Aquí, presentamos un protocolo para visualizar la formación de vasos sanguíneos en vivo y en tiempo real en 3D andamios por microscopía multifotón. Angiogénesis en andamios modificados genéticamente fue estudiada en un modelo de defecto murino hueso calvarial de crítica. Más nuevos vasos sanguíneos fueron detectados en el grupo de tratamiento que en los controles.
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Artículo de método
Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo
En este artículo
Resumen
Resumen
La reconstrucción de defectos óseos de tamaño crítico sigue siendo un grave problema clínico debido a la pobre angiogénesis dentro tejido-dirigida andamios durante la reparación, que da lugar a una falta de suficiente riego sanguíneo y provoca la necrosis de los tejidos nuevos. Rápida vascularización es un requisito vital para la supervivencia de tejidos nuevos e integración con el existente tejido anfitrión. La generación de novo de vasculatura en andamios es uno de los pasos más importantes en la fabricación más eficiente, lo que permite reparar el tejido que crece en un andamio de la regeneración ósea. Para abordar este problema, la modificación genética de un andamio de biomaterial se utiliza para acelerar la angiogénesis y osteogénesis. Sin embargo, visualización y seguimiento en vivo formación de vasos sanguíneos en tiempo real y en tres dimensiones (3D) andamios o nuevo tejido óseo sigue siendo un obstáculo para la ingeniería de tejido óseo. Microscopía multifotón (MPM) es una modalidad de proyección de imagen de bio novela que puede adquirir datos volumétricos de estructuras biológicas de forma mínimamente invasiva y alta resolución. El objetivo de este estudio fue visualizar la angiogénesis con microscopía multifotón en vivo en un andamio de 3D-PLGA/nHAp genéticamente modificado para la reparación del defecto hueso calvarial crítica. Andamios PLGA/nHAp fueron funcionalizados para la entrega sostenida de un gen de factor de crecimiento pdgf-b con vectores lentivirales (LV -pdgfb) para facilitar la angiogénesis y a mejorar la regeneración ósea. En un hueso calvarial de crítico implantado andamio defecto modelo de ratón, las áreas de vasos sanguíneos (BVAs) en PHp andamios fueron significativamente mayores que en PH andamios. Además, la expresión de pdgf-b y genes relacionados con la angiogénesis, vWF y VEGFR2, aumentado correspondientemente. MicroCT análisis indicó que la nueva formación de hueso en el grupo de PHp mejorada dramáticamente en comparación con los otros grupos. A nuestro conocimiento, esta es la primera vez microscopía multifotón fue utilizado en ingeniería del tejido fino del hueso para investigar la angiogénesis en un andamio biodegradable 3D en vivo y en tiempo real.
Introducción
El hueso es un tejido altamente vascularizado que continúa para remodelar durante la vida de un individuo1. La regeneración ósea rápida y eficaz de los defectos de hueso grande como resultado de trauma, no sindical, resecciones tumorales o malformaciones craneofaciales es un proceso fisiológico complejo. Enfoques terapéuticos tradicionales utilizados para la reparación del defecto óseo incluyen implantación de autoinjerto y aloinjerto, pero su uso implica varios problemas y limitaciones, tales como la disponibilidad limitada, morbosidad del sitio donante importante, un alto riesgo de infección, y la sede de rechazo inmune2
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Protocolo
el cuidado de los animales fue en cumplimiento de la guía para el cuidado y uso de laboratorio animales de la provincia de Guangdong. Todos los procedimientos fueron realizados bajo la supervisión y aprobación del Comité de ética para la investigación Animal, institutos de avanzada tecnología de Shenzhen, de la Academia China de Ciencias.
1. lentivirales (LV) producción
- clon de cDNA de pdgf-b en un vector de expresión lentivirales (pLenti6/5-eGFP o LV-eGFP) en un múltiple encargo-clonación sitio aguas abajo del promotor de citomegalovirus con Spe I y Sal I sitios de restricción para construir el plásmido pLenti6/5-PDGFB....
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Resultados
PLGA poroso cilíndrico/nHAp andamios 0,6 mm de altura y 4 mm de diámetro fueron fabricados con una impresora 3D. Las morfologías de los andamios se analizaron mediante análisis de microscopia electrónica y microCT. Figura 1A se muestra la fotografía del andamio implantado. MicroCT exploración reveló que más del 85% de los poros tenía tamaños que van desde 200 a 400 μm (figura 1B). Proyección de imagen de SEM demostró que la superficie del andamio una micr.......
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Discusión
El hueso es un tejido altamente vascularizado con una capacidad única para curar continuamente y remodelación a lo largo de la vida de un individuo1. El nivel de vascularización es importante para la reparación de osteogénesis y defecto. Baja vascularización limita la aplicación clínica amplio de ingeniería de tejido óseo. Construyendo un hueso altamente vascularizado tejido diseñado según la teoría de la biomimética, se ha convertido en una herramienta para la reparación de defectos óseos de gran.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el programa de pavo real de Shenzhen, China (Nº 110811003586331), el programa de investigación básica de Shenzhen (no. JCYJ20150401150223631, no. JCYJ20150401145529020 y no. JCYJ20160331190714896), el Guangdong pública de investigación y desarrollo de capacidades programa especial (Nº 2015A020212030), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 81501893), el programa nacional mayor Basic Research de China (2013CB945503) y la Programa de innovación de SIAT para excelentes investigadores jóvenes (Y5G010).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Poli(D,L-lactida-co-glicólido) (PLGA) | Sigma | P1941 | Relación L/G 75:25, MW 66000-107000 |
| Nanopartículas de hidroxiapatita | Sigma | 702153 | Diámetro medio < 200 nm |
| Sal de difosfato de cloroquina | Sigma | C6628 | |
| Conjugado con FITC 250-kD dextrano | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxano | lingfeng, Shanghái | 0,45 micras | |
| Filtros Stericup | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| anticuerpo policlonal de ratón | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB proteína | 4489-50 | ||
| Solución de transfección de fosfato de calcio | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicilina-estreptomicina, líquida | Thermo Fisher Scientific | ||
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Ratones machos BALB/c Centro | Animales de Laboratorio Médico de Guangdong | ||
| pentobarbital sódico | Merck | 1063180500 | |
| microscopía | Un hecho en casa en los Institutos de Tecnología Avanzada de Shenzhen para detectar fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) y señal de generación de segundos armónicos (SHG). | ||
| isoflurano | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| reactivo TRIzol | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxilina y eosina | Beyotime | C0105 | |
| Parafina | Leica& nbsp; | RM2235 | |
| Ultracentrífuga OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Impresora de baja temperatura | de Tsinghua | Un instrumento hecho en casa en la universidad de Tsinghua | |
| LightCycler 480 | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| software comercial | Bruker | ||
| Buprenorfina |
Referencias
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue eng....
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Reimpresiones y permisos
