Artículo de método

Detección y enriquecimiento de Rare células B específicas de antígeno para el análisis del fenotipo y la función

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DOI:

10.3791/55382

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16 de febrero de 2017

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1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 3Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 4Department of Biomedical Research, National Jewish Health

En este artículo

Resumen

Un método simple y efectivo que emplea nanopartículas magnéticas para detectar y enriquecer células B reactivas al antígeno para el análisis funcional y fenotípica se describe.

Resumen

células B reactivas con un antígeno específico suelen producirse a una frecuencia del <0,05% de los linfocitos. Durante décadas, los investigadores han buscado métodos para aislar y enriquecer estas células raras para estudiar su fenotipo y biología. Los enfoques se basan inevitablemente en el principio de que las células B reconocen el antígeno nativo en virtud de los receptores de la superficie celular que son representativos en especificidad de los anticuerpos que eventualmente serán secretados por sus hijas diferenciadas. Quizás el enfoque más obvio para el problema implica el uso de antígenos conjugados con fluorocromo junto con la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Sin embargo, la utilidad de estos métodos está limitada por la frecuencia de las celdas y la tasa alcanzable de análisis y aislamiento mediante clasificación electrónica. Se describe un método novedoso para enriquecer células B raras específicas de antígeno utilizando nanopartículas magnéticas que da como resultado un enriquecimiento de alto rendimiento de células B reactivas a antígenos de grandes poblaciones de células iniciales. Este método permite mejorar el seguimiento del fenotipo y la biología de las células reactivas al antígeno antes y después del encuentro con el antígeno in vivo, como después de la inmunización o durante el desarrollo de la autoinmunidad.

Introducción

Dilución limitante análisis de la frecuencia de precursor de células secretora de anticuerpos han sugerido que las células B reactivas a un antígeno particular se producen normalmente a una frecuencia de 0,05 a 0,005% en el repertorio normal de, dependiendo del estado de la vacunación y el tamaño / número de epítopos presentes en el antígeno. La baja frecuencia de estas células ha hecho que sea difícil para el estudio de los cambios en su estado durante el desarrollo de la respuesta inmune, tales como después de la vacunación o la exposición a un antígeno extraño, o durante el desarrollo de la autoinmunidad. Anteriormente, los investigadores han llevado a cabo el aislamiento de células B reactivas al antígeno utilizando técnicas que van desde las placas recubiertas con antígeno o adsorbentes de la columna, para la reposición de glóbulos rojos antígeno recubierto, a clasificación de células 1, 2, 3, 4, 5, 6 activada por fluorescencia. though estas técnicas han tenido éxito en la identificación y el aislamiento de células B reactivas al antígeno, los resultados han variado en términos de rendimiento, pureza y capacidad de ampliación. Recientemente hemos desarrollado un nuevo método para detectar y enriquecer tanto subpoblaciones de linfocitos B raras usando nanopartículas magnéticas. El método permite el enriquecimiento con rendimiento relativamente alto y la pureza de las poblaciones de partida de gran tamaño, y es compatible con el análisis de las respuestas a antígeno. Al enriquecer a partir de poblaciones de células en suspensión, el método elimina las limitaciones que se asocian con la geometría de placas o columnas recubiertas de antígeno, y límite de rendimiento. Finalmente, ya que las células enriquecidas permanecen asociados con el antígeno y un reportero fluorescente, que se pueden purificar aún más por FACS clasificación. Como se describe en el presente documento hemos usado este enfoque para el estudio de las células de toxoide del tétanos reactiva de sangre periférica B antes y después de la inmunización de sujetos humanos, así como las células B autoantígeno reactiva de sujetos con diferentes autoitrastornos mmune, incluyendo la diabetes tipo 1, enfermedad de Graves, y la enfermedad de Hashimoto 7. El método funciona igual de bien en el ratón y humano, y es compatible con el análisis de las células B reactivas al antígeno de una variedad de tejidos (manuscrito en preparación).

En su formato básico, las células mononucleares de sangre periférica se incubaron primero con el antígeno biotinilado junto con anticuerpos para antígenos de la superficie celular necesarias para el análisis fenotípico. Esta etapa de marcaje es seguido por el lavado y fijación, y la adición de estreptavidina acoplada a colorante rojo lejano fluorescente para la detección de las células de unión biotinilado-antígeno (Figura 1). Estudios previos han identificado las células B específicas de antígeno de una manera similar pero utilizando antígenos directamente conjugado con un fluorocromo 8, 9, 10, 11. Aunque este es un dignoenfoque, el uso de antígenos biotinilados en conjunción con estreptavidina permite una mayor amplificación de la señal (por lo tanto una mejor diferenciación de la unión y las células no vinculante), en particular cuando los antígenos son pequeñas 12, 13, 14. Una consideración adicional es el uso de estreptavidina en lugar de avidina porque estreptavidina se desglicosilada, la disminución de la unión no específica. Además, usamos colorante rojo lejano fluorescente como el fluorocromo debido a su fotoestabilidad, rendimiento cuántico (brillo), y su pequeño tamaño (~ 1,3 kD). Fluorocromos de proteínas como la ficoeritrina (~ 250 kD) y aloficocianina (~ 105 kDa) 15 no son óptimas, ya que potencialmente contienen muchos epítopos antigénicos. El uso de un pequeño tinte fluorescente orgánica compuesta de un único epítopo, tal como tinte rojo lejano fluorescente, reduce la complejidad de la población de células aislada.

Una vez que son células con biotina-antigen y adsorbido rojo lejano-colorante fluorescente-estreptavidina, que se enriquecen usando nanopartículas magnéticas de tinte-conjugado anti-rojo lejano fluorescentes. Nanopartículas individuales no son detectados por la mayoría de los citómetros de flujo y por lo tanto no tienen que ser retirados antes de la purificación por clasificación FACS y ensayos de aguas abajo 16. la selección magnética de células B específicas de antígeno enriquece la población de interés, lo que elimina el tiempo y el coste de clasificar los eventos raros utilizando un citómetro de flujo.

A continuación les mostramos los resultados representativos de enriquecimiento de células B-toxoide tetánico-específica de un sujeto antes y siete días después de la inmunización de refuerzo de toxoide tetánico. Elegimos esta aplicación particular como un ejemplo con el fin de demostrar la capacidad de este método para enriquecer células B específicas de antígeno siguientes aguda en la estimulación in vivo. Cuando se combina con citometría de flujo, este método es capaz de enriquecer y diferenciar específica de antígeno ingenuo, la memoria, ycélulas y plasmablasto B permite al investigador para seguir los cambios en su frecuencia con el tiempo. Además, se incluye otra posible ensayo de aguas abajo, por ejemplo, un ensayo ELISPOT, lo que demuestra que las células conservan la capacidad de secretar anticuerpos después de enriquecimiento. Otra aplicación de este método podría implicar la transferencia adoptiva de células enriquecidas en un huésped. Hemos demostrado anteriormente células mantienen la capacidad para actuar como células presentadoras de antígeno a las células T específicas de antígeno después del aislamiento y de transferencia (datos no mostrados). Por lo tanto, hay una serie de posibles ensayos de aguas abajo que pueden ser acoplados con el método, que en conjunto informa a la comprensión de la respuesta inmune específica de antígeno. Hemos descrito a continuación el método, incluidos los controles para determinar el rendimiento general, la pureza, la especificidad de la célula, y doblar-enriquecimiento.

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Protocolo

1. Aislamiento de PBMC humanas

  1. Recoger 30-50 ml de sangre utilizando tubos de recogida de sangre heparinizada.
    NOTA: La cantidad de sangre que se utiliza depende de la pregunta experimental particular, y la frecuencia en la sangre de las células B específicas de antígeno de interés. La sangre heparinizada se puede procesar inmediatamente o sacudió suavemente durante la noche a temperatura ambiente durante el procesamiento de la día siguiente. El retraso en el procesamiento tiene muy poco efecto sobre la eficiencia de enriquecimiento y se asocia con una pérdida mínima de la viabilidad.
  2. Mezclar la sangre completa 1: 1 con, magnesio estéril temperatura ambiente y la solución salina tamponada con fosfato libre de calcio (PBS).
  3. En un tubo cónico estéril de 50 ml, añadir 10 ml de solución de gradiente de densidad de la temperatura ambiente. Almacenar las botellas de gradiente de densidad abiertos en la oscuridad a 4 ° C, pero se calienta a temperatura ambiente antes de usarla.
  4. Si es posible ajustar la pistola de pipeta para el ajuste lento y / o se aplica muy poco, pero consistente, la presión de disparo para lentamentela capa de 30-35 ml de la sangre diluida en la parte superior del gradiente de densidad, teniendo cuidado de no mezclar los dos.
    NOTA: La colocación de la punta de la pipeta contra el borde de las cónico de 50 ml, mientras que la adición de la sangre diluida ayudará a asegurar un flujo constante consistente.
  5. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a 20 ° C con el freno desactivado.
  6. Eliminar la capa superior, que contiene plasma y plaquetas, teniendo cuidado de no perturbar la capa de células mononucleares a continuación.
  7. Usando una pipeta estéril, recoger la capa de células mononucleares (capa leucocitaria) y ponerlo en un tubo cónico de 50 ml estériles distintas.
  8. Añadir PBS a la suspensión celular a un volumen de 50 ml. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 20 ° C con freno.
  9. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 10 ml de PBS. Recuento de células y determinar la viabilidad usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
  10. Resuspender las células en 10 7 células / ml y colocar en hielo hasta que esté listo para su posterior procesamiento.

2. La tinción de células

  1. Retire 1-2 x 10 6 células por cada una compensación de fluorescencia / control de FMO es necesario, en su caso. Centrifugar resto de las células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C con freno.
  2. Resuspender las células en tampón estéril filtrada, frío FACS (PBS + 1% de albúmina de suero bovino (BSA) + azida de sodio al 0,01%) a 3-6 x 10 7 células / ml (eliminan en un tubo de centrífuga de 1.5 ml). Asegúrese de que el tampón FACS frío y mantener en hielo durante todo el procedimiento de tinción.
    1. Dividir la población de células en cuatro partes (AD) al optimizar el ensayo. Utilice la fracción A de enriquecer células B específicas de antígeno de interés, las fracciones de uso de B y C para determinar la especificidad de enriquecimiento / tinción (ver 2.5 y 2.6 más adelante), y el uso fracción D para determinar la frecuencia y el número de células específicas de antígeno en la población no enriquecido para permitir el cálculo del rendimiento y doble-enriquecimiento.
  3. Añadir FcyR re bloqueo humanaagente de fracciones AD en hielo para evitar la unión de anticuerpos a los receptores Fc.
    NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para las condiciones apropiadas.
  4. Añadir anticuerpos conjugados con fluorocromo a la celda antígenos de superficie de interés para las fracciones de AD durante 30 min en hielo en la oscuridad, con cuidado de no incluir fluorocromos que pueden producirse reacciones cruzadas con los anticuerpos anti-tinte rojo lejano fluorescentes acoplados a nanopartículas magnéticas.
    NOTA: Estos incluyen conjugados de anticuerpo para tinte fluorescente en el infrarrojo cercano, Cy5, Cy5.5 y Cy7. Las manchas de viabilidad que se agregan deben ser compatibles con el uso de un fijador. Si uno no tiene la intención de analizar las células por medio de FACS, pero determinar la frecuencia secretora de anticuerpos, por ejemplo, mediante ELISPOT, tinción de la superficie con anticuerpos es innecesaria.
  5. Para probar la especificidad del ensayo, se incuba la fracción B con una cantidad suficiente de antígeno no marcado durante 30 minutos en hielo, de modo que la mayoría de los receptores con una afinidad de al menos10 -6 M están bloqueados.
    NOTA: Por lo general, una buena concentración de partida es un 50 a 100 veces en exceso de la cantidad de antígeno considera suficiente en 2.6 a continuación (por ejemplo, 50 a 100 mM). Esto debería bloquear cualquier célula B con una alta afinidad por el antígeno no marcado se una al antígeno biotinilado, que se añade en el paso 2.6 a continuación, lo que permite la confirmación de la especificidad de las células enriquecidas. Este paso se puede completar en conjunción con el paso 2.4 anteriormente.
  6. Añadir antígeno biotinilado a las fracciones A, B, y D. Incubar en hielo durante 30 min.
    NOTA: La concentración de antígeno biotinilado se debe titular para determinar la cantidad óptima necesaria para asegurar la detección y separación de las células de unión de células espectadoras no específicos adecuados. Normalmente, una buena concentración de partida de la prueba es de 1-5 M.
    NOTA: para las fracciones A y D, este paso puede realizarse simultáneamente a la etapa 2.4 anterior. Para la fracción B, este paso debe realizarse después del paso 2.5 (lavado en between pasos es innecesaria).
  7. Omitir el antígeno biotinilado de la fracción C con el fin de determinar cualquier unión de las células B a otros reactivos en el protocolo, tales como estreptavidina colorante rojo lejano fluorescente y las perlas magnéticas.
  8. Lavar las células dos veces con la suspensión de células en 1 ml de tampón FACS frío por cada 5 x 10 7 células y centrifugación a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
  9. Después del lavado final, se diluye la suspensión de células concentrado en 1 ml 2% de formaldehído por cada 5 x 10 7 células y dejar reposar en la oscuridad en hielo durante 5 min.
    NOTA: fijación de las células en este punto garantiza que el antígeno biotinilado permanece unido a la BCR para el resto del procedimiento. Para las células viables - para el análisis de aguas abajo, como en ELISPOT o transferencias adoptivos, omitir la etapa de fijación.
  10. Lavar las células dos veces con 1 ml de tampón FACS frío por cada 5 x 10 7 células y centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender en 1 ml de FACS frío tampón por 5 x 107 células.
  11. Añadir colorante 1-2 g de estreptavidina-rojo lejano fluorescente / ml y se incuba en hielo durante 20 min en la oscuridad. Valorar la cantidad de estreptavidina para cada aplicación.
  12. Lavar las células dos veces con 1 ml de tampón FACS frío por cada 5 x 10 7 células y centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. preparación de la fracción D se completa en este punto, ya que no se someterá a un enriquecimiento usando las perlas magnéticas.
    Nota: este ejemplo se utilizará para determinar la frecuencia y el número de células B específicas de antígeno en la muestra. Esto se utiliza para determinar el rendimiento y doblar-enriquecimiento obtenido por enriquecimiento.

3. Enriquecimiento magnética basada en nanopartículas

  1. Resuspender las células a partir de muestras de CA en 1 ml de tampón frío de separación (PBS + BSA al 0,5% + EDTA 2 mM) por cada 5 x 10 7 células y pasar a través de un filtro de 40 micras para eliminar los grumos que podrían obstruir la columna.
  2. Añadir Anti-Cy5 / nanopartículas de tinte anti-rojo lejano fluorescentes. for resultados óptimos, la concentración de nanopartículas se debe ajustar para cada uso, pero es un buen punto de partida es 50 l de suspensión por cada 5 x 10 7 células / ml. Girar en la oscuridad a 4 ° C durante 10 minutos.
  3. Lavar dos veces con tampón de separación frío 1 ml a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en 1 ml de tampón de separación frío por cada 5 x 10 7 células.

4. Uso de enriquecimiento magnético o columnas LS LD

  1. Coloque tres columnas LS o LD en el campo magnético de un separador magnético y añadir 3 ml de tampón de separación para mojar las columnas (véase la descripción del producto para determinar qué tipo de columna es el más adecuado). Permitir a los 3 ml pasen a través de la columna y se descartan después de la recolección.
    NOTA: A pesar de la separación de las células de nanopartículas magnéticas marcado se puede realizar usando uno cualquiera de los dispositivos de separación magnética que están disponibles comercialmente, el laboratorio ha tenido el mayor éxito con el uso de columnas LS, en terms de rendimiento, pureza, y la eficiencia de enriquecimiento.
  2. Colocar los tubos tres 15 ml cónicos etiquetados "Fracción A / (B) / (C) negativo", para las células seleccionadas negativamente, en la columna. Añadir la partícula magnética células marcadas a su respectiva columna y permitir que todo el volumen pase a través.
  3. Añadir 3 ml de tampón de separación fría en la parte superior, y permite que esto pase a través de la columna y repetir con 2 ml. Recoger las células seleccionadas negativamente y dejar de lado en hielo.
  4. Retirar la columna del campo magnético y colocar en la parte superior de un tubo cónico de 15 ml con la etiqueta "Fracción A / (B) / (C) positivo", para las células seleccionadas positivamente.
  5. Llene la columna a la parte superior con aproximadamente 6 ml de tampón de separación y de inmediato hundir este volumen a través de la columna para recoger las células que se habían enlazado al campo magnético mediante el émbolo proporcionado.
  6. Para aumentar la pureza, las células seleccionadas positivamente se pueden enriquecer adicionalmente usando una segunda columna limpia, repitiendo el procemiento.
  7. Girar tanto las fracciones seleccionadas negativamente y positivamente a 400 xg durante 10 min a 4 ° C y suspender en el volumen final deseado. Proceder con el análisis de aguas abajo, tales como FACS, ELISPOT o transferencia adoptiva.

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Resultados

Análisis de la pureza, rendimiento, y doblar el enriquecimiento mediante citometría de flujo

Poblaciones enriquecidas como se describió anteriormente, inevitablemente, contienen células contaminantes que no se han unido tinte rojo lejano estreptavidina fluorescente, pero están atrapadas en la matriz. Estas impurezas pueden eliminarse de las poblaciones enriquecidas por FACS. Para estimar la pureza de las poblaciones enriquecidas,...

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Discusión

Aquí se describe un nuevo método para llevar a cabo el aislamiento y enriquecimiento de células B de unión a antígeno de la sangre periférica humana. El método es fácilmente aplicable a los ratones y a otros tejidos, tales como el bazo y los ganglios, y es compatible con el análisis post-enriquecimiento de fenotipo y la función celular (manuscrito en preparación).

El usuario debe tener en cuenta una serie de variables que pueden afectar el éxito de este procedimiento. Por experiencia células...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por subvenciones de la JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) y los Institutos Nacionales de Salud (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 y F30OD021477).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Antígeno dela variablede interés variableAl menos 100 μ g a biotinilar fácilmente; si usa proteína, intente usar proteína que haya sido validada por ELISA. Debe ser portador  Sin proteínas.
Biotina para etiquetado; p. ej. EZ link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335La biotina está disponible en diferentes formulaciones, como las que contienen espaciadores de varias longitudes, por lo que el tipo utilizado debe ser determinado por el investigador
Estreptavidina-Alexa Fluor 647InvitrogenS21374Puede obtenerse de otros proveedores.
Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 MicroperlasMiltenyi Biotech130-091-395
LS ColumnasMiltenyi Biotech130-042-401
MACS Separadores manualesMiltenyi Biotech
Diluidoal 2% con PBS; opcional si el ensayo posterior requiere células
vivas PBS sin calcio y magnesio
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Sangre total en tubos
Tampón FACS (PBS + 1% BSA + 0,01% azida sódica)
Tampón de separación (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA)
Tubos cónicos de 50 ml Tubos cónicos de
15 ml
1,5 ml de tubos Eppendorf Marcadores de
superficie Anticuerpos reactivos, Fc Block, tinción discriminante viva/muerta, si es necesario
Suministros ELISPOT, si es necesario
Formaldehído variablede recolección heparinizados

Referencias

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