario para tener en cuenta las pérdidas de pipeteo y el volumen muerto de la jeringa de inyección.
   4. Centrifugar (5 min a 1.500 g) y lavar la suspensión celular dos veces con PBS.
   5. Resuspender las células en BMM a una concentración de 5 x 10 ⁶ células / mL y mantenerlos en hielo.
3. Preparación de los organoides
   NOTA: Todos los cultivos organoide 3D se cultivan en condiciones de cultivo estándar (37ºC, 5% CO ₂ ). Ya se han publicado protocolos detallados para el cultivo de organoides. ^{18 , 19 , 20} Similar a las líneas celulares convencionales, se recomienda un volumen de 20 μL de BMM con 100.000 células por inyección. Los organoides se preparan el día de la cirugía como sigue:
   1. Preparar el siguiente medio (en los siguientesA DMEM / F12 +++): Medio de Eagle modificado de Dulbecco avanzado (DMEM) / F12 + 1% de HEPES (1M) + 1% de glutamina (200 mM) + 1% de penicilina / estreptomicina.
   2. Pre-llenar tubos de 15 mL con 1 mL de DMEM / F12 +++.
   3. Aspirar cuidadosamente los organoides de la superficie de la placa de cultivo y transferir el contenido de 3 a 5 pocillos en un tubo de 15 ml.
   4. Cuidadosamente romper las organoides en trozos más pequeños por pipetearlos arriba y abajo con una pipeta de vidrio extendida.
   5. Añadir 5 mL de DMEM / F12 +++ al tubo, seguido de centrifugación a 1.000 xg durante 5 min.
   6. Después de la centrifugación, se retira el sobrenadante, se resuspende el sedimento en 600 μl de tampón de disociación enzimática y se transfiere la suspensión a un pocillo de una placa de 6 pocillos.
   7. Incubar a 37 ° C durante 1-5 minutos y luego cuidadosamente pipetear la suspensión hacia arriba y hacia abajo con el fin de disolver los organoides.
      NOTA: Verificar la digestión a través del microscopio; Se completa cuando todos los clusters de células se han disociadoD a las células individuales.
   8. Tras la digestión exitosa, agregar 1,4 ml de DMEM / F12 +++ para detener la digestión. Luego transferir todos los pocillos de organoides digeridos a un tubo de 50 ml.
   9. Cuente las células y calcule la cantidad requerida para todas las inyecciones.
   10. Prepare de 3 a 5 veces el volumen realmente necesario para tener en cuenta las pérdidas de pipeteado y el volumen muerto de la jeringa de inyección
   11. Centrifugar (5 min a 1.500 xg) y lavar la suspensión celular dos veces con PBS.
   12. Se resuspendieron las células en BMM a una concentración de 5 x ¹⁰⁶ células / mL y se mantuvieron en hielo.

2. Modelo de ratón ortotópico

1. Preparación de los animales receptores para la cirugía
   NOTA: Utilice como destinatarios a los ratones NOD.Cg-Prkdc ^{scid de} 6 a 8 semanas de edad como ratones II2rg ^tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG). ²¹ NSG están entre los ratones más inmunocomprometidos, carecen de células maduras B, T y NK junto con otros múltiples inmunes.Los efectos. ²¹ Ellos crecen de forma fiable los tumores incluso si se inyectan bajo número de células y son muy propensos a la metástasis a distancia. Los ratones NSG son excelentes reproductores y pueden mantenerse en unidades convencionales libres de patógenos específicos (SPF).
   1. Antes de la primera incisión, inyectar 0,05 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea.
   2. Utilice sevoflurano al 3-3.5% en volumen para anestesia general. Una pérdida del reflejo de pinza del dedo del pie indica suficiente anestesia.
   3. Cubrir los ojos de los ratones anestesiados con pomada oftálmica para evitar la desecación de la córnea.
   4. Detenga los ratones en posición supina sobre una mesa pequeña.
   5. Afeitar el abdomen con una máquina de afeitar eléctrica (la crema depilatoria se puede utilizar alternativamente) y desinfectar con al menos 3 veces clorhexidine / yodo y alcohol del 70% alternativamente.
   6. Cubrir el campo quirúrgico con cortinas estériles.
      NOTA: El uso de antibióticos perioperatorios es opcional y está sujeto a las pautas institucionales.
2. Laparotomía de la línea media y la exposición del ciego
   1. Use tijeras (los bisturíes se pueden usar alternativamente) para hacer una pequeña incisión de la línea media (3 - 5 mm) de la piel en el bajo abdomen. Recoger la musculatura de la pared abdominal con fórceps y cuidadosamente incise con tijeras, abriendo así la cavidad abdominal.
   2. Identificar y cuidadosamente exteriorizar el ciego con pinzas atraumáticas. Coloque la bolsa de terminación ciega del ciego en el abdomen apuntando cranealmente.
   3. Una vez exteriorizado, mantenga el ceco húmedo utilizando hisopos salinos tibios en todo momento.
3. Inyección ortotópica, cierre del abdomen y recuperación postoperatoria
   1. Para inyección intracecal, use una jeringa estándar de 1 ml con una cánula de 30 G. Monte esta jeringa en una bomba de microinyección, que a su vez se monta en un micromanipulador.
   2. Cuidadosamente agarre la punta del ciego con fórceps atraumático y suavemente suavizarlo acariciándolo downwarD con un segundo conjunto de fórceps humedecido con solución salina caliente.
   3. Coloque la cánula directamente sobre el ciego.
   4. Realice los siguientes pasos bajo control visual con un microscopio quirúrgico binocular.
   5. Coger con cuidado el ciego con dos pinzas atraumáticas en ambos extremos de la parte exteriorizada del ciego, estirarlo ligeramente y luego tirar lentamente sobre la cánula que se coloca paralelo y directamente encima. Es crucial no perforar toda la pared intestinal (inyectando así las células en el lumen), así como no perforar la serosa más allá del punto inicial de penetración, ya que esto conduciría a la fuga ya la diseminación peritoneal.
      1. Mueva el intestino hacia la cánula, no la cánula hacia el intestino. Sostenga y estire el intestino entre dos fórceps. Las manos del cirujano deben descansar sobre una superficie para reducir el temblor.
   6. Inyectar las células entre la serosa (visto como un revestimiento muy fino y translúcidoE intramurales) y la muscular. Por lo tanto, la cánula debe colocarse visualmente por encima de los vasos sanguíneos y por debajo de la delgada membrana translúcida.
   7. Utilice un interruptor de pie para iniciar la inyección con el fin de reducir el temblor mientras la cánula está dentro de la pared intestinal.
   8. Una vez que la cánula está en posición, iniciar la inyección. Utilice una duración de 20 s, resultando en un ajuste de 1 μl / s en la unidad de control de la bomba.
      NOTA: La inyección en o cerca de un vaso sanguíneo dañado conduce a diseminación intravascular directa ya metástasis a distancia y por lo tanto debe evitarse.
   9. Después de completar la inyección, retire cuidadosamente la cánula tirando hacia atrás.
   10. Coloque un hisopo seco debajo del ciego, y luego enjuague completamente el ciego con agua destilada con el fin de lisar las células filtradas y evitar así la difusión peritoneal artificial.
4. Cierre del abdomen y recuperación postoperatoria
   1. Después de rInsing, devolver suavemente el ciego a la cavidad abdominal.
   2. Cierre la pared abdominal con suturas corrientes de absorción rápida de 6-0.
   3. Cierre la piel con clips para heridas quirúrgicas.
   4. Coloque el ratón en un mapa de calefacción establecido a 38 ° C hasta que se ha recuperado completamente de la anestesia.
   5. Observar de cerca el estado postoperatorio de los ratones durante las siguientes 48 h. En caso de malestar, tratar con 0,05 mg / kg de buprenorfina cada 12 h.
   6. Vigilar a los ratones al menos una vez al día para detectar signos de angustia debido al crecimiento del tumor.

3. Aislamiento de células tumorales circulantes de muestras de sangre entera

NOTA: Obtenga sangre por punción cardiaca transcutánea en ratones anestesiados, seguida de eutanasia. Idealmente, se inyectan 1.000 μl de sangre en una jeringa precargada con 100 μl de un anticoagulante (ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o heparina). Utilizar un anti-humano-EpCAM (adhesión de células epitelialesMolécula) para identificar los CTC. Esto funciona muy bien si se usan líneas de células epiteliales humanas en el modelo de ratón. Para otros aparatos, pueden ser necesarios diferentes anticuerpos.

1. Enriquecimiento de CTC:
   1. Pre-llene los tubos de 15 mL con 5 mL de medio de gradiente de densidad y transfiera cuidadosamente la sangre al tubo de 15 mL.
   2. Centrifugar (30 min a 300 xg sin freno) y retirar cuidadosamente el sobrenadante superior.
   3. Verter el resto en un nuevo tubo de 15 ml y centrifugar (15 min, 300 xg con freno).
   4. Recuperar la interfase que contiene las células mononucleares (descarte el resto) y lavar las células dos veces con PBS.
   5. Resuspender el sedimento en 200 μL de PBS / 1% de EDTA y añadir 4 μl de anticuerpo EpCAM. Incubar 20 min en hielo en la oscuridad.
2. Tamizaje y selección
   1. Preparar el siguiente tampón (en lo siguiente denominado tampón de recogida): PBS + 10% de suero de ternera fetal (FCS) + 1% de penicilina / STreptomicina (1%) + 0,8% de EDTA.
   2. Utilice un lápiz PAP para dibujar un círculo de ~ 1 cm en una placa de Petri estéril de 6 cm (evita que el líquido se disperse en el plato) y pipetee 700 μl de tampón de recogida en este círculo.
   3. Añadir 50 μl de suspensión celular al tampón de recogida de 700 μl dentro del círculo. Compruebe la densidad de las células con el microscopio. Dividir la muestra en platos diferentes si es demasiado densa.
   4. Espere a que las células se establezcan (~ 5 min).
   5. Muestre la gota de la suspensión celular para las células teñidas (= EpCAM-positivas).
   6. Una vez que se encuentra una célula, recoger la célula con el micromanipulador y ponerlo en 50 μ l de buffer dependiendo de la intención de análisis aguas abajo ( por ejemplo , RNA extracción de amortiguación o medio de cultivo).
   7. Dependiendo de los análisis de aguas abajo, aislar las células EpCAM negativas y / o el medio como controles negativos.
   8. Proceder con análisis de aguas abajo ( por ejemplo , cultivo celular, PCR).

Resultados

La generación exitosa y reproducible de tumores colorrectales en este modelo depende en gran medida de una inyección precisa de las células sin derrames o fugas. Si esto se consigue, este modelo es extremadamente fiable y rara vez da lugar a la diseminación peritoneal artificial. La cinética de crecimiento de los tumores, así como sus patrones de diseminación dependen de la biología de los organoides y células utilizados. ¹⁵ Mientras que las células HCT116 metasta...

Discusión

A pesar de su actividad preclínicamente probada en los modelos de ratones subcutáneos, la gran mayoría de los nuevos compuestos fallan en ensayos clínicos y nunca llegan a la clínica. ¹¹ Esta insuficiencia evidente de modelos subcutáneos de ratón para simular con precisión los patrones de la biología y de crecimiento de los tumores ha conducido al desarrollo de modelos ortotópicos ratón basa en la inyección de las células tumorales directamente en el órgano original.

...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios y componentes de cultivo celular
Avanzado DMEM F12	Invitrogen	12634010	DMEM/ F12 +++ medio
HEPES (1 M)	Life Technologies GmbH	15630056	DMEM/ F12 +++
medio Glutamax-I Suplemento (200 mM)	Life Technologies GmbH	35050038	DMEM/ F12 +++
medio Penicilina/ Estreptomicina (PenStrep)	Life Technologies GmbH	15140122	DMEM/ F12 +++
medio DMEM	Life Technologies GmbH	61965026	medio básico de líneas celulares 2D (DMEM/10% FCS)
Suero fetal para terneros (FCS)	BIOCHROM AG	S 0115	medio básico de líneas celulares 2D (DMEM/10% FCS)
Tampón de disociación enzimática TrypLE Express	Life Technologies GmbH	12604021
Matriz de membrana basal Matrigel (BMM, sin rojo de fenol)	CORNING B.V. Life Sciences	356231
solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Life Technologies GmbH	14190169
tripsina-EDTA (0,25%, fenol-rojo)	Life Technologies GmbH	25200072
placas de 6/48 pocillos con tapa	CORNING	3516/3548
matraz de cultivo celular 75 cm², matraz de cultivo celular de 250 mL	VWR International GmbH	734-2066
150 cm², 600 mL	Corning B.V. Life Sciences	355001
tubos Eppendorf 1,5 mL / 2 mL	Sarstedt AG & Co.	72.706.400/ 72.695.400
Tubos de centrífuga de 15 mL, 50 mL	Greiner-Bio-One GmbH	188271/227270
TC10 Portaobjetos de recuento (para máquina de recuento TC20)	Bio-Rad Laboratories GmbH	1450016
pipetas Pasteur (vidrio, 150 mm)	Fisher Scientific GmbH	11546963/ FB50251	finamente extraído con un mechero Bunsen
gentleMACS Disociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	para la preparación de tejido tumoral primario
MACSmix Rotador de tubos	Miltenyi Biotec	130-090-753	para la preparación de tejido tumoral primario
gentleMACS C Tubos	Miltenyi Biotec	130-093-237	para la preparación de tejido tumoral
primario kit de disociación de tumores humanos	Miltenyi Biotec	130-095-929	para la preparación
de tejido tumoral primarioHalcón 70 y micro; m Filtro de células	Corning B.V. Life Sciences	352350	para la preparación de tejido tumoral primario
Name	Company	Número de catálogo	>Comentarios
strongEquipo quirúrgico
Sevoflurane	AbbVie Germany GmbH & Co. KG-Oxígeno
medicinal	Air Liquide Medical
	Temgesic-Bepanthen
- ungüento oftálmico	Bayer Vital GmbH	10047757
Solución salina normal 0,9% (E154)	Serumwerk Bernburg AG	10013
Aqua ad injectabilia	Braun 235144
Jeringa de 1 mL (sin volumen muerto) - Injekt-F SOLO	Braun/neoLab	194291661
aguja de inyección de 30 G	BECTON DICKINSON	304000
hisopos de celulosa	Lohmann & Rauscher Deutschland	13356
Pinza Micro-Adson	FST - Fine Science Tools	11018-12
Tijera Iris - ToughCut	FST - Fine Science Tools	14058-11
Olsen-Hegar Portaagujas	FST - Fine Science Tools	12002-12
AutoClip Kit	FST - Fine Science Tools	12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (quirúrgico sutura)	Johnson & Johnson Medical GmbH	Z1012H Máquina
anestesia de investigación de sobremesa con descarga de O2 y vaporizador de sevoflurano	Parkland Scientific V3000PS	/PK
Bomba UltraMicro con controlador Micro4 Equipo	UMP3-4	World Precision Instruments	para inyección ortotópica altamente controlada
Interruptor de pedal para controlador SYS-Micro4	World Precision Instruments	15867	Equipo para inyección ortotópica altamente controlada
Micromanipulador manual de tres ejes	World Precision Instruments	M325	Equipo para inyección ortotópica altamente controlada
Soporte magnético para micromanipulador	World Precision Instruments Equipo	M10	para inyección ortotópica altamente controlada
Placa base de acero para soporte magnético M10	World Precision Instruments	5479	Equipo para inyección ortotópica altamente controlada
Placa caliente 062	Labotect	13854
Isis - Afeitadora de pelo	AESCULAP -
	Parkland Scientific	VS-2Z
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
>CTC aislamiento
EDTA	Roth	8040.1
Gradiente de densidad medio – Ficoll	StemCell - Lymphoprep	7801
Alexa Fluor 488 anti-humano CD326 (EpCAM) clon de anticuerpos 9C4	BioLegend	324210
Alexa Fluor 488 anti-ratón CD326 (EpCAM) clon de anticuerpos G8.8	BioLegend	118210
Placa de Petri, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent	Greiner bio-one	628102
Microscopio de cultivo celular de fluorescencia	Micromanipulador Leica
Transferman 4r	Eppendorf
CellTram Air	Eppendorf		conectada al micromanipulador
Dmz Extractor de microelectrodos universal	Dagan Corporation		necesario para la fabricación de microcapilares para la aspiración de una sola célula
Prisma Capilares de vidrio	Dagan Corporation
Bolígrafo PAP	Abcam	ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Life Technologies GmbH	14190169	tampón de recogida
Fetal Calf Serum (FCS)	BIOCHROM AG	S 0115	tampón de recogida
Penicilina/estreptomicina (PenStrep)	Life Technologies GmbH	15140122	tampón de recogida
EDTA	Roth	8040.1	búfer de selección
Name	>Company	Número de catálogo	Comentarios
>Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) clon 9C4	BioLegend	324201	EpCAM inmunohistoquímica (cf. fig. 2C)
HRP conejo anti-ratón IgG	Abcam	ab97046	EpCAM inmunohistoquímica (cf, fig. 2C)