Artículo de método

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

DOI:

10.3791/55381

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7 de septiembre de 2017

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1Center for Translational Medicine Research and Development, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2Department of Orthopedic Surgery, Maastricht UMC+, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital RWTH, 4Research Laboratory for Biomedical Optics and Molecular Imaging, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar la formación de vasos sanguíneos en vivo y en tiempo real en 3D andamios por microscopía multifotón. Angiogénesis en andamios modificados genéticamente fue estudiada en un modelo de defecto murino hueso calvarial de crítica. Más nuevos vasos sanguíneos fueron detectados en el grupo de tratamiento que en los controles.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La reconstrucción de defectos óseos de tamaño crítico sigue siendo un grave problema clínico debido a la pobre angiogénesis dentro tejido-dirigida andamios durante la reparación, que da lugar a una falta de suficiente riego sanguíneo y provoca la necrosis de los tejidos nuevos. Rápida vascularización es un requisito vital para la supervivencia de tejidos nuevos e integración con el existente tejido anfitrión. La generación de novo de vasculatura en andamios es uno de los pasos más importantes en la fabricación más eficiente, lo que permite reparar el tejido que crece en un andamio de la regeneración ósea. Para abordar este problema, la modificación genética de un andamio de biomaterial se utiliza para acelerar la angiogénesis y osteogénesis. Sin embargo, visualización y seguimiento en vivo formación de vasos sanguíneos en tiempo real y en tres dimensiones (3D) andamios o nuevo tejido óseo sigue siendo un obstáculo para la ingeniería de tejido óseo. Microscopía multifotón (MPM) es una modalidad de proyección de imagen de bio novela que puede adquirir datos volumétricos de estructuras biológicas de forma mínimamente invasiva y alta resolución. El objetivo de este estudio fue visualizar la angiogénesis con microscopía multifotón en vivo en un andamio de 3D-PLGA/nHAp genéticamente modificado para la reparación del defecto hueso calvarial crítica. Andamios PLGA/nHAp fueron funcionalizados para la entrega sostenida de un gen de factor de crecimiento pdgf-b con vectores lentivirales (LV -pdgfb) para facilitar la angiogénesis y a mejorar la regeneración ósea. En un hueso calvarial de crítico implantado andamio defecto modelo de ratón, las áreas de vasos sanguíneos (BVAs) en PHp andamios fueron significativamente mayores que en PH andamios. Además, la expresión de pdgf-b y genes relacionados con la angiogénesis, vWF y VEGFR2, aumentado correspondientemente. MicroCT análisis indicó que la nueva formación de hueso en el grupo de PHp mejorada dramáticamente en comparación con los otros grupos. A nuestro conocimiento, esta es la primera vez microscopía multifotón fue utilizado en ingeniería del tejido fino del hueso para investigar la angiogénesis en un andamio biodegradable 3D en vivo y en tiempo real.

Introducción

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El hueso es un tejido altamente vascularizado que continúa para remodelar durante la vida de un individuo1. La regeneración ósea rápida y eficaz de los defectos de hueso grande como resultado de trauma, no sindical, resecciones tumorales o malformaciones craneofaciales es un proceso fisiológico complejo. Enfoques terapéuticos tradicionales utilizados para la reparación del defecto óseo incluyen implantación de autoinjerto y aloinjerto, pero su uso implica varios problemas y limitaciones, tales como la disponibilidad limitada, morbosidad del sitio donante importante, un alto riesgo de infección, y la sede de rechazo inmune2,3. Sin embargo, injertos óseos artificiales ofrecen una alternativa eficiente para paliar estas limitaciones. Pueden ser hechos de materiales biodegradables, son fáciles de fabricar con un tamaño de poro adecuado y pueden ser modificados genéticamente4,5.

En la actualidad, se han empleado varios andamios de ingeniería de tejidos en el desarrollo de la ingeniería de tejido óseo6,7. Para inducir la regeneración y reparación óseas más eficazmente, Biomateriales Ingeniería combinadas con factores de crecimiento han surgido y logra buenos resultados8,9. Por desgracia, la vida media corta, fácil perder actividad y dosis supraphysiological de factores de crecimiento para la eficacia terapéutica limitan su uso clínico10. Para superar estos problemas, la entrega de genes del factor de crecimiento en lugar de factores de crecimiento se ha demostrado como un enfoque eficaz para mantener la actividad biológica para el tratamiento de defectos oseos y enfermedades11,12. Vectores virales son prometedor entrega herramientas para la regeneración de los tejidos debido a su alta expresando eficiencia13.

Entre los factores de crecimiento, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) fue seleccionado en este estudio porque es un mitógeno y chemoattractant para las células mesenquimales y osteogénicos, sino un estimulante de la angiogénesis14,15 . Anteriores estudios clínicos y preclínicos demostraron que PDGF-BB podría con seguridad y efectivamente promover la reparación ósea en defectos oseos periodontales16,17. Estudios recientes revelaron que el PDGF-BB estimula angiogénesis por motivar la célula endotelial proliferación y la migración en vivo18,19. Además, PDGF-BB puede también hacer que las células madre mesenquimales (MSCs) capaces de diferenciarse en células endoteliales20y este destaca más el papel potencial de MSCs en neovascularización. Por lo tanto, inducir la formación de novo de vasculatura en andamios con PDGF-BB es un paso importante para la reparación de tejido crecido en andamios en ingeniería del tejido fino del hueso.

Defecto de hueso curativo es un proceso morfogenético de tejido dinámico que requiere osteogénesis coordinada y angiogénesis en la reparación de posiciones21. Neoangiogénesis en andamios de ingeniería de tejido implantados es un requisito previo esencial para el suministro de células con nutrientes y oxígeno para el crecimiento y la supervivencia y para la eliminación de desechos metabólicos. Utilizan métodos de la proyección de imagen, incluyendo rayos x micro-computarizada tomografía (microCT), la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), microscopía electrónica (SEM), tomografía de coherencia óptica (OCT) y el láser confocal de la microscopia, la exploración se aplican en lugar de examinación histológica para obtener angiogénesis información22,23. Sin embargo, estos métodos enfrentan a diversos obstáculos en la visualización y medición occidentalización en andamios 3D en ingeniería del tejido fino del hueso. Microscopía multifotón (MPM) es una técnica de bio-proyección de imagen relativamente nueva que tiene la clara ventaja de simultáneamente visualizar células, matriz extracelular y redes vasculares en vivo. Posee una capacidad inherente de proyección de imagen tridimensional para la penetración de tejido profundo y provoca fotodaño baja. Por lo tanto, en la última década, el MPM ha ganado mucha atención en estudios biomédicos24, incluyendo en neurociencias, la inmunología y la dinámica de la célula de vástago. Sin embargo, apenas se utiliza en la investigación ortopédica.

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Protocolo

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el cuidado de los animales fue en cumplimiento de la guía para el cuidado y uso de laboratorio animales de la provincia de Guangdong. Todos los procedimientos fueron realizados bajo la supervisión y aprobación del Comité de ética para la investigación Animal, institutos de avanzada tecnología de Shenzhen, de la Academia China de Ciencias.

1. lentivirales (LV) producción

  1. clon de cDNA de pdgf-b en un vector de expresión lentivirales (pLenti6/5-eGFP o LV-eGFP) en un múltiple encargo-clonación sitio aguas abajo del promotor de citomegalovirus con Spe I y Sal I sitios de restricción para construir el plásmido pLenti6/5-PDGFB-eGFP (LV - pdgfb) 25.
  2. Producir partículas lentivirales (LV - pdgfb) de las células HEK - 293 pies por transferencia junto con los plásmidos de empaquetado de virus (pLP1 pLP2 y pVSV G) utilizando el método estándar de fosfato de calcio con cloroquina (concentración final: 25 μm) 25.
  3. después de 48 h de la transfección, la cosecha y filtro de virus que contiene 500 mL sobrenadante con un filtro (0.45 μm). Posteriormente, las partículas virales se concentran por ultracentrifugación a 89.000 x g durante 2 h. resuspender en 200 μL de tampón fosfato solución salina (PBS), alícuota y almacenar a -80 ° C.
  4. Para determinar la concentración de lentivirus, incubar las células HEK293T con lentivirales en serie diluido por 24 h y calcular el título lentivirales, como se describió anteriormente 25.

2. Fabricación de andamios PLGA/nHAp 3D impreso e inmovilización de LV

  1. disolver 20 g de PLGA (poli D, L-lactide-co-glicólido) material en 20 mL de 1, 4-dioxano para formar una solución homogénea. Añadir 2 g de combinar polvo de HAp (nano-hydroxyapatide) (nHAp) a la solución; el EGLP: nHAp ratio debe ser 10:1 (w/w).
  2. Agitar vigorosamente la solución mezclada (revolvimiento de velocidad: 1.500 rpm) a temperatura ambiente durante 16 h con un agitador magnético hasta para formar una pasta uniforme. Fabricar en andamios porosos de PLGA/nHAp utilizando una impresora 3D de baja temperatura con un inyector automatizado que deposita en el fondo de capa por capa, pegar a la tapa, según un modelo prediseñado 26; los tamaños de poro de las matrices de soporte van desde 200 a 400 μm.
  3. Vacío liofilización los andamios durante 48 h para quitar el solvente tan completamente como sea posible. Remoje las matrices de soporte en solución de etanol 75% durante 1 h para la esterilización y liofilizar para conseguir andamios neutros, asépticos.
    Nota: Los parámetros principales para liofilización vacío incluyen la temperatura de condensación (° C) y el grado de vacío (Pa). Bajo un grado de vacío de 45 Pa, los andamios PLGA/nHAp eran vacío liofilizada a-78 ° C por 48 h eliminar completamente el disolvente.
  4. Añadir 10 μl de partículas LV (4.5 x 10 5) a cada PLGA/nHAp andamio (4 x 4 x 2 mm) e incubar los andamios por 2 h a 37 ° C en una incubadora humidificada para permitir la adsorción.
  5. Después de la inmovilización, enjuague los andamios dos veces con PBS para eliminar las partículas de LV. Snap freeze los andamios recubiertos en partículas de LV en nitrógeno líquido, liofilizar otra vez y almacenar a-80 ° C para su uso futuro.

3. In Vitro Cinética de liberación de partículas de LV de andamios y ensayo de actividad de transducción LV

  1. incubar andamios 3D (4 x 4 x 2 mm) con LV-proteína verde fluorescente (LV-eGFP, 4,5 x 10 5 LV partículas) en 1 mL de DMEM completo en criogénico 2,0 mL frascos a 37 º C con agitación durante 5 días.
  2. Se toma una muestra de 1 mL cada 12 h de 12 h a 120 h de incubación post y cambiar el medio. En cada momento, añadir 1 mL de medio fresco en lugar de 1 mL de medio de incubación.
  3. Usar los medios de comunicación recogidos para transducir las células HEK293T por Co incubar durante 48 h. medida el número de partículas bioactivas de LV por determinar el número de GFP-positivas HEK293T células por citometría de flujo 27.
    1. Antes de transducción de las células HEK293T, retire el medio de cultivo y enjuague las células HEK293T dos veces con PBS. Añadir los medios recogidos con lentivirus liberados de los andamios al pozo (1 mL/pocillo) y de la cultura con las células HEK293T durante 48 h a 37 ° C en una incubadora humidificada.

4. In Vitro Evaluación de la médula ósea MSC (CMMo) migración

  1. antes del ensayo de migración, preparar BMSCs expresando la proteína fluorescente de tomate (BMSCs-T) y de proteína (BMSCs-P) de PDGF-BB 28.
  2. Realizar el análisis de la migración de CMMo con un compartimiento de Boyden usando una placa de 24 pozos y filtros de policarbonato con un tamaño de poro de 8 μm.
    1. Lugar 0,5 mL de BMSCs (5 x 10 4) transfected con LV expresan la proteína fluorescente de tomate (BMSCs-T) en las cámaras superiores. Colocar 0,5 mL de BMSCs (2 x 10 5) transfected con LV expresando proteínas PDGF-BB (BMSCs-P) en las cámaras inferiores.
  3. Incluyen seis grupos en este experimento y agregar 500 μl del compartimiento inferior de cada pocillo.
    A. control, medio libre de suero de blanco sólo
    control B. FBS, medio suplementado con 10% FBS
    control C. PDGF-BB, PDGF-BB de 4 ng/mL en medio libre de suero
    D. PDGF-BB agarrar grupo, PDGF-BB (4 ng/mL) y anticuerpos policlonales anti-PDGF-BB (4 ng/mL) en medio libre de suero
    Grupo CMMo E., 2 x 10 5 BMSCs en medio libre de suero
    Grupo F. BMSCs-P, 2 x 10 5 P BMSCs en medio libre de suero.
  4. Incubar durante 48 h en 5% CO 2 y a 37 ° C en una incubadora humidificada. Luego, eliminar las células migradas en el lado inferior de la cámara y recogerlos para la cuantificación del número de BMSCs-T por citometría de flujo.
    1. Quitar las células migradas en la cámara baja lado usando un raspador celular y resuspender las células migradas con 2 mL de PBS. Cuantificar el número de T-BMSCs migrado por citometría de flujo 29.

5. Establecimiento de un Calvarial crítico hueso defecto modelo murino y trasplante del andamio

Nota: ratones machos BALB/c (7 semanas) fueron compradas de Guangdong médica centro de animales de laboratorio (Guangdong, China).

Experimentan de ratones machos
  1. inscribir un total de 42 para el defecto del hueso calvarial. Los ratones se dividen al azar en tres grupos, con catorce en cada grupo que recibir los siguientes tratamientos: Grupo A, no implantes; Grupo B, PH andamios implantaron (PLGA/nHAp); y grupo C, PHp andamios implantados (nHAp/PLGA/LV-pdgfb).
  2. Anestesiar los animales con la administración intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg). Quitar la piel con Pasta depilatoria y limpiar la piel de la cabeza con una solución de alcohol 75% antes de hacer la primera incisión. Fijar la cabeza de cada ratón con un instrumento estereotáctico para mantenerlo inmóvil durante la cirugía.
  3. Hacer una incisión inicial con bisturí y luego agrandarlo ingenioHS tijeras para crear una incisión en la piel lineal de 1 cm. Raspe el periostio del hueso del cráneo a la superficie del hueso del cráneo usando un hisopo de algodón estéril.
  4. Utilizar una fresa trépano para crear un defecto de tamaño crítico de 4 mm de diámetro en el lado izquierdo de la calvaria 30. Transplante el andamio en el sitio de defecto óseo.
    Nota: Defectos de tamaño crítico (CSD) se definición originalmente como " el tamaño más pequeño intraóseo de la herida en un hueso determinado y especies de animales que no se curan espontáneamente durante la vida del animal. " en este experimento, el defecto de 4 mm de diámetro es un defecto de tamaño crítico hueso, según el estudio previamente 31 , 32.
  5. Utilizar fórceps oftálmicos para retroceder el periostio suavemente para cubrir el sitio quirúrgico. Suturar la piel Incisa con tres puntadas por cm.
  6. Realizar cuidado post-operatorio. Administrar la buprenorfina analgésica (0.1 mg/kg) para aliviar el dolor. Mantener la temperatura del cuerpo con una almohada hasta que el animal se despierta. Posteriormente, alimentar los animales con alimentos y agua y registrar su actividad todos los días hasta el final de la prueba. Nota: Se puede administrar Analgesia antes del procedimiento dependiendo de su cuidado de los animales local Comité directrices.

6. En Vivo Proyección de imagen de angiogénesis en el defecto óseo con MPM

Nota: dextrano de las kD 250 (10 mg/mL) en solución salina, conjugado con FITC se inyectó por vía intravenosa en ratones para obtener alta SNR (signal to noise ratio) imágenes de vasos sanguíneos nuevos según un estudio anterior 33. Tenga en cuenta que se trata de un procedimiento de supervivencia.

  1. montar el sistema de microscopía multifotón (MPM) para imágenes de señal (SHG) de segunda generación armónica y dos fotones fluorescencia emocionada (TPEF).
  2. Anestesiar los animales con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg) e inmovilizar los animales en una placa calefactora para mantener su temperatura corporal a 37 ° C a lo largo de los experimentos. Use 3.0% isoflurano gas en 100% de oxígeno para mantener la analgesia y la anestesia satisfactoria durante el proceso de proyección de imagen. Inyectar por vía intraperitoneal una solución salina (200 μL/animal) para evitar la deshidratación antes de la proyección de imagen.
  3. Tune el láser de femtosegundo Ti zafiro a 860 nm. Crear un área de 512 x 512 μm muestreo mediante la exploración de un par de espejos galvo y usar objetivo de inmersión en agua NA1.0 al haz de excitación focusthe en la muestra y para recoger la señal de retrodispersión TPEF/SHG.
    Nota: La imagen fue realizada en un sistema generador de imágenes microscópico multifotón de construir casa (MPM). Durante la proyección de imagen, un láser de femtosegundo Ti zafiro fue sintonizado a 860 nm como la longitud de onda de excitación óptima. El rayo láser fue trama escaneado a través de un plano de la muestra utilizando un par de espejos del galvanómetro. Después de pasar por un espejo dicroico de 685 nm, la viga se centró en la muestra por un objetivo de 20 X NA1.0. Las señales inducidas de TPEF y SHG fueron recogidas por el mismo objetivo. Las señales se separó de la excitación láser por el espejo dicroico mencionados anteriormente y purificada por un filtro de paso corto de 680 nm. Las señales de TPEF y SHG fueron recogidas por un paquete de la fibra y llevó a cabo un espectrógrafo. El detector en el espectrógrafo fue un arsenal linear de los tubos de fotomultiplicador (PMTs). La combinación del espectrógrafo y PMTs arsenal linear ofrece la capacidad de grabar la señal en bandas espectrales consecutivas 16, de 400 nm a 600 nm, 12,5 nm a intervalos. Por lo tanto, las señales de TPEF y SHG se detecta al mismo tiempo y separadas en dominios espectrales. Además, para imágenes en 3D, un motor axial fue utilizado para controlar la profundidad de la proyección de imagen. El área de cada imagen se estableció en 512 x 512 μm y 2 μm (grupo control, 5 μm) ajustó el intervalo de profundidad. En particular, 5 sitios de cada defecto se reflejada para recoger datos estadísticamente significativos, y los sitios de proyección de imagen seleccionados se distribuyeron aleatoriamente y uniformemente a lo largo del defecto.
  4. 5 analizar sitios en cada defecto para recoger datos estadísticamente significativos para medir la formación de vasos.
    1. Uso exploración sitios aleatoriamente y uniformemente distribuidos a lo largo del defecto. Para el grupo control, tienen el campo de la cubierta (FOV) del área original del hueso y el borde del defecto, pero para los grupos PH y PHp, con el FOV en el andamio implantado.
    2. Hacer una incisión de 1 cm lineal de la piel con un bisturí y suturar la piel abierta a la fijación para revelar el sitio de trasplante. Utilice una jeringa para colocar una gota de agua entre el lente de inmersión y trasplantes para formar un vaso de agua.
  5. Adquirir imagen pilas cada 12 s en un 2 h, periodo de la proyección de imagen. Mostrar y analizar datos volumétricos mediante un programa personalizado de MATLAB y cuantificar las áreas de vasos sanguíneos con ImageJ software 34 , 35.

7. Análisis de expresión génica de Genes relacionados con la angiogénesis por RT-qPCR y pdgf-b

Nota: PCR se realizó siguiendo los pasos habituales: 95 ° C por 30 s, 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 s. Post-PCR fusión curvas confirmaron la especificidad de la amplificación de solo objetivo, y se determinó el cambio de doblez del gen de interés con respecto a β-actina. La reacción para cada muestra fue probada tres veces.

  1. Cosecha implantados los andamios y los tejidos de los ratones experimentales en 2, 4 y 8 semanas después de la operación 36; las muestras del grupo de control (n = 4), tomadas en los mismos puntos de tiempo, debe ser de tejido óseo adyacente.
    Nota: En cada momento (2, 4 y 8 semanas), sacrificados a los ratones con la inhalación de CO 2. Diseccionar el calvaria y, posteriormente, retire y cosechar los andamios implantados del calvaria.
  2. Utilizar un reactivo comercial para extraer el ARN total de cada muestra según el fabricante ' protocolo de s. Utilizar el Kit de transcripción inversa para invertir-transcribir el ARN en ADNc tras el fabricante ' Protocolo s.
  3. Realizar PCR en tiempo real cuantitativa utilizando el sistema de detección de SYBR Green; los iniciadores se enumeran en la tabla 1.
Primer(5'–3')
Gene hacia adelante revés
pdgfb CATCCGCTCCTTTGATGATCTT GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT
vWF CTCTTTGGGGACGACTTCATC TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC
VEGFR2 GAAATGACACTGGAGCCTACA AG TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G
β-actina GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGG CAAT GCAGTACATAATTTACACAGAAG

tabla 1: conjuntos de Pimer.

8. MicroCT análisis de la regeneración del hueso

  1. Euthanize ratones con inhalación de CO 2 en operación después de 8 semanas. En un ambiente bien ventilado, con cuidado coloque cada ratón en una jaula del ratón limpio y bomba de gas de CO 2 en la jaula para anestesiar los ratones antes de la eutanasia.
  2. Diseque el cráneo para microCT proyección de imagen de la región del defecto óseo. Usuario los siguientes parámetros en los experimentos de exploración: 9 μm de resolución, Al filtro de 0.5 mm, 50 kV voltaje y actual 142 μA.
    3. Recon
  3. estructura todos los datos de proyección de imagen usando software comercial proporcionan por la empresa. Calibrar las exploraciones utilizando la función de calibración de un software de CTAn.
    Nota: Coloque una unidad de Hounsfield (HU) en los ratones en cada escaneo.

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Resultados

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PLGA poroso cilíndrico/nHAp andamios 0,6 mm de altura y 4 mm de diámetro fueron fabricados con una impresora 3D. Las morfologías de los andamios se analizaron mediante análisis de microscopia electrónica y microCT. Figura 1A se muestra la fotografía del andamio implantado. MicroCT exploración reveló que más del 85% de los poros tenía tamaños que van desde 200 a 400 μm (figura 1B). Proyección de imagen de SEM demostró que la superficie del andamio una micr...

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Discusión

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El hueso es un tejido altamente vascularizado con una capacidad única para curar continuamente y remodelación a lo largo de la vida de un individuo1. El nivel de vascularización es importante para la reparación de osteogénesis y defecto. Baja vascularización limita la aplicación clínica amplio de ingeniería de tejido óseo. Construyendo un hueso altamente vascularizado tejido diseñado según la teoría de la biomimética, se ha convertido en una herramienta para la reparación de defectos óseos de gran...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado por el programa de pavo real de Shenzhen, China (Nº 110811003586331), el programa de investigación básica de Shenzhen (no. JCYJ20150401150223631, no. JCYJ20150401145529020 y no. JCYJ20160331190714896), el Guangdong pública de investigación y desarrollo de capacidades programa especial (Nº 2015A020212030), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 81501893), el programa nacional mayor Basic Research de China (2013CB945503) y la Programa de innovación de SIAT para excelentes investigadores jóvenes (Y5G010).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Poli(D,L-lactida-co-glicólido) (PLGA)SigmaP1941Relación L/G 75:25, MW 66000-107000
Nanopartículas de hidroxiapatitaSigma702153Diámetro medio < 200 nm
Sal de difosfato de cloroquinaSigmaC6628
Conjugado con FITC 250-kD dextranoSigmaFD250S
1,4-dioxanolingfeng, Shanghái0,45 micras
Filtros StericupMerck Millipore CorporationSLHV033RB
PDGF-BB CdnaSino Biological, IncMZ50801-G
anticuerpo policlonal de ratón  BioVision, Inc5489-30T
PDGF-BB proteína4489-50
Solución de transfección de fosfato de calcioPromega CorporationE1200
L-DMEMHycloneSH30021.01
DPBSHycloneSH30028.01
Penicilina-estreptomicina, líquidaThermo Fisher Scientific
FBSThermo Fisher Scientific10099-141
Transwell Corning3422
Ratones machos BALB/c CentroAnimales de Laboratorio Médico de Guangdong  
pentobarbital sódico Merck1063180500
microscopíaUn hecho en casa en los Institutos de Tecnología Avanzada de Shenzhen para detectar fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) y señal de generación de segundos armónicos (SHG).
isofluranoKeyuan, Shandong401750169
reactivo TRIzolInvitrogen15596018
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)TakaraRR420B
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)TakaraRR036B
Hematoxilina y eosinaBeyotimeC0105
ParafinaLeica& nbsp;RM2235
Ultracentrífuga OPtima L-100XPBeckman CoulterL-100XP
Impresora de baja temperatura de TsinghuaUn instrumento hecho en casa en la universidad de Tsinghua
LightCycler 480  Roche5815916001
microCTBruker1176
software comercialBruker
Buprenorfina
Anti-PDGF-BB recombinante 15140122 de multifotónica Universidad

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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