Se describe aquí un método para producir citoquina exógena en ratones de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) mediante inyección intraperitoneal semanal de una línea celular de estroma transducida por citoquinas. Este método amplía la utilidad de PDX y proporciona la opción para el suministro transitorio o sostenido de citoquinas exógenas en una multitud de modelos PDX.
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Artículo de método
Expresión de citoquina exógena en los xenoinjertos derivados del paciente mediante inyección con una línea de células estromales transducidas por citoquinas
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Resumen
Resumen
Los ratones de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) se producen trasplantando células humanas en ratones inmunodeficientes. Estos modelos son una herramienta importante para el estudio de los mecanismos de la hematopoyesis normal y maligna y son el estándar de oro para la identificación de quimioterapia eficaz para muchos tumores malignos. PDX modelos son posibles porque muchas de las citoquinas de ratón también actúan sobre las células humanas. Sin embargo, este no es el caso para todas las citocinas, incluyendo muchas que son críticas para el estudio de la hematopoyesis normal y maligna en las células humanas. Técnicas que ingenieros ratones para producir citoquinas humanas (transgénicos y knock-in modelos) requieren un gasto significativo antes de la utilidad del modelo se ha demostrado. Otras técnicas son intensivas en mano de obra (inyección de citocinas recombinantes o lentivirus) y en algunos casos requieren altos niveles de experiencia técnica (inyección hidrodinámica de ADN). Este informe describe un método simple para la generación de ratones PDX que tienen células humanas exógenasTokina (TSLP, linfopoyetina estromal tímica) mediante inyección intraperitoneal semanal de estroma que se han transducido para sobreexpresar esta citocina. El uso de este método proporciona una fuente in vivo de producción continua de citoquinas que alcanza los niveles fisiológicos de citoquina humana circulante en el ratón. Los niveles plasmáticos de citoquina humana se pueden variar basándose en el número de células estromales inyectadas, y la producción de citoquinas puede iniciarse en cualquier punto del experimento. Este método también incluye ratones de control negativos a citoquinas que se producen de manera similar, pero a través de inyección intraperitoneal de estroma transducido con un vector de control. Hemos demostrado previamente que las células de leucemia recolectadas de PDX que expresa TSLP, en comparación con el control de PDX, muestran un patrón de expresión génica más parecido a la muestra original del paciente. Conjuntamente, los ratones PDX productores de citoquinas y negativos a citoquinas producidos por este método proporcionan un sistema modelo que hemos utilizado con éxito para estudiar laPapel de TSLP en hematopoyesis normal y maligna.
Introducción
Los xenoinjertos derivados de los pacientes (PDX) son un poderoso modelo in vivo para estudiar la producción de células hematopoyéticas normales y malignas en un medio mamífero "nativo". La mayoría de las veces, PDX se producen inyectando o trasplantando células humanas en ratones inmunodeficientes. La producción de PDX usando células madre hematopoyéticas humanas normales permite estudios in vivo de la sangre humana normal y el desarrollo de células inmunes. El PDX producido a partir de leucemia u otras células cancerosas hace posible estudiar mecanismos oncogénicos e identificar terapias eficaces en el contexto de la gama de paisajes genéticos y m....
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Protocolo
Los estudios se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Loma Linda y de acuerdo con todas las directrices federales.
PRECAUCIÓN: El PDX y los tejidos humanos deben ser manipulados de acuerdo con los procedimientos de seguridad para prevenir la transmisión de patógenos transmitidos por la sangre.
1. Cultivo y Expansión de Células Estromales Transducidas por Citoquinas
NOTA: Cada vez que se pasa el estroma, se recolecta el sobrenadante del cu....
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Resultados
En la Figura 1 se muestra una visión general del modelo. Una vez que se han obtenido citocinas productoras (TSLP + estroma) y estroma de control se expanden en cultivo. Antes de la inyección de estroma en ratones, el sobrenadante de células estromales se evalúa por ELISA para verificar la producción de citoquinas ( Figura 2 ) y la citometría de flujo fosfo (Protocolo # 3) se utiliza para verificar la actividad de la citoquina producida por el estroma. El.......
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Discusión
Este manuscrito describe un método simple, rápido y relativamente rentable para la ingeniería de PDX para expresar la citoquina humana exógena. La estrategia descrita aquí se basa en inyecciones intraperitoneales semanales de una línea celular de estroma transducida para expresar la citocina humana, TSLP. Antes de realizar los métodos descritos aquí, se generó estroma manipulado para expresar altos niveles de la citoquina de interés (TSLP) y estroma control controlado de forma similar. En los protocolos presentados aquí.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, una beca Hope Scholar de Hyundai Hope on Wheels, el Departamento de Patología y Anatomía Humana, el Departamento de Ciencias Básicas y el Centro de Disparidades de Salud y Medicina Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Loma Linda y por una Subvención para Promover la Investigación Colaborativa y Traslacional de la Universidad de Loma Linda (KJP). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los NIH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| T-25 Nunc Cell Culture Tratado EasYFlasks, 7 mL de capacidad, 25cm² área de cultivo | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Matraz Tratado con Cultivo de Tejidos, 250 mL de capacidad, 75 cm² área de cultivo y tapón ventilado | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| Matraz tratado con cultivo de tejidos T-150 Falcon, capacidad de 600 mL, 150 cm² Área de Cultura & tapón ventilado | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| pipetas serológicas de 10 mL | Falcon | 357551 | |
| 15 mL tubos cónicos de polipropileno | Fisher | 05-539-12 | |
| Tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mL | Falcon | 352054 | |
| 50 mL tubos cónicos de polipropileno | Falcon | 352098 | |
| viales criogénicos de 2,0 mL, rosca externa | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| puntas de pipeta de 1 mL | Fisher | 2707509 | |
| 200 μ L puntas de pipeta | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μ Puntas de pipeta | en L Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Unidades de filtro desechables estériles con membrana SFCA, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco' solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calicio ni magnesio, 1&veces; | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Humano TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Ácido Acético con Azul de Metileno | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-CL | |
| "Tripsina" 1x 0.25% Tripsina 2.21 mM EDTA en HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| " R10" medio de cultivo celular, % del volumen total (rinde 565 mL) | - | - | Receta de laboratorio |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamina, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-CL | |
| Penicilina-estreptomicina, 0,50% (2,8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoetanol, 0,10% (560 µ L) | MP | 190242 | |
| " R20" medio de cultivo celular, % del volumen total (rinde 195 mL) | - | < | fuerte>Receta de laboratorio |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | ver arriba | ver arriba | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | ver arriba | ver arriba | |
| 2 mM de L-glutamina, 1.02% (2 mL) | ver arriba | ver arriba | |
| 1 mM de piruvato de Na, 1.02% (2 mL ) | ver arriba | ver arriba | |
| Penicilina-estreptomicina, 0.51% (1 mL) | ver arriba | ver arriba | |
| 2-Mercaptoetanol, 0,10% (0,1 M), 0,10% (200 y micro; L) | véase | más arriba | |
| " Medio de congelación", % del volumen total | - | - | Receta de laboratorio |
| " R10" medio, 45% | ver receta "R10" | - | |
| FBS, 20% | ver arriba | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalosa dihidratada, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A línea de estroma humano | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" Línea celular MHH-CALL-4, leucemia precursora de células B humanas | DSMZ | ACC 337 | |
| " Ratones NSG" CABECEO. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, hombre o mujer, 6 años – 8 semanas | JAX Ratones | # 005557 | |
| línea celular MUTZ-5, leucemia precursora de células B humanas | DSMZ | ACC 490 | |
| Proteína TSLP humana recombinante | R& D Systems | 1398-TS-010 | |
| Nombre | Company | Catolog Number | Comentarios |
| >Anticuerpos de citomería de flujo (clon)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (el nombre alternativo es IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Tinte de viabilidad fijable eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ cadena ligera FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ cadena ligera FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, ratón anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Otros materiales y equipos& bsp; | |||
| Animal Implantable Nano Transpondedor con Cánula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| Crema anestésica de lidocaína EMLA (obtenida por prescripción a través del centro de cuidado de animales) | prescripción | prescripción | |
| BD &12; cc LO-DOSE U-100 Jeringa de insulina 28G½ | BD | #329461 | |
| Tubos de Microtainer BD con K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrífuga | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Tubos Capilares (Heparinizados) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocitómetro | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Jaula de pastel de ratón | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Restrainer Iluminador de cola de ratón | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Implantador de empuñadura de pistola | Trovan | IM-300 (1.25) | |
| y micro; Cuantita | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo software de análisis de citometría de flujo | FlowJo, LLC | Versión 10 | |
| * Todos los anticuerpos son antihumanos a menos que se indique lo contrario. |
Referencias
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al.
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Reimpresiones y permisos
