El modelado del desarrollo del cerebro humano se ha visto obstaculizado debido a la complejidad sin precedentes del tejido epitelial neural. Aquí, se describe un método para la generación robusta de organoides cerebrales para delinear eventos tempranos del desarrollo del cerebro humano y para modelar la microcefalia in vitro.
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Artículo de método
Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano
En este artículo
Resumen
Resumen
La disponibilidad restringida de modelos in vitro adecuados que puedan representar de manera confiable el desarrollo complejo del cerebro humano es un cuello de botella significativo que limita la traducción de la investigación básica del cerebro a la aplicación clínica. Si bien las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han reemplazado a las células madre embrionarias humanas éticamente cuestionables, los estudios de diferenciación neuronal basados en iPSC siguen siendo descriptivos a nivel celular, pero no proporcionan adecuadamente los detalles que podrían derivarse de un tejido cerebral humano complejo en 3D.
Este vacío ahora se llena mediante la aplicación de organoides cerebrales 3D derivados de iPSC, "Cerebros en un plato", que modelan muchas características del complejo desarrollo del cerebro humano. Aquí, se describe un método para generar organoides cerebrales 3D derivados de iPSC. Los organoides pueden ayudar a modelar la microcefalia primaria autosómica recesiva (MCPH), un raro trastorno del neurodesarrollo humano. Una explicación ampliamente aceptada para la malformación cerebral en la MCPH es un agotamiento de la reserva de células madre neurales durante las primeras etapas del desarrollo del cerebro humano, un defecto del desarrollo que es difícil de recrear o probar in vitro.
Para estudiar la MCPH, generamos iPSCs a partir de fibroblastos derivados de pacientes portadores de una mutación en la proteína centrosomal CPAP. Mediante el análisis de la zona ventricular de los organoides cerebrales 3D de microcefalia, demostramos la diferenciación prematura de los progenitores neuronales. Estos organoides cerebrales 3D son un poderoso sistema in vitro que será fundamental para modelar trastornos cerebrales congénitos inducidos por productos químicos neurotóxicos, infecciones virales neurotróficas o mutaciones genéticas heredadas.
Introducción
trastornos del neurodesarrollo humanos, como microcefalia, sólo pueden ser poco estudiados en modelos animales debido al hecho de que los cerebros humanos tienen una superficie cortical extendida, una característica única que difiere de los animales no humanos.
Este aspecto hace que el desarrollo del cerebro humano un proceso complejo que no puede ser suficientemente estudiada en un 2D, en el sistema de cultivo celular in vitro. Emergentes técnicas de cultivo 3D permiten la generación de organoides similar a un tejido a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). La diferenciación in vitro de célula....
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Protocolo
1. Generación de cerebro organoides (23 días)
- Iniciación de neuroectodermo (5 días)
NOTA: Los siguientes puntos deben ser considerados antes del comienzo de la diferenciación. El método de reprogramación (etc. lentiviral-, basado en microRNA sendai-a virus, episomas, o) para obtener iPSCs humanos idealmente debería ser la misma para todos los pacientes y controlar las líneas de IPSC. Varios kits de reprogramación y las instrucciones en base a protocolos publicados están disponibles 15, 16, 17, 18.....
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Resultados
La generación de organoides cerebrales requiere al menos tres semanas de cultivo continuo (Figura 1A). Para lograr resultados reproducibles, se recomienda que el investigador documenta cada paso y, sobre todo, evita cualquier alteración con respecto a los componentes del medio, los puntos de tiempo, y la manipulación de células. A continuación, damos un resumen de cómo evaluar si se alcanzan los hitos críticos con el fin de obtener organoides de calidad suficiente al fin.......
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Discusión
MCPH es un trastorno del desarrollo neurológico humano complejo que no puede ser recapitulado en modelos animales in vivo o in sencilla cultivo de células humanas se acerca in vitro. La manifestación clínica de MCPH comienza a aparecer durante el primer trimestre, cuando comienza temprano neurogénesis. Por lo tanto, organoides cerebrales 3D representan un sistema experimental fiable para modelar el desarrollo MCPH. Además, 3D organoides cerebro humano son un enfoque ideal ya que i) que permiten la adap.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Estamos muy agradecidos a la instalación de la incrustación de tejidos y la facilidad de la base del microscopio de CMMC. Estamos muy agradecidos por las discusiones y soporte técnico proporcionados por los miembros del Laboratorio de Biología del centrosoma y el citoesqueleto. Agradecemos a Li Ming Gooi para la corrección del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anti-ratón 488 | Invitrogen | A-11001 | Anticuerpo secundario anti-ratón IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 488 |
| Anti-conejo 647 | Invitrogen | A-21245 | Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B anticuerpo policlonal de conejo |
| Sistema CELLSPIN | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, EE. UU | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato; múltiples proveedores |
| DMEM/F-12 | Gibco, EE. UU | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mezcla de nutrientes F-12 |
| Dorsomorfina | Sigma-Aldrich, EE. UU | P5499 | Compuesto C; múltiples proveedores |
| Medio de inclusión | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; medio de incrustación; múltiples proveedores |
| Matriz Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Corning | 354277 | Matrigel Matriz calificada para hESC; importante: Gelatina de pescado calificada para hESC | |
| ; | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatina de piel de pescado de agua fría; múltiples proveedores; autoclave después de agregar a PBS para disolver y esterilizar, almacenar a 4 & grados; C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine para biología molecular; múltiples proveedores |
| Asa de inoculación con aguja, desechable (1 y micro; L) | Sigma Aldrich, EE. UU | BR452201-1000EA múltiples | proveedores |
| Insulina | Sigma-Aldrich, EE. UU. | I3536-100MG | múltiples proveedores |
| L-glutamina | Gibco, EE. UU. | 25030081 | L-glutamina (200 mM) |
| Medio A | Tecnologías de células madre | #05850 | mTeSR1 (medio hiPSC) |
| Medio B | Tecnologías de células madre | #05835 | Medio de inducción neural (NIM); medio de diferenciación neuronal |
| Medio C | Gibco, EE. UU. | 21103049 | Medio basal neural |
| MEM | Gibco, EE. UU. | 11140035 | Solución de aminoácidos no esenciales MEM (100x) |
| Kit de detección de micoplasma MycoAlert | Lonza, Suiza | #LT07-218 | Kit de detección de micoplasma; múltiples proveedores |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Anticuerpo monoclonal de ratón Nestin (4D11) |
| Paraformaldehído (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% en PBS, solución de almacenamiento a -20 ° C; PRECAUCIÓN: Use protección para la piel y los ojos y trabaje debajo del capó |
| PBS tabletas | Gibco, EE. UU | 18912014 | Ver fabricante&agudo; s instrucciones; múltiples proveedores |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco, EE. UU. | 15140122 | Múltiples proveedores |
| Solución de poli-L-lisina (PLL) | Sigma-Aldrich, EE. UU | P8920-100ML | Múltiples proveedores |
| pVim | MBL | D076-3S | Fosfo-Vimentina (Ser55) |
| Reactivo de AcM A | Tecnologías de células madre | # 05872 | Nota al Protocolo 1.1.1.2; ReLSR (reactivo de selección y paso de células ES e iPS humanas libres de enzimas); Por favor, siga a Manufactorer´ S protocolo; productos alternativos de varios proveedores disponibles |
| Reactivo B | Sigma-Aldrich, EE. UU. | A6964-100ML | La solución Accutase es una solución enzimática para la disociación de una sola célula; múltiples proveedores; protocolo 1.1.2 "solución de disociación enzimática de células" |
| Criostato de investigación Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Múltiples proveedores |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Múltiples proveedores |
| Matraz giratorio 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sacarosa | AppliChem | A4734, 1000 | Múltiples proveedores |
| Portaobjetos de microscopio Superfrost ultra plus | Thermo scientific, EE. UU. | J3800AMNZ | Los portaobjetos deben estar etiquetados con un "+" y cargados positivamente |
| Suplemento 1 | Gibco, US | 17502048 | Suplemento N-2 (100x) |
| Suplemento 2 sin vitamina A | Gibco, US | 12587010 | B-27 suplemento (50x), menos vitamina A; múltiples proveedores |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Múltiples proveedores |
| Compuesto Tissue-Tek O.C.T. | Sakura, NL | 4583 | Múltiples proveedores |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Múltiples proveedores |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulina III (policlonal de conejo) |
| Ensayo TUNEL | Promega, US | G3250 | DeadEnd Sistema fluorométrico TUNEL; múltiples proveedores |
| Tween 20 para biología molecular | AppliChem | A4974,0500 | Lámina impermeable de múltiples proveedores |
| BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm " M”; múltiples proveedores | |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibidor (Y-27632 2HCL); múltiples proveedores |
| β-mercaptoetanol | Gibco, EE. UU. | 31350010 2-mercaptoetanol (50 mM); múltiples proveedores |
Referencias
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Na....
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Reimpresiones y permisos
