Artículo de método

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una In Vitro Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

DOI:

10.3791/55390

⸱

5 de abril de 2017

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1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos un modelo de barrera hematoencefálica humana que permite investigar in vitro la transmigración de linfocitos al sistema nervioso central.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

extravasación de linfocitos en el sistema nervioso central (SNC) es fundamental para la vigilancia inmune. alteraciones relacionadas con la enfermedad de extravasación de linfocitos podrían dar lugar a cambios fisiopatológicos en el SNC. Por lo tanto, la investigación de la migración de linfocitos en el SNC es importante entender las enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central y para desarrollar nuevos enfoques de terapia. Aquí presentamos un modelo in vitro de la barrera sangre-cerebro humano para estudiar la extravasación de linfocitos. células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC) se cultivan confluently en un tereftalato de polietileno poroso transwell insertar para imitar el endotelio de la barrera sangre-cerebro. La función de barrera es validado por zonula occludens inmunohistoquímica, la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) mediciones así como el análisis de evans permeación azul. Este modelo permite la investigación de la diapedesis de los subgrupos de linfocitos raros tales como CD56 CD16 brillante dim / - las células NK. Ademmineral, los efectos de otras células, citocinas y quimiocinas, alteraciones relacionadas con la enfermedad, y regímenes de tratamiento distintos sobre la capacidad migratoria de los linfocitos puede ser estudiado. Por último, el impacto de los estímulos inflamatorios, así como diferentes regímenes de tratamiento en la barrera endotelial pueden ser analizados.

Introducción

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la migración de linfocitos de la sangre a los tejidos es crucial para la vigilancia inmune. Una secuencia de interacciones moleculares específicas asegura sitio extravasación específico en el intestino delgado, piel, ganglios linfáticos, el sistema nervioso central (SNC), y otros tejidos 1. Las alteraciones en la migración de linfocitos están implicados en la fisiopatología de una serie de enfermedades de amplia difusión 2. Migración en la inmuno-privilegiado CNS está estrechamente regulada y, en consecuencia alteraciones de este proceso están involucrados en las enfermedades relacionadas con el SNC como la encefalomielitis 3, neuromielitis óptica, derrame cerebral y la esclerosis múltiple (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Por lo tanto, es importante estudiar la extravasación de linfocitos para entender mejor la fisiopatología de la enfermedad y el desarrollo de herramientas para una mejoramiento del terreno de carga 8, 9, 10, 11, 12 enfermedad.

Los linfocitos migran al SNC a través de rutas distintas. La extravasación a través de las vénulas postcapilares en el espacio subaracnoideo a través de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo dentro del plexo coroideo y través de la barrera sangre-cerebro se han descrito 1, 13, 14, 15. La migración a través de la barrera sangre-cerebro se lleva a cabo por la interacción de los linfocitos con las células endoteliales 14. En contraste a las células endoteliales en la periferia, las células endoteliales de la CNS expresan altas cantidades de moléculas de unión estrecha, con lo estrictamente limitando la cantidad de células y proteínas capaces de cruzar la barrera sangre-cerebrolass = "xref"> 16. resultados inflamación en el aflojamiento de las uniones estrechas e induce la expresión de moléculas de adhesión; por lo tanto, la mejora de la migración de linfocitos en el SNC 1, 17, 18.

La extravasación a través de la barrera sangre-cerebro es un proceso de múltiples pasos. Linfocitos de sujeción para las células endoteliales y luego rodar a lo largo del endotelio en un proceso mediado principalmente por las selectinas 1, 15. Posteriormente, las interacciones entre las quimiocinas secretadas por el endotelio y los respectivos receptores de quimioquinas expresados en los linfocitos inducen cambios conformacionales de las integrinas, promoviendo así la adhesión firme a las células endoteliales 1. Finalmente, los linfocitos o bien arrastre a lo largo de la barrera endotelial contra el flujo de sangre antes de transmigrando en el espacio perivascular, o detener inmediatamente y directamente transmigrate en el sitio de la firma de la adhesión 1, 19, 20. Todos estos pasos de extravasación de linfocitos pueden ser analizados in vitro usando técnicas distintas 21. Time-lapse microscopía de vídeo se utiliza para estudiar la inmovilización inicial y 15 de rodamiento. Ensayos de adhesión proporcionan información detallada acerca de la detención firme endoteliales barreras 22. Ensayos de transmigración como se demuestra aquí permiten el análisis de la transmigración de células inmune 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Uso de la humana en sangre modelo in vitro de barrera cerebro, recientemente hemos podido demostrar que un Migr mayorcapacidad Atory de CD56 CD16 brillante dim / - células NK en comparación con su CD56 dim CD16 + homólogos se reflejó por un predominio de este subconjunto de células NK en el compartimento intratecal 21. Por lo tanto, nuestra configuración experimental parece ser adecuado para imitar la situación in vivo.

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Protocolo

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1. Cultivo celular de cerebro humano Las células endoteliales microvasculares (HBMEC)

  1. Recubrimiento de matraces de cultivo celular
    1. Para preparar la solución de fibronectina, añadir 10 ml de PBS a un tubo de centrífuga de 15 ml. Añadir 150! L fibronectina y mezclar bien.
    2. Para cubrir la parte inferior de un frasco de cultivo de células T-25 Añadir 2 ml de la solución de fibronectina. Incubar el matraz de cultivo de células durante al menos 3 h a 37 ° C en la incubadora. Matraces recubiertos de fibronectina se pueden almacenar durante 2 semanas a 37 ° C / 5% de CO2.
  2. La siembra y cultivo de células de HBMEC
    1. solución de fibronectina Aspirar desde el fondo del matraz de cultivo celular. Añadir 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² en suspensión en 6 ml ECM-b medio (= ECM-b suplementado con 5% de suero bovino fetal, 1% de penicilina / estreptomicina y 1% de suplemento de crecimiento endotelial celular). Incubar a 37 ° C / 5% de CO2. Compruebe el crecimiento celular diariamente utilizando un microscopio.
    2. Cambiar el medio cada 3 días.Recoger o de células de división, cuando HBMEC alcanzan aproximadamente 80% de confluencia. HBMEC se debe utilizar entre el paso 1 y 15 para evitar la pérdida de propiedades fisiológicas.
  3. Cosecha HBMEC.
    1. Preparar Accutase solución mezclando Accutase (1x) con PBS en una proporción de 1: 1. Mantenga Accutase solución a 37 ° C en un baño de agua hasta su uso posterior.
    2. Transferencia ECM-b medio del matraz de cultivo celular a un tubo de centrífuga de 15 ml. Lavar HBMEC mediante la adición de 5 ml de PBS a la parte inferior del frasco de cultivo celular. Aspirar PBS y repetir la etapa de lavado dos veces más.
    3. Añadir 2 ml de solución pre-calentado Accutase. Incubar a 37 ° C durante 2 min. Después, HBMEC se resuspenden tocando firmemente el matraz de cultivo de células varias veces. desprendimiento de células se controla mediante un microscopio
    4. El ECM-b-medio almacenado previamente en un tubo de 15 ml se añadió de nuevo al matraz de cultivo celular tan pronto como se inicia HBMEC a separar. Enjuague el fondo del matraz varias veces hasta que la mayoría son HBMECre-suspendido.
    5. Transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y las células en 1 ml ECM-b medio resuspender. Recuento de células y diluir la suspensión de células para alcanzar una concentración final de 3 x 10 5 HBMEC por ml ECM-b medio.

2. Preparación de la Célula de Cultura Inserts

  1. Recubrimiento de insertos de cultivo celular
    Nota importante: Evitar tocar la membrana de los insertos de cultivo celular.
    1. Añadir 100! L solución de fibronectina (véase 1.1.1) para cada inserto de cultivo celular (Figura 1A) y un pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano (control óptico también). Incubar durante al menos 3 h a 37 ° C. Después de solución de incubación aspirado de fibronectina.
    2. Añadir 100 ml HBMEC suspensión a los insertos de cultivo celular y el control óptico también. Añadir 600 l ECM-b medio para el compartimiento inferior de la célulainsertos de cultivo. Incubar durante 3 - 4 días a 37 ° C / 5% de CO 2 hasta integridad de la barrera (Figura 1B) se alcanza, comprobar el crecimiento celular por evaluación microscópica de la HBMEC en el control óptico también. Nota: No se recomienda el crecimiento celular más allá de cuatro días.
    3. Opcional: Para imitar las condiciones inflamatorias Aspirar el medio desde el compartimiento inferior y reemplazarlo con ECM-b medio suplementado con 500 U / ml de IFN-γ / TNF-α 24 h antes el ensayo de migración.

3. Control de Calidad con azul de Evans en el Día del ensayo de transmigración

  1. Preparación de solución de azul de Evans
    1. Para preparar PBS / B27 mezcla de solución 10 ml de PBS con 200 l suplemento B27 usando un tubo de centrífuga de 15 ml. Diluir la solución madre de azul de Evans (20 mg / ml PBS) 1: 1000 con PBS / B27.
  2. ensayo de permeabilidad azul de Evans
    1. Aspirar el medio desde el compartimiento inferior seguido por el compartimiento superiorde un inserto de cultivo celular que contiene un confluente HBMEC monocapa. Añadir 100! L de solución de azul de Evans al inserto de cultivo celular.
    2. Añadir 600! L de PBS / B27 para el compartimiento inferior y se incuba durante 60 min a 37 ° C / 5% de CO2. Retire cuidadosamente la inserción de cultivo celular utilizando fórceps.
  3. medición de azul de Evans
    1. Retirar PBS / B27 desde el compartimiento inferior y transferir 100! L cada uno a dos pocillos de una poliestirol negro placa de 96 pocillos de fondo plano. Inserte la placa en un lector de placa Tecan Pro Infinito M200 y determinar z-posición óptima.
    2. Medida de excitación de azul usando ajustes respectivos Evans (por ejemplo: excitación: 620 nm, emisión: 680 nm, ancho de banda de excitación: 9 nm, ancho de banda de emisión: 20 nm, la mejora 175x, 25 parpadea, el tiempo de integración: 20 mu s).
    3. Para determinar las funciones de barrera HBMEC comparar datos adquiridos con una curva patrón que representa evans permeación azul a través HBMEC en diferentes puntos de tiempo después de semillacélulas ING (Figura 1B, derecha).

4. Ensayo de migración

  1. Preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
    1. Añadir 10 ml de RPMI en un tubo de centrífuga de 15 ml y añadir 200 l suplemento B27. Recuento de células PBMC y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Vuelva a suspender PBMC a una concentración final de 5 x 10 6 células / ml RPMI / B27.
  2. Puesta en marcha del ensayo de migración
    1. Medio Aspirar desde el compartimiento inferior seguido por el compartimiento superior de los insertos de cultivo de células que contienen confluente HBMEC monocapas (Figura 1A). Por donante añadir 100 l PBMC suspensión cada uno para los insertos de cultivo celular y también a un pocillo de una placa de 24 pocillos por (control in vitro).
    2. Añadir 600! L RPMI / B27 para el compartimiento inferior de los insertos de cultivo celular y 500 l a la PBMC del control in vitro y se incuba 6 horas a 37 ° C / 5% de CO2.
  3. La recolección de migrada PBMC
    1. Extraer el inserto de cultivo celular utilizando fórceps y enjuagar cuidadosamente la parte inferior con 400 l de PBS sin tocar la membrana. Desechar el inserto de cultivo celular.
    2. Añadir 20 l fluoroesferas de recuento de flujo (aproximadamente 1.000 cuentas / ml) al compartimento inferior del cultivo celular insertan así como para el control in vitro y se mezclan bien. Transferir 1 ml de resultante suspensión de PBMC a la citometría de flujo tubos.

5. Citometría de Flujo

  1. preparación de la muestra
    1. Centrifugar PBMC a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Preparar la solución de anticuerpo mediante la adición de anticuerpos conjugados con fluorocromo a 100! L de tampón citometría de flujo (/ EDTA mM PBS / 1% BSA 2) por muestra. Para los resultados presentados a continuación 1 l CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 l CD56-PC7, 1 l CD8-A700, y 1 l CD16-A750 se utilizaron por muestra.
    3. Resuspender PBMC en 100 l de la solución de anticuerpo y se incuba durante 30 min a 4 ° C.
    4. Añadir 250! L de tampón de citometría de flujo y se centrifuga a 300 xg durante 5 min.
  2. la adquisición de muestras
    1. Vuelva a suspender PBMC en la cantidad requerida (varía dependiendo de la citómetro de flujo utilizado) de citometría de flujo de tampón.
    2. Adquirir manchado PBMC usando un citómetro de flujo con un detector activo entre 525 y 700 nm de longitud de onda para detectar fluoroesferas de recuento de flujo (excitación 488 nm, emisión de 525 - 700 nm).
      (Los pasos siguientes son un ejemplo si se usa un flujo Gallios citómetro operado con software Kaluza G:. (1) Iniciar el equipo (2) Cuando el sistema operativo se ha cargado completamente, inicie el citómetro de flujo pulsando la tecla "citómetro en" botón . (3) Cargar el protocolo de adquisición respectiva pulsando el botón "protocolo abierto". (4) seleccione el protocolo requerido y seleccione "abrir". (5) Duplicar el protocolo para cada muestra haciendo clic con el derechobotón del ratón sobre el protocolo visible en el carrusel virtual y un clic izquierdo en el campo "duplicado". (6) Etiqueta de cada muestra en la lista de muestras. (7) Transferir las muestras a las posiciones indicadas del carrusel y comenzar la adquisición.)
  3. análisis de las muestras
    1. Abrir flujo resultante citometría de datos utilizando el software respectivo. Determinar el número de subpoblaciones de interés para transmigrado PBMC así como las células de los pocillos de control in vitro y fluoroesferas de recuento de flujo usando el software de análisis respectiva.
      (Un ejemplo de la estrategia de gating se da en la parte resultados (Figura 1 C: Para analizar la transmigración de los subconjuntos de células NK, primero seleccionar linfocitos en un canal de dispersión lateral (SSC) frente hacia adelante canal de dispersión parcela (FSC) Los linfocitos son. a continuación, muestran en una CD3 frente trama CD56 y CD56 + CD3 -. se seleccionan las células NK Para distinguir entre subconjuntos de células NK, las células NK se muestran enuna parcela CD56 frente a CD16 y CD56 CD16 brillante dim / - las células NK, así como CD56 dim CD16 + se seleccionan. Además, fluoroesferas de recuento de flujo se seleccionan de una parcela FSC frente a SSC y, posteriormente, se muestra en una parcela de un canal con una emisión entre 525 y 700 nm frente al tiempo para determinar su número).
    2. Para calcular el número total de células de cada muestra, normalizar el número detectado de las células usando fluoroesferas de recuento de flujo:
      figure-protocol-1
    3. Determinar el porcentaje de células migradas como la relación entre el total de células migradas y las células totales en el control in vitro.

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Resultados

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Se muestran los resultados representativos que muestran transmigración de las células NK y subconjuntos de células T utilizando el hematoencefálica modelo de barrera humana (Figura 1A). La integridad de la monocapa HBMEC fue validado por tinción de la molécula de unión estrecha mediciones de resistencia eléctrica transendotelial (TEER) ZO-1, y evans permeación azul (Figura 1B). Después de 3 - 4 días de cultivo HBMEC expresa la molécula de unión estrecha ...

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Discusión

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Aquí presentamos una técnica para investigar la transmigración de los linfocitos a través de la barrera sangre-cerebro humano. El análisis in vitro de la migración de linfocitos al SNC es importante para estudiar los procesos básicos de la extravasación de linfocitos, posibles alteraciones relacionadas con la enfermedad, y los nuevos enfoques terapéuticos.

Varias modificaciones del modelo de barrera hematoencefálica son posibles. Por ejemplo, las células del compartimiento ...

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Divulgaciones

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El autor o autores declararon los siguientes posibles conflictos de intereses con respecto a la investigación, autoría y/o publicación de este artículo: A.S.-M. y U.B. no tienen divulgaciones financieras. T. S.-H. recibió gastos de viaje y conferencias de Biogen. N.S. recibió honorarios de oradores y consejos asesores de Biogen y Novartis Pharma, así como gastos de viaje de Biogen. H.W. recibió una compensación por formar parte de los Consejos Asesores Científicos/Comités Directivos de Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis y Sanofi-Genzyme. También recibió honorarios de orador y apoyo de viaje de Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis y Sanofi-Genzyme. Recibió una compensación como consultor de Biogen, Merck Serono, Novartis y Sanofi-Genzyme. H.W. recibió apoyo para la investigación de Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Alemania y Sanofi US. C.C.G. recibió honorarios de orador y gastos de viaje por asistir a reuniones de Genzyme, Novartis Pharma GmbH y Bayer Health Care.

Agradecimientos

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Este estudio ha sido apoyado por el Centro de Investigación Colaborativa CRC TR128 "Iniciador/Efector versus Mecanismos Reguladores en la Esclerosis Múltiple-Progreso hacia el Abordaje de la Enfermedad" (Proyecto A9 a H.W. y C.C.G., proyecto B1 a N.S.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PBSGibco14190-094sin CaCl2 o MgCl2
Fibronectina 1 mg/mLSigmaF1141-5MGde plasma bovino
Matraz de cultivo celular T-25Greiner BioOne690160
HBMECScienCell1000
PelobiotechPB-H-6023
AccutaseSigmaA6964-100ML
ECM-bScienCell1001-b
FBS ScienCell1001-b
Penicilina/EstreptomicinaScienCell1001-b
Suplemento de crecimiento de células endotelialesScienCell1001-b
TranswellCorning3472transparente, 6,5 mm de diámetro, 3,0 & micro; m tamaño de poro
placa de fondo plano de 96 pocillosCorning3596
Evans azulSigmaE2129-10Gsolución madre: 1 g/50 mL PBS
B27Gibco17504-04450x concentrado
Infinite M200ProTecan
96-pocillos negro placa de fondo planoGreiner BioOne675086
48 pocillosCorning3526
RPMI 1640Gibco61870-010
Fluorosferas de conteo de flujoBeckman Coulter7547053
Na-EDTASigmaE5134
BSASigmaA2153
Gallios Citómetro de flujo de 10 coloresBeckman Coulter
Kaluza 1.5aBeckman Coulter
TNF-y alfa;Peprotech300-01A
IFN-y gamma;Peprotech300-02
CD3-PerCP/Cy5.5Biolegend300430clon UCHT1
CD56-PC7Beckman CoulterA21692clon N901
CD16-A750Beckman CoulterA66330clon 3G8
CD4-FITCBiolegend300506clon RPA-T4
CD8-A700Beckman CoulterA66332clon B9.11

Referencias

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