Extracciones secuenciales de sal para el análisis de la cromatina a granel enlace propiedades de cromatina, complejos de modificar

Summary

Extracción de la sal secuencial de las proteínas de la cromatina obligada es una herramienta útil para la determinación de las propiedades de enlace de los complejos grandes. Este método puede ser empleado para evaluar la función de individuales subunidades o dominios en la total afinidad de una proteína compleja a la cromatina.

Abstract

Elucidación de las propiedades de enlace de las proteínas dirigida a la cromatina puede ser muy difícil debido a la complejidad de la cromatina y la naturaleza heterogénea de los mamíferos más complejos modificadores de la cromatina. Para superar estos obstáculos, hemos adaptado un análisis de extracción secuencial de la sal (SSE) para la evaluación de las afinidades de unión relativa de complejos enlazados a la cromatina. Este análisis fácil y sencillo pueden utilizarse por usuarios no expertos para evaluar la diferencia relativa en atar afinidad de dos complejos relacionados con los cambios en la afinidad de un complejo cuando una subunidad se pierde o se inactiva un dominio individual y el cambio en afinidad de unión después de alteraciones en el paisaje de la cromatina. Suspendiendo secuencialmente a la cromatina a granel en cantidades crecientes de sal, que son capaces de Perfil de la elución de una proteína particular de cromatina. Con estos perfiles, que son capaces de determinar cómo alteraciones en un conjunto de modificadores de la cromatina o alteraciones en el entorno de cromatina afectan las interacciones de los Unión. SSE de acoplamiento con otros ensayos in vitro e in vivo , podemos determinar las funciones de dominios individuales y proteínas en la funcionalidad de un complejo en una variedad de entornos de cromatina.

Introduction

Regulación de ADN en las células eucariotas es un sistema complejo y sofisticado que está firmemente controlado por una variedad de proteínas que coordinan las respuestas a estímulos intracelulares y extracelulares. ADN se envuelve alrededor de histona octamers a nucleosomas forma, que pueden ser libremente distribuidos a lo largo del ADN o compactados en bobinas apretados¹. Este arreglo estructural del ADN y las histonas se conoce como cromatina, que es reglamentada por una red de proteínas que leer, escribir y borrar post traslacional modificaciones (PTM) en histonas². Algunas histonas MPa, como acetilación, cambiar la carga del aminoácido se depositan, alterando las interacciones entre las histonas y ADN². PTMs histonas también sirven para contratar los reguladores transcripcionales, remodeladores de la cromatina, maquinaria de reparación del daño de ADN y maquinaria de replicación del ADN en regiones específicas del genoma³.

Mayoría de los métodos para el estudio de las interacciones de la cromatina o sonda interacciones a pequeña escala o implica grandes análisis de genoma. Estudios de Unión in vitro a menudo utilizan dominios recombinantes individuales con péptidos histona o DNA en ensayos como análisis de cambio de movilidad de electroforesis (EMSA), calorimetría isotérmica de titulación, polarización de fluorescencia y jalones de péptido. Porque estos análisis suelen centran en un dominio de proteínas individuales, facilitar la comprensión de una pequeña pieza del rompecabezas, pero no nos permiten comprender la naturaleza cooperativa del multi-dominio proteínas, por no hablar de su papel en múltiples proteínas complejos. Se añade otra capa de complejidad de la composición heterogénea de los mamíferos más complejos modificadores de la cromatina. Esta heterogeneidad de proteína, en combinación con el carácter dinámico del paisaje de la cromatina, es difícil para recapitular el en vivo vinculantes las interacciones de las proteínas de la cromatina de cromatina in vitro.

Métodos in vivo han hecho avances significativos; sin embargo, son a menudo costoso, desperdiciador de tiempo y un desafío técnico. Inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación (ChIP-seq) es muy útil para determinar la localización de proteínas y modificaciones de las histonas en el genoma, sin embargo requiere optimización considerable⁴. Las proteínas son a menudo reticulado a cromatina para preservar las interacciones; sin embargo, esto puede producir interacciones artificiales y puede causar del epítopo enmascarar⁵. Además, el immunoprecipitations (IP) requieren anticuerpos altamente específicos y extensa optimización de corte de DNA y condiciones IP por ChIP-qPCR utilizando un sitio de Unión conocido, que a menudo no es disponible a priori. Después de la optimización de las condiciones de la viruta, procesamiento de las muestras es costoso y requiere de varias semanas a meses secuenciar y analizar. Aunque este método es muy valioso para identificar la localización de la cromatina enlazado a proteínas en el genoma, el costo y compromiso de tiempo que sea prohibitivo para utilizar este método para generar hipótesis acerca de cómo pequeños cambios pueden afectar propiedades de enlace global .

En este papel, describimos cómo se puede utilizar un análisis de extracción secuencial de la sal (SSE) para examinar los perfiles de enlace mundial de proteínas de la cromatina-limite y distinguir cómo cambios en un perfil PTM proteínas, complejo o global pueden alterar las interacciones. Aunque la extracción de sal es una técnica común y ampliamente utilizada, demostramos cómo este método secuencial es altamente reproducible y versátil. SSE nos permite caracterizar cómo una sola subunidad de un complejo o incluso un único dominio contribuye a afinidad general del complejo de la cromatina a granel. SSE puede utilizarse también para determinar si la Unión de una proteína está influenciada por cambios en el paisaje de la cromatina, proporciona hipótesis interesantes para histonas marca apuntar que pueden confirmarse mediante ChIP-seq y otros estudios de genoma amplio.

Originalmente adaptado este método de Wu et al., para examinar la función de Polybromo1 (PBRM1) en la Unión de la cromatina PBAF remodelador^6,7. Usando esta técnica, determinó el papel de PBRM1 para el atascamiento de la cromatina dentro de la cromatina PBAF remodelación complejo y determina la contribución relativa de los seis bromodomains individuales a esta función⁷.

Aquí describimos cómo optimizar este método para explorar el atascamiento de la cromatina en diferentes tipos celulares, para evaluar la afinidad relativa de la cromatina similar modificando complejos, para examinar el desplazamiento de una proteína de la cromatina de un inhibidor químico, y para determinar los efectos de la Unión de la cromatina tras alteraciones en el paisaje de la cromatina.

Protocol

1. preparaciones

1. preparar 100 mL de solución hipotónica tampón A: 0.3m sacarosa, 60 mM KCl, 60 mM Tris, pH 8.0, EDTA, de 2 mM y 0,5% NP-40. Almacenar a 4 º c.
   Nota: Algunas líneas celulares, tales como HEK293T, requieren condiciones menos estrictas de lisis. Si los núcleos se Lisan fácilmente, usar pH HEPES Buffer modificado A: 25 mM 7.6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl ₂, EDTA 0,05 mM, 0.1% NP-40 y 10% glicerol.
2. Preparar una solución stock de 250 mL de solución x mRIPA 2: 100 mM Tris, pH 8.0, desoxicolato del sodio 2% NP-40 y el 0,5%.
3. Prepare una solución de 5 M NaCl 100 mL.
4. La x mRIPA y soluciones de NaCl de 5 M, 2 preparar 50 mL de solución de x mRIPA 1 para cada uno de las seis concentraciones de la sal: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM y 500 mM de NaCl. Antes de comenzar el experimento, enfriar todas las soluciones en hielo.
5. Crecer células bajo condiciones deseadas.
   Nota: Al determinar los efectos de derribar una proteína, SSE para la línea de precipitación debe ser comparado con las células de tipo salvaje. Estas SSE debe realizarse al lado del otro. Ejemplos de uso de inhibidores químicos o estímulos, consulte las secciones 3-5.

2. Extracción secuencial básica de la sal

1. cosecha de 8 millones de células de cada Estado y lavar dos veces con 5 mL de PBS frío hielo.
   Nota: Es crítico contar con igual número de las células a concentraciones de proteína equivalente. El número exacto de células deben optimizarse para las líneas individuales de la célula o proteínas particulares. Es importante no tener demasiados, ya que el aumento de las concentraciones de proteína impedirá la observación de la curva de elución, que depende de la Unión de equilibrio. Sin embargo, con demasiado pocas células puede no haber suficiente proteína para detectar la curva, y la pelotilla de la cromatina es más difícil de aislar y se puede perder entre fracciones de.
2. Resuspenda las células en 1 mL de tampón A + inhibidores de la proteasa, transferir a tubos de micro centrífuga de 1,5 mL y parte superior gira sobre la parte inferior a 4 º c durante 10 minutos
3. Aislar los núcleos por centrifugación a 6000 x g durante 5 min a 4 º c.
   Nota: Después de este paso el sobre nuclear debe estar intacto. Si la envoltura nuclear está intacta, el sedimento se resuspender completamente; sin embargo, cuando la envoltura es lisada y la cromatina se libera, la pelotilla no se vuelva a suspender. Si la envoltura nuclear no está intacta después de la incubación de tampón A, utilizar A. Buffer modificado
4. Añadir 200 μL de mRIPA 0 mM NaCl + proteasa inhibidores a cada pellet de núcleos antes de volver a suspender el pellet. Homogeneizar cada muestra por 15 veces el pipeteo con una pipeta de 1 mL. El diábolo debe resuspender fácilmente, sin embargo, los núcleos se Lisan y se pipetea la muestra será espesa y pegajosa y difícil de pipetear.
   1. Con el fin de elaborar de la pelotilla en la punta, golpee suavemente el extremo de la punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo de centrífuga. El pellet no se disolverá completamente una vez que el ADN es liberado de los núcleos, pero pipeteando lo romperá arriba
5. Cuando todas las muestras han sido homogeneizadas, Incube todas las muestras en hielo durante 3 min
   Nota: El tiempo de incubación deba ser optimizada según la proteína de interés.
6. Pellets de cromatina aislado por centrifugación de las muestras por 3 min a 6500 x g a 4 º c.
7. Transferencia de sobrenadante a una centrífuga de 1,5 mL limpia el tubo. Se trata de la fracción de 0 mM. Esta solución de mRIPA 0 mM puede actuar como un paso de lavado para lisis los núcleos y quitar cualquier sueltas proteínas no asociadas a cromatina.
8. Añadir 200 μL de mRIPA 100 mM NaCl + proteasa inhibidores a cada pellet de cromatina antes de volver a suspender el pellet. Romper la pastilla de cromatina mediante pipeteo el diábolo hacia arriba y abajo 15 veces.
   Nota: Es fundamental para estar acorde con el número de veces el sedimento en pipeta.
9. Incubar en hielo por 3 minutos. Este paso de incubación permite que todas las muestras para llegar a un estado de equilibrio, que es particularmente importante cuando hay múltiples muestras.
10. Centrifugar a 6500 x g durante 3 min a 4 º c y transferir sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 mL.
11. Repetir 2.6 2.10 para las restantes concentraciones de sal.
    Nota: Después de 400 mM NaCl, mRIPA el pellet debe ser claro y gloopy y no se queda en la parte inferior del tubo. El pellet puede ser colocado en la tapa del tubo de la centrífuga mientras el sobrenadante aislado.
12. Añadir 70 μl de 4 x carga de proteína colorante a cada fracción y carga 30 μl de cada fracción en un gel de acrilamida SDS para la mancha blanca /negra occidental análisis.
    Nota: Para determinar el perfil de unión de la proteína, es esencial cargar volúmenes equivalentes de las concentraciones de proteína igual lisado, en lugar de carga de.
13. Una mancha blanca /negra occidental estándar mediante la transferencia a una membrana y anticuerpos primarios para las proteínas de interés.
14. Para cuantificar la proteína eluida de la cromatina, incubar el blot en secundarios anticuerpos de fluorescencia infrarroja IRDye y mancha blanca /negra en la imagen con un reproductor de imágenes. Aunque pueden utilizarse otros métodos de desarrollo, se recomienda la fluorescencia o la proyección de imagen infrarroja, ya que es más cuantitativa de la naturaleza.
15. Uso ImageJ o software similar para calcular la intensidad para la proteína eluida a cada concentración de la sal. Graficando la intensidad de la banda contra la concentración de sal, se puede determinar el patrón de elución de la proteína de interés.

3. Extracción secuencial de la sal en presencia de un " lector de " inhibidor de la

1. cosecha dos conjuntos de células (4 millones) y aislar a los núcleos como en un estándar SSE.
2. Vuelva a suspender ambos conjuntos en 200 μL de mRIPA 0 mM NaCl e incubar durante 3 minutos. Esto permitirá la eliminación de cualquier proteína libre en el núcleo.
3. Agregar 200 μL mRIPA 0 mM NaCl a cada pellet. Añadir el inhibidor (2 μl de 1 mM (+) JQ1) a una muestra y DMSO para el conjunto de controles.
4. Agite el sedimento pipeteado por 15 veces e incubar en hielo por 5 min
5. Centrifugar a 6500 x g durante 3 min a 4 º c y transferir sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 mL.
6. 3.3-4 para todas las concentraciones de sal y realizar un estándar inmunoblot.

4. Extracción secuencial de la sal en presencia de un " escritor " inhibidor de la

1. tratar las células con el inhibidor (10 μm SAHA) o DMSO para 3 h.
2. Cosecha de 4 millones de células para cada tratamiento.
3. Realizar una SSE estándar para las muestras con el inhibidor añadido a todos los buffers de.

5. Secuencial sal extracción siguientes daños en el ADN

1. tratar las células con 1 doxorrubicina μm por 1 h.
2. Cambiar los medios de comunicación en las células y permitirles recuperar para 3 h.
3. Cosecha de 8 millones de células y realizar la básica SSE.

6. Extracción de la sal no-secuencial

1. cosecha de 12 millones de células y lavar con PBS.
2. División de las células por lo que hay 2 millones de células por el tubo de centrífuga micro.
3. Vuelva a suspender en 500 μl de tampón A e incube por 10 min.
4. Aislar los núcleos por centrifugación a 6000 x g.
5. Vuelva a suspender las pelotillas en una 200 μL de cada uno de los búferes mRIPA + NaCl.
6. Homogeneizar cada muestra por 15 veces el pipeteo con una pipeta de 1 mL.
7. Incubar en hielo durante 3 min.
8. Aislar la cromatina por centrifugación a 6500 x g y transferir el sobrenadante para limpiar tubos. Añadir 70 μl de colorante de carga y ejecutar 30 μL en un gel de SDS-page para la mancha blanca /negra occidental análisis.

Results

En este papel demostramos las ventajas y aplicaciones del método de extracción secuencial utilizado de la sal (SSE) que hemos adaptado de la literatura⁶. En la figura 1, se compara la reproducibilidad de SSE para extraer proteínas no secuencialmente mediante la detección de los patrones de elución de ARID1a y PBRM1. Constantemente observamos que ARID1a, una subunidad BAF, elutes principalmente a 200 mM NaCl y PBRM1, una subunidad PBAF ...

Discussion

Caracterización de las interacciones proteína y cromatina mediante extracciones de sal es un método común que ha sido empleado durante décadas^14,15; sin embargo, se ha no sido sistemáticamente optimizado antes de revelar su completa utilidad. Demostramos cómo este método secuencial proporciona una manera rápida y barata de distinguir cambios en el atascamiento de la cromatina cuando se altera la proteína o el medio ambiente. SSE es altamente adaptable y optimizab...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro de sodio, cristal 2,5 kg AR (ACS)	Avantor/Macron	7581-06
sacarosa, cristal 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	8360-04
Cloruro de potasio, granulado 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	6858-04
Trizma(R) base, patrón primario y tampón, >=99,9% (valoración), cristalino	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
Ácido tetraacético EDTA (etilenedinitrilo), sal disódica, dihidrato 125 G AR (ACS)Avantor	/Macron	4931-02
SUSTRATO NONIDET P-40, 100mL UN3082	Amresco	E109-100ML
Tampón HEPES Solución (1M)	Gibco	15630-080
Cloruro de magnesio, 6-hidrato, cristal 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	5958-04
GLICEROL, 1L	Amresco	0854-1L
SAL SÓDICA DE ÁCIDO DESOXICÓLICO, 100g	Amresco	0613-100G
Pipeta Eppendorf Research plus	Fisher Scientific	13-690-032
Eppendorf 5424 R microcentrífuga refrigerada	Eppendorf	5424 R
Ratón secundario IgG HRP	Señalización celular	7076
IgG secundaria de conejo Señalización celular ligada a HRP		7074
Anticuerpo BMI-1	Millipore
Anticuerpo PBRM1	Betilo	A301-591A
Anticuerpo ARID1a	Santa Cruz	sc-32761
Anticuerpo BRD4	Bethyl	A301-9852a
(+) JQ1	Cayman Chemical Company	11187
SAHA	Cayman Chemical Company	10009929
Doxorrubicina	AK Scientific	25316-40-9
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Macron	4948-02
Mini Célula Trans-Blot BioRad		1703930
Mini Tanque de Gel	ThermoFisher	A25977
Albúmina bovina (BSA)	Amresco	0332-100g	Utilizado como solución al 5% en PBS-T como solución de bloqueo para Western blots
Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	B0001
Bolt LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus Escalera de proteínas prestained, 10 a 250 kDa	ThermoFisher	26619
Metilo Alcohol, Anhidro	Macron	3041-10
Tripsina kEDTA, 1X	Cellgro	25-053-CI
AZIDA SÓDICA, 250g UN1687	Amresco	0639-250G
DODECIL SULFATO DE SODIO (SDS)500g UN1325	Amresco	0227-500G
Glicina, para electroforesis, >=99%	Sigma-Aldrich	G8898-1kg
BigTop Tubos de microcentrífuga, polipropileno	VWR	20170-333
1000 y micro; L Puntas de pipeta	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris Geles prefabricados 4-12%	Invitrogen	NW04125BOX
Hemisulfato de leupeptina, 5 MG	RPI Research Products	22035-0.005	Utilizado para solución de inhibidor de proteasa.
APROTININA, 10 MG	RPI Productos de investigación	20550-0.01	Utilizado para la solución inhibidora de la proteasa.
PEPSTATIN A, 5 MG	RPI Research Products	30100-0.005	Se utiliza para la solución de inhibidores de la proteasa.
OVCA429 células	Regalo de Karen Cowden Dahl. Ph.D.
HEK293T	ATCC	CRL-3216
Celdas HeLa	ATCC	CCL-2
Medios 5A de McCoy	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
Medio Esencial Mínimo (MEM), Polvo	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA (100X) aminoácido no esencial	Gibco	11140-050
FB-11: Suero fetal bovino, fuente estadounidense	Omega Scientific	FB-11
Solución de penicilina-estreptomicina	Life Technologies	15140-122
Glutamax	Life Technologies	35050-061
piruvato de sodio	Life Technologies	11360070
VWR Power Fuente	: VWR	13-690-032