Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Matan Geron; Adina Hazan; Avi Priel

doi:10.3791/55370

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

9.2K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/55370

⸱

17 de febrero de 2017

Matan Geron^*¹ , Adina Hazan^*¹ , Avi Priel¹

¹The Institute for Drug Research (IDR), School of Pharmacy, Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalem (HUJI)

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Resumen

La transfección, la entrega de ácidos nucleicos extraño en una célula, es una herramienta poderosa en la investigación de proteínas. A través de este método, los canales iónicos pueden ser investigados por medio del análisis electrofisiológico, caracterización bioquímica, los estudios mutacionales, y sus efectos sobre los procesos celulares. Las transfecciones transitorias ofrecen un protocolo simple en el que la proteína se convierte en disponible para el análisis dentro de unas pocas horas a días. Aunque este método presenta un protocolo eficiente relativamente sencillo y el tiempo, uno de los componentes críticos es calibrar la expresión del gen de interés a niveles fisiológicos relevantes o niveles que son adecuados para el análisis. Con este fin, han surgido muchos enfoques diferentes que ofrecen la capacidad de controlar la expresión del gen de interés. Varios protocolos de transfección de células estables proporcionan una manera de introducir de forma permanente un gen de interés en el genoma celular bajo la regulación de una trascripción controlado por tetraciclinala activación cional. Si bien esta técnica produce niveles de expresión fiables, cada gen de interés requiere de algunas semanas de trabajo cualificado incluyendo la calibración de una curva de muerte, selección de colonias de células, y en general más recursos. Aquí se presenta un protocolo que utiliza la transfección transitoria del gen 1 canal catiónico miembro potencial subfamilia V Transient Receptor (TRPV1) en un sistema inducible como un medio eficaz para expresar una proteína de una manera controlada que es esencial en el análisis del canal iónico. Se demuestra que el uso de esta técnica, que son capaces de realizar las imágenes de calcio, células enteras, y el análisis de un solo canal con niveles de los canales controlados requeridos para cada tipo de recolección de datos con una única transfección. En general, esto proporciona una técnica replicable que puede ser usado para estudiar la estructura y la función de los canales iónicos.

Introducción

Heteróloga expresa sistemas es una de las técnicas más utilizadas para el estudio de una multitud de funciones celulares ^1. Su perfil bajo proteína endógena, los requisitos mínimos de mantenimiento, el crecimiento fiable, y la capacidad de captar y expresar ADN foráneo han hecho líneas celulares tales como embrionarias de riñón humano (HEK293) y de ovario de hámster chino (CHO) casi imprescindible para la investigación biológica ^{^2,} ^3. Las áreas de investigación incluyen el uso de sistemas heterólogos proteínas de membrana, la señalización intracelular y la actividad enzimática. Después....