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Artículo de método

Expresión de citoquina exógena en los xenoinjertos derivados del paciente mediante inyección con una línea de células estromales transducidas por citoquinas

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DOI:

10.3791/55384

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10 de mayo de 2017

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1Department of Pathology and Human Anatomy, Loma Linda University, 2Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 3Department of Medicine, Loma Linda University

En este artículo

Resumen

Se describe aquí un método para producir citoquina exógena en ratones de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) mediante inyección intraperitoneal semanal de una línea celular de estroma transducida por citoquinas. Este método amplía la utilidad de PDX y proporciona la opción para el suministro transitorio o sostenido de citoquinas exógenas en una multitud de modelos PDX.

Resumen

Los ratones de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) se producen trasplantando células humanas en ratones inmunodeficientes. Estos modelos son una herramienta importante para el estudio de los mecanismos de la hematopoyesis normal y maligna y son el estándar de oro para la identificación de quimioterapia eficaz para muchos tumores malignos. PDX modelos son posibles porque muchas de las citoquinas de ratón también actúan sobre las células humanas. Sin embargo, este no es el caso para todas las citocinas, incluyendo muchas que son críticas para el estudio de la hematopoyesis normal y maligna en las células humanas. Técnicas que ingenieros ratones para producir citoquinas humanas (transgénicos y knock-in modelos) requieren un gasto significativo antes de la utilidad del modelo se ha demostrado. Otras técnicas son intensivas en mano de obra (inyección de citocinas recombinantes o lentivirus) y en algunos casos requieren altos niveles de experiencia técnica (inyección hidrodinámica de ADN). Este informe describe un método simple para la generación de ratones PDX que tienen células humanas exógenasTokina (TSLP, linfopoyetina estromal tímica) mediante inyección intraperitoneal semanal de estroma que se han transducido para sobreexpresar esta citocina. El uso de este método proporciona una fuente in vivo de producción continua de citoquinas que alcanza los niveles fisiológicos de citoquina humana circulante en el ratón. Los niveles plasmáticos de citoquina humana se pueden variar basándose en el número de células estromales inyectadas, y la producción de citoquinas puede iniciarse en cualquier punto del experimento. Este método también incluye ratones de control negativos a citoquinas que se producen de manera similar, pero a través de inyección intraperitoneal de estroma transducido con un vector de control. Hemos demostrado previamente que las células de leucemia recolectadas de PDX que expresa TSLP, en comparación con el control de PDX, muestran un patrón de expresión génica más parecido a la muestra original del paciente. Conjuntamente, los ratones PDX productores de citoquinas y negativos a citoquinas producidos por este método proporcionan un sistema modelo que hemos utilizado con éxito para estudiar laPapel de TSLP en hematopoyesis normal y maligna.

Introducción

Los xenoinjertos derivados de los pacientes (PDX) son un poderoso modelo in vivo para estudiar la producción de células hematopoyéticas normales y malignas en un medio mamífero "nativo". La mayoría de las veces, PDX se producen inyectando o trasplantando células humanas en ratones inmunodeficientes. La producción de PDX usando células madre hematopoyéticas humanas normales permite estudios in vivo de la sangre humana normal y el desarrollo de células inmunes. El PDX producido a partir de leucemia u otras células cancerosas hace posible estudiar mecanismos oncogénicos e identificar terapias eficaces en el contexto de la gama de paisajes genéticos y mutaciones presentes en la población humana. 1 Por lo tanto, PDX son el patrón oro actual para la investigación biomédica traslacional para identificar terapias eficaces y una herramienta importante para comprender los mecanismos de progresión del cáncer. Los modelos PDX son una herramienta esencial para ayudar a la investigación de enfermedades de disparidades de salud Lesiones genéticas o cualquier enfermedad en la que las variaciones del paisaje genético de un paciente puedan contribuir sustancialmente a la oncogénesis y los resultados del tratamiento.

Ratón-humano PDX modelos son posibles porque muchas citoquinas de ratón adecuadamente imitar sus análogos humanos en la activación de los receptores de citoquinas de las células humanas mientras están dentro del ratón. Por ejemplo, la interleucina-7 (IL-7) proporciona una señal crítica para el desarrollo de células B humanas. 2 En este caso, IL-7 de ratón tiene homología suficiente con IL-7 humana que la citoquina de ratón estimula vías de señalización en precursores de células B humanas. Sin embargo, este no es el caso de la linfopoyetina estromal tímica (TSLP) 5 , 6 que entre otras citoquinas (IL-3, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de células madre (SCF) ,Ref "> 7 es importante para la producción de células hematopoyéticas humanas normales y malignas Cuando las citoquinas humanas y de ratón muestran una baja homología, las citoquinas de ratón no activan sus respectivos receptores en células humanas Para superar este obstáculo se han utilizado varias estrategias Para diseñar la expresión de citoquinas humanas en ratones PDX.Estos incluyen la inyección de citoquinas humanas recombinantes, la inyección hidrodinámica de ADN, la expresión lentiviral, la expresión transgénica y la sustitución del gen knockin.7 Este informe describe un método para la ingeniería de PDX para producir citoquinas humanas a través de la medicación estromal Cytokine entrega ( Figura 1 ].

En el método demostrado aquí, los ratones PDX son modificados genéticamente para expresar la citoquina humana, TSLP, o para servir como controles de citoquinas negativas. Los PDX que expresan TSLP se consiguen mediante inyecciones intraperitoneales semanales de células estromales que se han transducido para expresar niveles elevados de TSLP humana.Los ratones "control" de PDX negativos para citoquinas están diseñados de forma similar; Aunque el estroma de control se transduce con un vector de control. Este método logra niveles fisiológicos normales de TSLP humano en ratones PDX inyectados con el estroma TSLP +. No se observa TSLP detectable en ratones PDX que reciben el estroma negativo de citoquina. Hemos seleccionado la línea de células estromales humanas HS-27A para nuestros estudios, ya que crece fuertemente en el cultivo y muestra muy bajo nivel de producción de citoquinas que no apoya la proliferación de células progenitoras aisladas en cocultures. 8 Para la expresión de TSLP humano, el estroma se transdujo con un vector lentiviral autoinactivante de generación avanzada derivado de un esqueleto previamente descrito 9 , e incluye el elemento cPPT / cts y el elemento regulador post-transcripcional de hepatitis de la marmota (WPRE) para aumentar la expresión del transgén. El gen TSLP humano se construyó en este vector bajo el control del factor de elongación-1(EF-1) para conseguir una expresión robusta, constitutiva y de largo plazo.

La ingeniería de este modelo PDX humano-citocina mejorada consta de 4 pasos principales. Primero, el estroma transducido se expande in vitro y se evalúa mediante el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para una producción de citoquinas estable y de alto nivel. En segundo lugar, se verifica la actividad de la citoquina humana producida por las células estromales transducidas (y la falta de actividad de citoquinas del estroma de control) usando citometría de flujo fosfórico. Las líneas celulares conocidas por ser sensibles a citoquinas de interés (en este caso, TSLP) se incuban con sobrenadante de células estromales y se ensayan para la fosforilación inducida por citoquinas. En tercer lugar, los ratones se inyectan con estroma humano transducido y luego el plasma de ratón se evalúa por ELISA para los niveles de citoquina humana sobre una base semanal. Cuarto, las células hematopoyéticas humanas se transplantan y los efectos funcionales in vivo de la citoquina humana se evalúan sobre un objetivo conocido ( Por ejemplo. Población de células).

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Figura 1: Modelo PDX diseñado para producir citoquina humana exógena en ratones. ( 1B ) Obtención de células humanas (células madre hematopoyéticas, células leucémicas, etc. ) para generar ratones PDX (xenoinjerto derivado del paciente). ( 2A ) Inyectar el estroma de ingeniería y ( 2B ) transplantar células humanas en ratones inmunodeficientes según el programa experimental. ( 3A-B ) Monitorear las concentraciones de citoquinas en el sobrenadante de estroma y el plasma de ratón mediante ELISA. ( 4 ) Cosecha de células humanas y evaluar los efectos funcionales in vivo de la citocina humana presente en el PDX. Haga clic aquíPara ver una versión más grande de esta figura.

La administración de citoquinas humanas a través de células estromales ofrece ventajas y desventajas cuando se compara con otros métodos de liberación / producción de citoquinas humanas en ratones PDX. Comparado con la inyección de citoquina humana recombinante, el parto mediado por estroma es generalmente menos costoso (el costo del cultivo de células estromales es menor que el costo de la citocina recombinante) y menos intensivo de mano de obra (una inyección por semana versus múltiples inyecciones por semana). La cuestión de la vida media de citoquinas corto también se mitiga ya que el estroma produce continuamente la citoquina exógena. La administración de citoquina mediante inyección hidrodinámica de ADN puede ser menos costosa que la administración a través del estroma. Sin embargo, es similarmente transitorio y puede requerir más habilidad técnica que la simple inyección intraperitoneal semanal requerida para la administración mediada por estroma. La expresión del gen lentiviral en el ratón puedeNsient método de entrega de citoquinas; Sin embargo, en nuestras manos no se lograron niveles fisiológicos de TSLP. Además, este método es de mano de obra intensiva, que requiere la producción continua de vector lentiviral. Ratones transgénicos o knock-in ofrecen expresión a largo plazo estable de citoquina y pueden ser diseñados para la expresión específica de tejido, lo que puede ser una ventaja. Por otra parte, la expresión transgénica del gen de citoquina humana en el fondo de ratón inmunodeficiente requerido para ratones PDX, requiere una inmensa inversión de recursos antes de que se haya establecido el valor del modelo. Además, los modelos transgénicos generalmente no permiten la opción de variar el tiempo de iniciación de citoquinas o el nivel de producción de citoquinas in vivo . Estos pueden lograrse con la administración mediada por estroma simplemente cambiando el punto de tiempo para la iniciación de la inyección de células estromales o la dosis de células estromales inyectadas.

El método de suministro de citocinas mediado por células estromalesOd detallado aquí se utilizó para desarrollar PDX para evaluar el papel de TSLP en el desarrollo de células B humanas normales 4 , 6 y de alto riesgo de células B leucemia linfoblástica aguda. 6 Este método proporciona un método alternativo de administración de citoquinas para su uso en la generación de modelos similares con citocinas humanas distintas de TSLP. Este modelo también puede ser útil para generar datos preliminares que pueden ayudar a determinar si el valor de una citoquina transgénica o citoquina knock-in PDX modelo sería digno de la inversión de tiempo y dinero sustancial.

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Protocolo

Los estudios se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Loma Linda y de acuerdo con todas las directrices federales.

PRECAUCIÓN: El PDX y los tejidos humanos deben ser manipulados de acuerdo con los procedimientos de seguridad para prevenir la transmisión de patógenos transmitidos por la sangre.

1. Cultivo y Expansión de Células Estromales Transducidas por Citoquinas

NOTA: Cada vez que se pasa el estroma, se recolecta el sobrenadante del cultivo (alícuota de 1 ml) y se almacena a -80 ° C para la cuantificación futura del nivel de citoquinas mediante el ensayo ELISA.

  1. Preparar el medio de cultivo R10 y el medio de congelación como se describe en la Tabla de Materiales.
  2. Generar 10 , 11 u obtener el estroma de control (transducido con vector vacío) y el estroma productor de citocinas (TSLP +)."> 6 Almacenar en nitrógeno líquido (LN 2 ) hasta su uso Descongelar las células del estroma según se describe 12 y plancharlas en 5 ml de medio R10 en matraces de cultivo celular T-25 separados Las células de cultivo en una incubadora a 37ºC con 5% CO 2. Esto es post-thaw "paso # 1".
  3. Una vez que el estroma es confluente (24-48 h), se pasan las células por tripsinización usando 1 x tripsina EDTA (0,25%) y se vuelve a depositar en un matraz de cultivo T-150. Esto es post-thaw "paso # 2".
  4. Cuando el estroma alcanza la confluencia en los frascos T-150 (3-4 días más tarde), pasa las células por tripsinización. Utilice esta suspensión celular para las necesidades experimentales.
    1. Expansión celular a múltiples frascos
      1. Dividir las células cosechadas entre tres matraces T-150 y cultivar hasta confluir. Repita este paso si la expansión del estroma es necesaria. El recuento de células típicas del estroma humano (HS-27A) en la confluencia en un matraz T-150 es ~ 5 x 10 6 .
    2. CélulasTortura
      1. Transferir la suspensión de células cosechadas a un tubo cónico y centrifugar a 500 xg durante 5 min, decantar el sobrenadante y resuspender las células en medio de congelación. Congelar y almacenar en LN 2 ~ 1,5 x 10 6 células por vial.
    3. Para las inyecciones de estroma intra-periotoneal en ratones, proceda al paso 4.1.

2. Ensayos ELISA para monitorizar la producción de citocinas in vitro a partir del estroma transducido

  1. Compre el kit de ensayo ELISA comercialmente disponible para detectar la citoquina de interés.
  2. Descongele el sobrenadante de las células del estroma del estroma productor de citocinas y productoras de citocinas (TSLP +) cosechado en los pasajes temprano, medio y tardío ( Figura 2 ).
  3. Determine la concentración de TSLP en muestras sobrenadantes usando un kit ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 13 Compilar estos datos en serie para controlar la estabilidad de la producción de citoquinas durante la célula cultur E ( Figura 2A - B ).
    1. Identificar y descartar el estroma productor de citoquinas con expresión de citoquinas reducida o subóptima, así como cualquier viales correspondientes almacenados ( Figura 2A-B ).
    2. Identificar y mantener un estroma productor de citocinas que demuestre concentraciones estables de citocinas de alto nivel. Utilice estos deshielos para experimentos.
  4. Utilizar el kit ELISA para monitorear rutinariamente el estroma a lo largo de la duración del cultivo celular (al menos 1 vez durante los pasos tempranos, medios y posteriores al descongelamiento) para asegurar la producción estable de citoquinas o, en el caso del estroma control, la ausencia de producción de citoquinas .

3. Ensayos de citometría de flujo fosfórico para evaluar la actividad de la citoquina producida por Stroma

NOTA: Evaluar el sobrenadante del estroma manipulado antes del primer experimento para verificar la bioactividad relevante de la citocina generada por estroma para el experimento individual.Ef "> 6 Una vez validado el estroma de ingeniería, no es necesario realizar más pruebas a menos que se introduzcan estromas que se hayan producido con un nuevo vector.

  1. Comprar líneas celulares de leucemia MUTZ5 y / o MHH-CALL4 (sensibles a TSLP), 14 citoquinas humanas recombinantes y anticuerpos aprobados para su uso en ensayos de citometría de flujo fosfórico para detectar dianas de fosforilación apropiadas aguas abajo.
  2. Descongelar el sobrenadante recogido del control y el estroma que expresa las citoquinas.
  3. Plantear las líneas celulares de leucemia en medio R20 (véase tabla de materiales ) a una concentración de 0,2 x 106 células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Placa 3 pozos por condición para permitir los ensayos triplicados. Incubar durante 2 h a 37 ° C. Este tiempo permite la pérdida de cualquier fosforilación que ocurrió durante las condiciones de cultivo anteriores.
    NOTA: 12 pocillos por línea celular proporcionan ensayos triplicados para cada condición experimental mostrada en el paso 3.4.
    4. <Después de 2 h en cultivo, transferir las células de cada pocillo a tubos separados de 4 ml y centrifugar a 500 xg durante 5 min, a 4ºC. Decantar el sobrenadante.
    1. Suspender de nuevo las células en 200 μl para cada una de las siguientes condiciones experimentales (realizar ensayos en triplicado): 1) medio de control negativo solo, 2) medio de control positivo con citoquina recombinante a concentración (s) saturada (TSLP a 15 ng / ML, etc. ), 3) control del estroma-sobrenadante del estroma de control, y 4) citoquina-estroma-sobrenadante del estroma productor de citoquina.
  4. Incubar las células durante la duración especificada por fosfo-ensayo comercial específico ( por ejemplo, 30 min para fosfo-STAT5 en MUTZ5 o MHH-CALL4 en respuesta a TSLP).
  5. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C y decantar el sobrenadante.
  6. Efectúe una tinción con citometría de flujo fosfórico según el protocolo del fabricante y recoja los datos de citometría de flujo. 15
  7. Analizar datos de citometría de flujo. 15
    1. Puerta sobre células intactas basadas en dispersión de luz directa (FSC, indica tamaño de célula) y lateral (SSC, indica granularidad celular).
    2. Determine la intensidad fluorescente mediana (MFI) de las células intactas en cada muestra. Comparar la IMF promedio obtenida a partir de los valores triplicados de sobrenadante de células estromales con el de controles de medios positivos y negativos.

4. Inyección de Stroma transducido por citoquinas en ratones

NOTA: Cultive el estroma HS-27A durante un mínimo de 3 post-deshielo antes de inyectarlos en ratones para asegurar células sanas y producción adecuada de citoquinas.

  1. Preparación del estroma
    1. Transferir la suspensión de células estromales cosechadas a un tubo cónico y una alícuota de 10 μl para el recuento de hemocitómetro; Obtener recuento de células vivas utilizando azul trypan. 16 Centrifugar el ce restanteL de suspensión a 500 xg durante 5 min.
    2. Aspirar el sobrenadante de las células sedimentadas y resuspender suavemente las células en el volumen necesario de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) para inyección de ratón (dependiendo del número de ratones a inyectar).
      NOTA Concentración típica de células estromales para la inyección de ratón: 0,5 x 10 6 -5 x 106 células por ratón en 200 μl de PBS.
    3. Mantenga la suspensión de las células del estroma a 4 ° C (o sobre hielo) hasta inmediatamente antes de la inyección. Asegúrese de que la suspensión celular esté por lo menos a temperatura ambiente (RT) (~ 25 ° C) para la inyección de ratones.
  2. Inyección de células estromales
    1. Desinfecte la campana de seguridad biológica, monte los materiales para inyecciones y luego coloque la jaula del ratón dentro.
    2. Mezclar suavemente la suspensión de células por inversión antes de extraer 200 μl en una jeringa de tuberculina.
    3. Usando técnicas de inyección intraperitoneal estándar, 17Restringir el ratón y administrar la suspensión celular de 200 mu l en la cavidad peritoneal. Los detalles han sido previamente demostrados por Machholz et al. 18

5. Colección de sangre en serie y monitorización de plasma para citoquina humana exógena en ratones

  1. Recolección de sangre mediante el recorte de la cola
    1. Desinfecte la campana de seguridad de la biotecnología y ensamble el contenedor del ratón, las tijeras y otras herramientas / suministros para el procedimiento.
    2. Coloque el ratón en un contenedor y asegure el tubo para minimizar el movimiento del ratón.
    3. Desinfecte la cola y las tijeras quirúrgicas con alcohol isopropílico. Aplicar crema anestésica tópica en la cola.
    4. El uso de tijeras quirúrgicas muy afiladas recorta alrededor de 0,5 a 1 mm de la punta de la cola del ratón. Recoger aproximadamente 80 μl de sangre periférica usando tubos capilares heparinizados.
      NOTA: Si la sangre se recolecta con este método más de seis tiMes, la eliminación de la cola debe ser conservadora con respecto a la cantidad de cola eliminada. A medida que los cortes progresan hacia arriba de la cola, el diámetro aumenta, las hemorragias son más rápidas y la cicatrización tarda más.
  2. Separación de plasma
    1. Transferir la sangre con una jeringa de bulbo (para expulsarla de los tubos capilares) en un tubo de microtainer K 2 EDTA marcado; Invertir 20 veces para evitar la coagulación.
      NOTA: Por lo general, la coagulación de la sangre por el pinchazo de la cola es rápida. Sin embargo, si la hemorragia persiste más de ~ 2 min use un lápiz o un polvo estéril para ayudar a la coagulación.
    2. Centrifugue los tubos de recogida de sangre de acuerdo con las instrucciones del fabricante y alícuota del plasma para su almacenamiento (-20 ° C) hasta que esté listo para el ensayo ELISA.
    3. Si se necesitan datos de quimerismo de células ratón-humanos de la sangre del ratón, entonces se trata el sedimento restante como se describe en el paso 6.3.1. De lo contrario, descarte el sedimento de células sanguíneas.
  3. ELISA modificado para microvolumeDe plasma de ratón
    NOTA: El procedimiento de ELISA del fabricante se modificó desde el volumen de muestra recomendado de 100 mu l a un volumen de 40 mu l para acomodar los microvolúmenes recogidos de ratones. No es posible ejecutar las muestras de plasma de ratón in vivo por triplicado con estos volúmenes limitados. Al final del experimento se recogen 500 μL de sangre post-mortem mediante punción cardiaca. Las concentraciones de citoquinas evaluadas en 100 μl de plasma de eutanasia se utilizan para validar los datos in vivo de 40 μl para cada ratón.
    1. Descongele las muestras congeladas de plasma de ratón.
    2. Se diluyen seriamente los patrones de ELISA y se plaquean por triplicado a 40 μL por pocillo.
    3. Añadir 40 μL de cada muestra de plasma de ratón a la placa ELISA.
      NOTA: Si una muestra de ratón es inferior a 40 μL, a continuación, aumente el volumen hasta 40 μl con tampón ELISA. Registre este volumen de diluyente y utilícelo para calcular un factor de dilución para cada muestra diluida. CuandoEl análisis de los datos de ELISA multiplica la concentración de la muestra diluida por el factor de dilución de la muestra para determinar la concentración real de citocinas en la muestra original.
    4. Ensayo ELISA completo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

6. Trasplante de células hematopoyéticas en ratones

  1. Sublethal irradiación para condicionar la médula ósea para el trasplante
    NOTA: La Universidad de Loma Linda (LLU) utiliza una fuente de radiación Cobalt-60. Los animales se colocan en un contenedor de pasteles que está situado a 80 cm de la fuente de radiación en un campo de 20 x 20 cm y con una capa de Lexan de 0,5 cm sobre la parte superior del dispositivo de retención. El tiempo de exposición se calcula para lograr una dosis de 225 cGy basada en la calibración más reciente de la fuente (actualmente 2-3 min para esta fuente).
    1. Submetal irradian ratones (dosis de irradiación corporal total de 225 cGy máximo para ratones inmunodeficientes).
    2. Transplante de células hematopoyéticas ~ 24 h más tarde vía </ Em> inyección intravenosa de la vena de la cola.
  2. Trasplante de células hematopoyéticas intravenosas
    1. Preparar suspensiones de células humanas para trasplante en un volumen de 200 μl de PBS estéril por ratón: células madre hematopoyéticas CD34 + (HSC): 1 x 10 5 a 5 x 10 5 células por ratón y líneas de células de leucemia / muestras de pacientes: 1 x 10 6 a 5 x 106 células por ratón.
    2. Mantenga las células a 4 ° C (transporte en hielo) hasta inmediatamente antes del trasplante. Asegúrese de que las células estén al menos a RT antes del trasplante.
    3. Desinfecte la campana de bioseguridad y prepare el área de la campana para inyecciones de trasplante.
    4. Coloque el ratón en la jaula de calentamiento durante al menos 5 minutos para permitir la dilatación de las venas de la cola.
    5. Mezclar suavemente la suspensión celular y extraer 200 μl en una jeringa de tuberculina. Deje la aguja en un lugar seguro donde permanecerá estéril.
    6. Coloque el ratón en una restricción y desinfectar la cola con alcohol isopropílico.
    7. Usando técnicas de inyección intravenosa estándar, 17 inyectan la suspensión de células humanas en la vena de la cola del ratón.
      NOTA: Las inyecciones de vena de la cola pueden tomar varios intentos, especialmente para un manipulador de animales novatos. Kovacscics y el video JoVE de Raper 19 proporcionan una demostración detallada de esta técnica animal.
    8. Supervise la recuperación del ratón durante ~ 5 min. Registre cualquier evento adverso durante la inyección ( por ejemplo , células derramadas, hemorragia mayor, trauma excesivo de la cola).
  3. Análisis del quimerismo celular humano en sangre periférica de ratón
    1. Obtener el sedimento de células sanguíneas que permanece en el tubo microtainer después de la separación del plasma (paso 5.2.3).
    2. Para la lisis de glóbulos rojos (RBC), resuspenda el sedimento de sangre restante en un volumen de PBS igual al plasma extraído (para reemplazar el volumen de plasma) y mezcle bien (vórtice / pipeta).
    3. Transferir cada muestra de sangre resuspendida a un tubo de 4 mL marcadoY luego a~nadir tampón de lisis de RBC a cada tubo en una proporción de 1: 9 (900 μl de tampón de lisis de RBC para 100 μl de sangre resuspendida). Incubar durante 5 min a RT. Centrifugar (5 min, 500 xg) y decantar.
    4. Realizar la segunda incubación del tampón de lisis de RBC (5 min a RT). Centrifugar y decantar como antes.
    5. Lave las células restantes en ~ 1 mL de PBS. Centrifugar y decantar como antes.
    6. Resuspender el gránulo en un volumen de PBS apropiado para tinción con citometría de flujo estándar (esto varía de acuerdo con el fabricante y los protocolos de laboratorio individuales). 20 Utilizar anticuerpos de inmunofenotipificación validados para la citometría de flujo para identificar células de ratón (CD45 + de ratón) y células humanas (CD45 + humano) 6 , 21 Así como marcadores adicionales de leucocitos humanos específicos del linaje celular de interés.
      NOTA: Se recomienda tomar un pequeño volumen (5 μL-20 μL) de cada muestra de ratón para crear "muestras agrupadas"; A utilizar para las muestras de control no teñidas, de viabilidad y de isotipo. Es la mejor práctica tener controles de isotipo y sin manchas para cada condición experimental.

7. Evaluación funcional de la actividad de las citoquinas in vivo

  1. Eutanasia y cosecha de tejidos
    1. Eutanasia de ratones vía asfixia con CO 2 en el punto de tiempo experimental designado.
    2. Cosecha de sangre mediante punción cardiaca y recolección de plasma según los pasos 5.2.1-5.2.2.
      NOTA: Recoja la sangre antes de otros tejidos porque comienza a coagular inmediatamente después de la muerte.
    3. Procesar la sangre del ratón, alícuota y almacenar el plasma como en el paso 5.2.2.
      1. En un momento posterior, evaluar la concentración de citoquinas exógenas en el plasma obtenido en la eutanasia mediante ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante. Evaluar y comparar las concentraciones de citoquinas exógenas en el plasma de ratón de la serie in vivoLa recolección de sangre y las muestras de plasma de eutanasia (descritas en la sección 5.3).
    4. Añada PBS a la muestra de sangre restante para reemplazar el volumen y proceso del plasma como se describe en los pasos 6.3.1 y 6.3.2. Realizar análisis de citometría de flujo de inmediato o resuspender las células en el medio de congelación para el almacenamiento de LN 2 .
  2. Cosecha de médula ósea (BM) y el bazo de ratones PDX y preparar suspensiones de células individuales como se describió anteriormente. 22
  3. Obtener el recuento de células para cada muestra de tejido de ratón PDX usando ácido acético al 3% con azul de metileno (lisa las membranas celulares y los glóbulos rojos dejando núcleos intactos de células vivas) en una dilución 1: 1 y cuente las células usando un hemocitómetro. Tabular los recuentos totales de células para muestras de médula ósea y bazo para cada animal.
  4. Centrifugar (500 xg, 15 min) suspensiones de células y decantar el sobrenadante. Realizar análisis de citometría de flujo de la médula ósea y / o células del bazo inmediatamente o resuspender en medio de congelación para LN 2 almacenamiento.
    NOTA: Congelar 10 alícuotas de BM (para futuros ensayos bioquímicos) y ~ 5 alícuotas de bazo (para futuros trasplantes de PDX) por ratón.
  5. Inmunofenotipificación para identificar efectos funcionales in vivo
    1. Preparar una mezcla maestra (MM) de anticuerpos de citometría de flujo para inmunofenotipo de población (s) hematopoyética (s) que responden a la citoquina de interés y un segundo MM de anticuerpos de control de isotipo ( Figura 5 y Tabla de Materiales).
    2. Descongelar partes alícuotas de tejido PDX (baño de perlas a 37ºC) preparadas en la etapa 7.4.
    3. Lave las células descongeladas transfiriéndolas a un tubo cónico y añadiendo al menos 3 veces el volumen de PBS. Centrifugar (500 xg, 5 min) y decantar el sobrenadante.
    4. Repita el paso de lavado (7.5.3).
    5. Crear alícuotas agrupadas tomando ~ 10 μL-20 μL de células de cada muestra de PDX para el control sin teñir, el control de viabilidad, y los controles de isotipo (véase el paso 6.4.6 nota). Mancha todas las muestras, excepto el uCon un colorante de viabilidad fijable (marcador de células muertas), se incuba y se lava de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    6. Mancha cada muestra de células PDX con fenotipificación-MM de acuerdo con el protocolo de tinción de citometría de flujo estándar; Manchan de manera similar la (s) muestra (s) de control de isotipo agrupada con el isotipo-MM. Incubar todas las muestras, lavar con PBS, y fijar las muestras por re-suspender en paraformaldehído al 1%.
    7. Recopilar datos de citometría de flujo y analizar los datos utilizando una estrategia adecuada para la (s) población (es) de células de interés ( Figura 5 ). Una puerta típica es la siguiente:
      1. Definir las células intactas mediante el dibujo de una puerta FSC y SSC que excluye los desechos.
      2. Identificar la población de células vivas gating en las células que son negativas para el marcador de células muertas (esto es el "total de células vivas").
      3. Utilizar sub-puertas dentro de las "células vivas totales" para definir las poblaciones de células con el inmunofenotipo deseado (ver Figura 5).
      4. Obtener elFrecuencia de las poblaciones de células de subconjuntos dentro del recuento de células vivas totales de análisis de citometría de flujo. 6 , 21
    8. Calcular el número de células diana en cada tejido multiplicando la frecuencia del subconjunto de células B, dentro de las células vivas totales (obtenidas en el paso 7.5.6.4) por el recuento de células vivas totales por tejido obtenido en el paso 7.3 (% del subconjunto de células B x " Hemocitómetro de células ", véase la Tabla 1 )
    9. Comparar los recuentos celulares de poblaciones de células diana entre ratones PDX de control y ratones PDX que expresan citocinas (TSLP +) para determinar los efectos funcionales in vivo de la citoquina humana exógena ( Tabla 1 ).

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Resultados

En la Figura 1 se muestra una visión general del modelo. Una vez que se han obtenido citocinas productoras (TSLP + estroma) y estroma de control se expanden en cultivo. Antes de la inyección de estroma en ratones, el sobrenadante de células estromales se evalúa por ELISA para verificar la producción de citoquinas ( Figura 2 ) y la citometría de flujo fosfo (Protocolo # 3) se utiliza para verificar la actividad de la citoquina producida por el estroma. El...

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Discusión

Este manuscrito describe un método simple, rápido y relativamente rentable para la ingeniería de PDX para expresar la citoquina humana exógena. La estrategia descrita aquí se basa en inyecciones intraperitoneales semanales de una línea celular de estroma transducida para expresar la citocina humana, TSLP. Antes de realizar los métodos descritos aquí, se generó estroma manipulado para expresar altos niveles de la citoquina de interés (TSLP) y estroma control controlado de forma similar. En los protocolos presentados aquí...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, una beca Hope Scholar de Hyundai Hope on Wheels, el Departamento de Patología y Anatomía Humana, el Departamento de Ciencias Básicas y el Centro de Disparidades de Salud y Medicina Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Loma Linda y por una Subvención para Promover la Investigación Colaborativa y Traslacional de la Universidad de Loma Linda (KJP). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los NIH.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
T-25 Nunc Cell Culture Tratado EasYFlasks, 7 mL de capacidad,   25cm² área de cultivoThermo Scientific / Fisher156367
T-75 Falcon Matraz Tratado con Cultivo de Tejidos, 250 mL de capacidad, 75 cm² área de cultivo y tapón ventiladoCorning Inc. / Fisher353136
Matraz tratado con cultivo de tejidos T-150 Falcon, capacidad de 600 mL, 150 cm² Área de Cultura & tapón ventiladoCorning Inc. / Fisher355001
pipetas serológicas de 10 mLFalcon357551
15 mL tubos cónicos de polipropilenoFisher05-539-12
Tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mLFalcon352054
50 mL tubos cónicos de polipropilenoFalcon352098
viales criogénicos de 2,0 mL, rosca externaCorning Inc. / Fisher4230659
puntas de pipeta de 1 mLFisher2707509
200 μ L puntas de pipeta Denville ScientificP3020-CPS
10 μ Puntas de pipetaen L Denville ScientificP-1096-CP
Unidades de filtro desechables estériles con membrana SFCA, Nalgene Rapid-FlowFisher09-740-28D
2 NH2SO4  BioLegend423001
Dulbecco' solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calicio ni magnesio, 1&veces;Corning cellgro/ Mediatech21-031-CV
Humano TSLP ELISA Max Deluxe SetBioLegend434204
3% Ácido Acético con Azul de MetilenoStemcell Technologies7060
Trypan Blue Corning25-900-CL
"Tripsina" 1x 0.25% Tripsina 2.21 mM EDTA en HBSSThermoFisher25-053
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP-7949
" R10" medio de cultivo celular, % del volumen total (rinde 565 mL)--Receta de laboratorio
RPMI, 88.5% (500 mL) Mediatech10-040-CV   
FBS, 9.9% (56 mL) Mediatech35-011-CV
L-Glutamina, 0.99% (5.6 mL) Mediatech25-005-CL
Penicilina-estreptomicina, 0,50% (2,8 mL) Mediatech30-002-Cl
2-Mercaptoetanol, 0,10% (560 µ L) MP190242
" R20" medio de cultivo celular, % del volumen total (rinde 195 mL)-<fuerte>Receta de laboratorio
        RPMI, 76.84% (150  mL)ver arribaver arriba
        FBS, 20.49% (40 mL)ver arribaver arriba
        2 mM de L-glutamina, 1.02% (2 mL)ver arribaver arriba
        1 mM de piruvato de Na, 1.02% (2 mL )ver arribaver arriba
        Penicilina-estreptomicina,  0.51% (1 mL)ver arribaver arriba
        2-Mercaptoetanol, 0,10% (0,1 M),  0,10% (200 y micro; L)véasemás arriba
" Medio de congelación", % del volumen total--Receta de laboratorio
" R10" medio, 45%ver receta "R10"-
FBS, 20%ver arriba35-011-CV
DMSO, 10%Corning25-950-CQC
D(-)(+)-Trehalosa dihidratada, 5%Fisher ScientificBP2687-100
NameCompanyCatolog Number Comments
Biologics 
"HS-27" HS-27A línea de estroma humanoATCCCRL-2496
"CALL-4" Línea celular MHH-CALL-4, leucemia precursora de células B humanasDSMZACC 337
" Ratones NSG" CABECEO. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, hombre o mujer, 6 años – 8 semanasJAX Ratones  # 005557
línea celular MUTZ-5, leucemia precursora de células B humanasDSMZACC 490
Proteína TSLP humana recombinanteR& D Systems1398-TS-010
NombreCompanyCatolog NumberComentarios
>Anticuerpos de citomería de flujo (clon)*
Anti-mouse CD45 FITC (30F11)Miltenyi Biotec130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (el nombre alternativo es IL-7Rα)Miltenyi Biotec130-098-094
CD34 APC (8G12)BD Biosciences340667
CD45 PE-Cy7  (HI30)eBioscience25-0459
"FVD" Tinte de viabilidad fijable  eFluor 780 eBioscience65-0865
Ig κ cadena ligera FITC  (G20-193)BD Pharmingen555791
Ig λ cadena ligera FITC (JDC-12)BD Pharmingen561379
IgD PE (IA6-2)BioLegend348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)BD Biosciences551079
pSTAT5 PE,  ratón anti-STAT5 (pY694)BD PhosphoFlow612567
Name CompanyCatolog NumberComments
Otros materiales y equipos& bsp;
Animal Implantable Nano Transpondedor con CánulaTrovan ID-100B(1.25)
Crema anestésica de lidocaína EMLA (obtenida por prescripción a través del centro de cuidado de animales)prescripciónprescripción
BD &12; cc LO-DOSE U-100 Jeringa de insulina 28G½  BD#329461
Tubos de Microtainer BD con K2EDTABD #365974
CentrífugaBeckman CoulterAlegra X-15R 
FisherBrand Tubos Capilares (Heparinizados)Fisher Scientific22-260-950
HemocitómetroFisher02-671-6
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
Jaula de pastel de ratónBraintree Scientific, Inc.MPC-1
Restrainer Iluminador de cola de ratónBraintree Scientific, Inc.MTI STD
Implantador de empuñadura de pistolaTrovan IM-300 (1.25)
y micro; Cuantita Bio-Tek Instruments Inc.MQX200
FlowJo software de análisis de citometría de flujoFlowJo, LLCVersión 10
* Todos los anticuerpos son antihumanos a menos que se indique lo contrario.
, , , , ,

Referencias

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