El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.

Resumen

Microglia son los respondedores primarios a los insultos del sistema nervioso central; Sin embargo, aún queda mucho por conocer acerca de su papel en la regulación de la neuroinflamación. La microglía son las células del mesodermo que funcionan de manera similar a los macrófagos en topografía estrés inflamatorio. El (M1-tipo) clásico y (de tipo M2) alternativa activaciones de los macrófagos también se han extendido a la microglía en un esfuerzo por entender mejor la interacción subyacente estos fenotipos tienen en condiciones neuroinflammatory como el Parkinson, el Alzheimer y las enfermedades de Huntington. En la experimentación vitro utilizando microglia primaria proporciona resultados rápidos y fiables que pueden ser extendidas al ambiente en vivo. Aunque esta es una clara ventaja sobre la experimentación in vivo, aislar microglia, mientras que el logro de rendimientos adecuados de pureza óptima ha sido un reto. Los métodos comunes actualmente en uso ya sea sufren de baja recuperación, baja pureza, o ambos. Aquí, nos demtrar un refinamiento del método de separación magnética CD11b libre de columnas que logra una recuperación de células de alta y una mayor pureza en la mitad de la cantidad de tiempo. Proponemos este método optimizado como un modelo muy útil de aislamiento primaria microglial a los efectos de estudiar la neuroinflamación y la neurodegeneración.

Introducción

La microglía son macrófagos residentes Myb-independientes de origen mesodérmico, que diferencian de c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitores en las islas de sangre del saco vitelino ^{1, 2.} Una vez microglia embriológicas han colonizado el sistema nervioso central (CNS), en su transición desde una ameboide a una forma ramificada ^3. Estos microglia adultos se clasifican como surveillant ya que sus ramificaciones dinámicos para sondear el parénquima cerebral saludable para posibles insultos ^4. Aunque microglia sólo contribuyen a aproximadamente el 10% de la población de células del SNC, su capacidad de baldosas entre sí asegura el escaneado máxima del parénquima ^{4, 5.} Patrones de peligro asociado-moleculares (amortigua), tales como α-sinucleína ^{6, 7} y amiloide-β ^8, o ppatrones moleculares athogen asociados-(PAMP), tales como el lipopolisacárido (LPS) ^9, clásicamente activan microglia para promover una respuesta inflamatoria caracterizada por la reversión al estado activo ameboide y la producción de óxido nítrico, factor de necrosis tumoral-α (TNF), 1β interleucina ligando (IL-1β), IL-6, IL-12, y el motivo de quimioquinas CC 2 ^{9, 10, 11.} En condiciones neuroinflamatorios tales como la enfermedad de Parkinson, en los que patógena α-sinucleína ha acumulado, un ciclo neurodegenerativa se crea a partir de la muerte de las neuronas dopaminérgicas, que liberan más agregado α-sinucleína, promover aún más la activación clásica de la microglia ^7. Similar a los macrófagos periféricos, microglia también puede tener la capacidad de activar alternativamente en presencia de las citoquinas antiinflamatorias IL-4 e IL-10, dándoles la potenteial de promover la reparación neural y atenuar la inflamación ^{2, 11.} Aparte de sus papeles inmunológicos en el SNC, microglia se han descrito como reguladores vitales de circuitería neuronal mediante la poda sinapsis durante el desarrollo. Por ejemplo, los ratones KO Cx3cr1- tienen microglia menos densas y la reducción de la poda sináptica, lo que conduce a una sobreabundancia de las espinas dendríticas, las sinapsis inmaduras, y los patrones electrofisiológicas de un CNS subdesarrollado ^12. La comprensión de estas complejidades fisiológicos y los diversos papeles funcionales de microglia en la homeostasis del SNC es crítica para la búsqueda de agentes terapéuticos dirigidos trastornos neurodegenerativos.

En el área de Neuroinmunología, los experimentos in vitro son muy deseables debido a la mayor viabilidad para estudios mecanísticos, los menores costes de mantenimiento, y por ser menos tiempo y mano de obra intensiva. Furthermore, la capacidad de aislar poblaciones de células es crítica para delinear la funcionalidad de aquellas células diana en las condiciones prescritas. Existen numerosos métodos de aislamiento microgliales, pero están limitados por su capacidad para obtener un número relativamente alto y de pureza de amplia experimentación ^{13, 14, 15.} Por ejemplo, un grupo de 11b diferenciación (CD11b) es un marcador de superficie común de los monocitos, macrófagos y microglia ^16. Mediante la explotación de CD11b, un método de separación magnética fue descrito primero como un enfoque basado en la columna que produjo ~ 99,5% de pureza y ~ 1,6 x 10 ⁶ microglia por cerebro neonatal ^17. Nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un método libre de la columna CD11b magnético de separación ^15, que se realizó en un tubo de poliestireno mediante el etiquetado de CD11b con un anticuerpo monoclonal conjugado con ficoeritrina (PE). Una seconda biespecíficoanticuerpo ry a PE y complejos de dextrano con la PE. Una vez unido, se introducen partículas magnéticas revestido con dextrano, que se unen al extremo de dextrano del complejo de anticuerpo. Por último, el tubo de poliestireno se coloca en un imán para el aislamiento microglial. Este enfoque se duplicó el rendimiento de ~ 3,2 x 10 ⁶ microglia por cerebral neonatal, pero a costa de reducir la pureza de ~ 97%.

En este documento, se demuestra un protocolo de separación rápida y refinado libre de columnas CD11b magnético (Figura 1). Este método mejorado sigue siendo tan factible como nuestro método libre de columna original ya que el precio del kit de separación magnética CD11b es el mismo. El tiempo de terminación se reduce en un medio, que puede ser crucial para maximizar la supervivencia celular y el rendimiento. Notablemente, la pureza logrado a partir de este método es optimizado ~> 99%, una mejora con respecto a la pureza alcanzado desde el método original libre de columnas desarrollado por nuestro laboratorio ^15. Lo más importante, CD11b-PEno se utiliza, eliminando la necesidad de incubar lejos de la luz y permitiendo el uso del canal rojo para microscopía de fluorescencia. Por último, como en el método original CD11b, una fracción de los astrocitos de alto rendimiento y pureza se obtiene con este método mejorado. Los astrocitos son las más numerosas células gliales en el sistema nervioso central, dando lugar a la idea de que sus funciones homeostáticas son indispensables en relación con la fisiopatología ^18. Estas células gliales juegan un papel en diversas funciones fisiológicas, tales como la formación de la barrera sangre-cerebro, proporcionando soporte de nutrientes, mantenimiento de la homeostasis de neurotransmisores, formando cicatrices gliales en respuesta a una lesión, la neuroprotección, el aprendizaje y la memoria, y la neuroinflamación, ejemplificando su potencial de investigación en glial biología ^19. Morfología y funcionalidad de la microglia y astrocitos se han comprobado a través de microscopía confocal, Western Blot, cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR), Gensayo de nitrito Riess, y el ensayo multiplex de citocinas Luminex. El refinamiento proporcionada por este protocolo ofrece una mayor confianza perteneciente a la pureza de la microglia o los astrocitos, una aplicación más amplia de microscopía de fluorescencia con la disponibilidad del canal rojo, y ahorra tiempo, todos los cuales son importantes para la experimentación in vitro.

Protocolo

El uso de los animales y los procedimientos de protocolo fue aprobado y supervisado por el Comité Institucional Animal Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad Estatal de Iowa (Ames, IA, EE.UU.)

1. Cultivo de mixtos gliales culturas

1. Decapitar 1- 2 días de edad, los cachorros rápidamente con unas tijeras que operan 5,5 pulgadas, y colocar las cabezas inmediatamente en un tubo de 50 ml en hielo. Tenga en cuenta que este es el modo de la decapitación de la eutanasia.
2. En una campana de flujo de aire laminar, hacer una pequeña incisión en el cráneo y las meninges utilizando 4,5 pulgadas tijeras de disección micro rectas. Iniciar el corte desde el extremo caudal al extremo rostral (nariz). Obtener debajo de la piel mediante el uso de la abertura formada por la decapitación.
   1. Después de la incisión, la cáscara de uno de los hemisferios a un lado. A continuación, utilice un par de pinzas curvadas o en forma de gancho para eliminar todo el cerebro.
3. Sumergir el cerebro (s) en un nuevo tubo de 50 ml que contiene 0,25% de tripsina-ethylenediaminetetraacetácido (EDTA) durante 15 min comió en un baño de agua C 37 °. Utilice 2 ml de tripsina-EDTA por cerebro.
4. Lavar el cerebro (s) con medio fresco de crecimiento (10% de FBS, DMEM / F12, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina, piruvato de sodio al 1%, y 1% de aminoácidos no esenciales) mediante la adición y la eliminación de la medios de comunicación. Repita este 4x.
5. Para cada cerebro, la placa de dos T-75 matraces que contienen medio de crecimiento. Por lo tanto, añadir 2 ml de medio de crecimiento por cerebro al tubo. Por lo tanto, será un equivalente de 1 ml de cerebro se homogeneizó con 8-9 ml de medio de crecimiento por matraz T-75.
6. Homogeneizar triturando el cerebro (s) con pipetas de diferentes tamaños de apertura, en orden de mayor a menor. Cuando se ve que el tejido cerebral no se hace más pequeño, la transición a la siguiente pipeta. Al final de la trituración, la suspensión debe ser clara, sin trozos visibles.
   1. Utilice una pipeta de 25 ml, 5 ml de la pipeta, y entonces un ml pipeta secuencialmente 10.
7. Pase cada homogsuspensión de cerebro enous a través de un filtro de células de 70 m para que sea en un único cultivo celular.
8. Para cada cerebro se homogeneizó, placa dos matraces T-75 que contiene medio de crecimiento, como se describe en el paso 1.5 (1 ml de cerebro se homogeneizó con 8-9 ml de medio de crecimiento por matraz T-75).
9. Cambio de medio de crecimiento después de 6 d y crecer hasta que el aislamiento de los ¹⁶ días.

2. Aislamiento de las células microgliales

1. Después de 16 días, eliminar el medio de crecimiento del matraz y colocarlo en un tubo fresco 50 ml. Añadir 3 ml 0,25% de tripsina-EDTA a cada matraz T-75. Agitar los frascos durante 5 min a TA en un agitador orbital.
   1. Centrifugar el medio de crecimiento se eliminó a 0,4 xg durante 5 min y utilizar para detener la reacción con tripsina-EDTA en la etapa subsiguiente.
2. Después de agitar durante 5 min, añadir un mínimo de 4 ml de medio de crecimiento (fresco o los medios de comunicación utilizado a partir de 2.1.1) para detener la reacción con tripsina-EDTA.
3. Se tritura para asegurar que toda la cells se hayan separado.
4. Después de la trituración, pasar las células a través de un filtro de células de 70 m para que sea en un único cultivo celular, realizar un recuento de células, y después de girar las células a 0,4 x g durante 5 min.
5. Para cada 100 x 10 ⁶ células (aproximadamente 15 x matraces T-75), utilizar 1 ml de medio recomendado (2% de FBS, DPBS (calcio y magnesio libre de cloruro), EDTA 1 mM) para resuspender el sedimento celular.
   NOTA: Todos los pasos siguientes se adaptan para una separación de 1 ml.
6. Tomar un tubo de poliestireno de 5 ml, añadir 1 ml de medio recomendado, y marcar el menisco. Añadir recomendado del papel hasta 2,5 ml y marcar esto también. Desechar los medios recomendados y transferir las células resuspendidas al tubo de poliestireno de 5 ml.
7. Añadir 50 l de suero de rata para cada 1 ml de células suspendidas. Incubar durante 5 min a TA.
8. Preparar cóctel selección mezclando 25! L de componente A y 25 l de componente B. Estos componentes son propietarios.
9. Añadir 501; L del cóctel de selección a las células. Incubar durante 5 min a TA.
   NOTA: Para los cultivos puros, repita el paso 2.9 (recomendable pero no obligatorio).
10. microesferas de vórtice durante 45 s. Añadir 80 l de microesferas por 1 ml de muestra. Incubar durante 3 min a TA.
11. Llevar el volumen a 2,5 ml en el tubo de poliestireno mediante la adición de los medios recomendados.
12. Poner el tubo en el imán durante 3 minutos a temperatura ambiente. Ajuste de la incubación para aumentar la pureza. Verter lentamente a cabo los soportes recomendados en un tubo de 15 ml con el imán todavía en el tubo de poliestireno.
13. Repita el paso 2.12 tres veces más. incubaciones magnético adicional se puede realizar para aumentar la pureza.
14. Añadir 3 ml de medio de crecimiento y contar el número de células utilizando un contador de células.
15. células de la placa en consecuencia en el poli-D-lisina (PDL) placas recubiertas para tratamientos. Tratar las células 48 h después de sembrar placas recubiertas con inPDL. Esto permite que las células se recuperen de la tensión de la separación.
    NOTA: Check la pureza del cultivo utilizando inmunocitoquímica como se ha descrito previamente ^15.
16. Placa de la fracción negativa (recogido en un tubo de 15 ml), que en su mayoría contiene astrocitos, en matraces T-75 en el medio de crecimiento.
17. Después de al menos 6 h de incubación en 37 ° C incubadora, cambiar el medio y se deja crecer O / N. Dividir los astrocitos al día siguiente para tratamientos.

Resultados

Microglia aislado utilizando el kit de CD11b selección positiva II tienen alta pureza

microglia primarios de ratón se aislaron utilizando el protocolo mencionado anteriormente y se sembraron en cubreobjetos de poli-D-lisina para comprobar la pureza de aislamiento. Diez mil células se sembraron por pocillo y el análisis inmunocitoquímico se realizó usando ionizado molécula adaptadora de unión de calcio-1 (Iba1) como marcador de la...

Discusión

métodos de aislamiento microgliales mayores tienen recuperaciones limitadas que no son apropiados para diversos análisis de proteína por Western blot y análisis de ARN mediante qRT-PCR. La adherencia diferencial y métodos tripsinización leves son dos enfoques comunes con bajos rendimientos microgliales ^{13, 14, 15.} El enfoque CD11b basado en columnas también tiene una baja recuperación, pero consigue una mayor pureza que la adhe...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
EasySep CD11b Kit de Separación II	StemCell Technologies	18970
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Life Technologies	11330057
Piruvato de sodio	Life Technologies	11360070
MEM Aminoácidos no esenciales (100x)	Life Technologies	11140050
L-Glutamina (100x)	Life Technologies	25030081
EDTA	Fisher Scientific	AM9260G
Suero Fetal Bovino (FBS)	Sigma	13H469
0.25% Tripsina-EDTA	Gibco de Life Technologies	25200
PBS de Dulbecco (DPBS)	Gibco de Life Technologies	14190250