La cuantificación absoluta de Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; En el LCR utilizando un procedimiento de medición de referencia de espectrometría de masas

Resumen

Se describe un procedimiento de medición de referencia para la cuantificación absoluta de Aβ_1-42 en LCR humano basado en la extracción en fase sólida y la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida.

Resumen

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la enfermedad neurodegenerativa más común entre los ancianos y representa el 60-80% de todos los casos de demencia. En la actualidad, el diagnóstico de la EA se basa en pruebas cognitivas y exámenes del estado mental, pero el péptido beta-amiloide (Aβ) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) se utiliza cada vez más en ensayos clínicos y entornos. Al igual que para la mayoría de los biomarcadores de proteínas y péptidos, la cuantificación se realiza mediante técnicas basadas en anticuerpos, como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Sin embargo, la variabilidad intra e interlaboratorio de estos ensayos dificulta su uso como marcador diagnóstico en la rutina clínica.

Se desarrolló un Procedimiento de Medición de Referencia (RMP) independiente de anticuerpos basado en la extracción en fase sólida (SPE) y la cromatografía líquida (LC)-espectrometría de masas en tándem (MS/MS), donde se utilizaron péptidos Aβ estables marcados con isótopos como patrones internos, lo que permitió la cuantificación absoluta. Para las mediciones se utilizó un instrumento híbrido cuadrupolo-orbitrap de alta resolución. El método permite cuantificar el líquido cefalorraquídeo Aβ_1-42 entre 150-4.000 pg/mL.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más común de demencia y afecta a unos 35 millones de personas en todo el mundo ^1. Los signos neuropatológicos característicos de la enfermedad se cree ampliamente que se encuentran en el núcleo de patogénesis de la EA son los ovillos neurofibrilares intracelulares de proteína Tau hiperfosforilada y ² placas extracelulares que consisten en agregados de beta-amiloide (Aß) péptidos ^3. En línea con esto, la evaluación de la patología de la placa in vivo mediante biomarcadores recientemente se ha incluido en los criterios diagnósticos de in....

Protocolo

NOTA: Este protocolo requiere alícuotas de al menos 50 l, con una concentración de 50 mg / ml para cada péptido Aß, como material de partida. Los péptidos Aß se deben disolver en 20% de acetonitrilo (ACN) y solución concentrada de amoníaco 4% en agua desionizada (v / v) y se almacenaron a 80 ° C.

Precaución: Véase la Tabla 1 para información de seguridad.

1. Preparación de las soluciones

1. Preparar 100 ml de 20% de ACN y 4% de solución de amoníaco concentrado en agua desionizada (v / v) diluyendo 20 ml de ACN y 4 ml de amoniaco concentrado (~ 25%) en agua desionizada. Ajustar el volum....

Resultados

La configuración de la placa en la Figura 1 se utiliza para un plato lleno de muestras. Si se van a analizar un menor número de muestras desconocidas, el segundo calibrador, conjuntos de RF, y de control de calidad debe ser colocado después de la primera mitad de las muestras desconocidas.

Como se ve en la Figura 2, los calibradores se encuentran cerca de la línea de regresión, con bajas desvi.......

Discusión

Para el método descrito, en vez de usar una matriz sustituta, se utilizó el enfoque sustituto analito ^{13, 14, 15, 16,} que permite la calibración en CSF humano. El enfoque analito sustituto implica dos estándares marcados isotópicamente diferentes. Un ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ se utiliza para generar la curva de calibración en CSF humano, mientras que otro ⁽¹³ CAβ _142)<.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga Eppendorf Protein LoBind, 0,5 mL		Eppendorf
Eppendorf Protein LoBind, 1,5 mL		Eppendorf
Eppendorf Protein LoBind, 2 mL		Eppendorf
Eppendorf Protein LoBind, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Placas Eppendorf Protein LoBind Deepwell 96 Eppendorf		951032905
Micronic tubos de polipropileno de 0,75 mL,	MPW32071BC3	Micrónicos	utilizados para recoger el eluido de SPE, pero se pueden utilizar otros dispositivos de recolección, como placas de 96 pocillos.
Micronic Split TPE Capcluster para tubos de 96 pulgadas Micronic		MP53026	Caps para tubos Micronic.
Micronic Loborack-96 blanco con barra de cubierta alta codificada	Micronic	MPW51015BC3	Soporte para tubos Micronic.
Puntas Biohit Optifit 1,2 mL	Sartorius	791210	Se utiliza para llegar hasta el fondo de las placas de pocillos profundos LoBind (96 pocillos). Otras puntas estrechas también podrían funcionar.
Aguas Oasis MCX 96-pozo y micro; Aguas de placa de elución		186001830BA
Aguas Colector de placas bandeja de depósito	Aguas	WAT058942
Aguas Colector de placas de extracción para Oasis Placas de 96 pocillos	Aguas	186001831
solución de hidróxido de amonio, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 base	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrilo, grado de gradiente de HPLC UV lejano, 2,5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ácido ortofosfórico 85%, ACS, ISO, Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Clorhidrato de guanidina, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Espectrómetro de masas	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	Con Dionex Ultimate 3000 LC incluido y muestreador automático.
Dionex ProSwift RP-4H Columna monolítica (1,0 x 250 mm)	Dionex	066640
Albúmina sérica bovina, polvo liofilizado, adecuado para (para biología molecular),	Sigma-Aldrich	B6917
beta-amiloide no acetilado (1-42), ultra puro, TFA	rPéptido	A-1002-2
15N beta-amiloide (1-42),	rPéptido	A-1102-2
marcado uniformemente13C Beta-Amiloide (1-42), Agitadores	rPeptide	A-1106-2
uniformemente, TiMix 2	Edmund Bü HLER	6110 000

Tubos de microcentrífuga 022431081 Tubos de microcentrífuga 022431081 Tubos de microcentrífuga 022431102 tubos de con fondo en V de microplacas marcados