Artículo de método
* These authors contributed equally
Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.
Microglia son los respondedores primarios a los insultos del sistema nervioso central; Sin embargo, aún queda mucho por conocer acerca de su papel en la regulación de la neuroinflamación. La microglía son las células del mesodermo que funcionan de manera similar a los macrófagos en topografía estrés inflamatorio. El (M1-tipo) clásico y (de tipo M2) alternativa activaciones de los macrófagos también se han extendido a la microglía en un esfuerzo por entender mejor la interacción subyacente estos fenotipos tienen en condiciones neuroinflammatory como el Parkinson, el Alzheimer y las enfermedades de Huntington. En la experimentación vitro utilizando microglia primaria proporciona resultados rápidos y fiables que pueden ser extendidas al ambiente en vivo. Aunque esta es una clara ventaja sobre la experimentación in vivo, aislar microglia, mientras que el logro de rendimientos adecuados de pureza óptima ha sido un reto. Los métodos comunes actualmente en uso ya sea sufren de baja recuperación, baja pureza, o ambos. Aquí, nos demtrar un refinamiento del método de separación magnética CD11b libre de columnas que logra una recuperación de células de alta y una mayor pureza en la mitad de la cantidad de tiempo. Proponemos este método optimizado como un modelo muy útil de aislamiento primaria microglial a los efectos de estudiar la neuroinflamación y la neurodegeneración.
La microglía son macrófagos residentes Myb-independientes de origen mesodérmico, que diferencian de c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitores en las islas de sangre del saco vitelino 1, 2. Una vez microglia embriológicas han colonizado el sistema nervioso central (CNS), en su transición desde una ameboide a una forma ramificada 3. Estos microglia adultos se clasifican como surveillant ya que sus ramificaciones dinámicos para sondear el parénquima cerebral saludable para posibles insultos 4. Aunque microglia sólo contribuyen a aproximadamente el 10% de la pobla....
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El uso de los animales y los procedimientos de protocolo fue aprobado y supervisado por el Comité Institucional Animal Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad Estatal de Iowa (Ames, IA, EE.UU.)
1. Cultivo de mixtos gliales culturas
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Microglia aislado utilizando el kit de CD11b selección positiva II tienen alta pureza
microglia primarios de ratón se aislaron utilizando el protocolo mencionado anteriormente y se sembraron en cubreobjetos de poli-D-lisina para comprobar la pureza de aislamiento. Diez mil células se sembraron por pocillo y el análisis inmunocitoquímico se realizó usando ionizado molécula adaptadora de unión de calcio-1 (Iba1) como marcador de la.......
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métodos de aislamiento microgliales mayores tienen recuperaciones limitadas que no son apropiados para diversos análisis de proteína por Western blot y análisis de ARN mediante qRT-PCR. La adherencia diferencial y métodos tripsinización leves son dos enfoques comunes con bajos rendimientos microgliales 13, 14, 15. El enfoque CD11b basado en columnas también tiene una baja recuperación, pero consigue una mayor pureza que la adhe.......
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Subvenciones: NS088206 y ES026892. La W. Eugene y Linda Cátedra Lloyd a AGK y decanos Cátedra de AK también son reconocidas.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| EasySep CD11b Kit de Separación II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Piruvato de sodio | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Aminoácidos no esenciales (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamina (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Suero Fetal Bovino (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Tripsina-EDTA | Gibco de Life Technologies | 25200 | |
| PBS de Dulbecco (DPBS) | Gibco de Life Technologies | 14190250 |
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