Summary
В этой работе мы приводим новый метод для изучения взаимодействия протеин протеина, с помощью conductimetric биосенсор на основе гибридной технологии β-лактамаз. Этот метод полагается на выпуск протонов после гидролиза β-лактамы.
Abstract
Биодатчики становятся все более важным и реализованных в различных областях, таких как обнаружение возбудителя, молекулярной диагностики, мониторинга окружающей среды и продовольственной безопасности управления. В этом контексте мы использовали β-лактамаз как эффективный репортер ферментов в нескольких исследованиях взаимодействия протеин протеина. Кроме того их способность принимать вставки пептидов или структурированные белки/домены решительно поощряет использование этих ферментов для создания химерных белков. В недавнем исследовании мы вставлен фрагмент одного домена антитела в Bacillus licheniformis я β-лактамаз. Эти небольшие доменов, также называемые nanobodies, определяются как антиген связывая доменов одной цепи антител от верблюдовых. Как общие антитела двойной цепи они показывают, высокой работоспособностью и специфики для их целей. Результате химерных белка выставлены высоким сродством против цели при сохранении активности β-лактамаз. Это свидетельствует о том, что наночастицы и β-лактамаз постановление остаются функциональными. В настоящей работе мы доклад подробный протокол, который сочетает в себе наш гибридной системы β-лактамаз биосенсор технологии. Конкретные привязки наночастицы своей цели могут быть обнаружены благодаря conductimetric измерение протонов, выпущенное каталитической активности фермента.
Introduction
Биодатчики, аналитических приборов, которые сочетают био молекулярная взаимодействия с физическими или химическими сигнализаторы, именуемый преобразователи1. Записанные сигналы можно затем интерпретировать и преобразованы в контролировать взаимодействие между партнерами, подвижности и бесплатные. Большинство биодатчиков используют антитела для обнаружения аналитов, например гормоны или маркеры различных патогена2. Датчик различные форматы могут быть использованы и включают на основе массы, магнитных, оптических или электрохимические биодатчиков. Последние относятся к числу наиболее часто используемых датчиков и функции путем преобразования привязки событий в электрический сигнал. Выступления и чувства всех биосенсоры на основе антител сильно зависит по сути два параметра: i) качество антитела и ii) свойства системы, используется для генерации сигнала2.
Антитела являются высокой молекулярной массы димерной белки (150 – 160 кДа), которые состоят из двух легких цепей и двух тяжелых цепей. Взаимодействие между легкими и тяжелыми цепями основном стабилизирована гидрофобных взаимодействий, а также сохранены дисульфидными облигаций. Каждая цепь включает переменной домен, взаимодействующий с антигеном по существу через три гипервариабельных регионов, названный взаимодополняющих определения регионов (CDR1-2-3). Несмотря на многочисленные достижения в этой области, крупномасштабные выражение полнометражного антител с лоу кост выражение системами (например, кишечной палочки) часто приводит к производству нестабильных и агрегированных белков. Именно поэтому различные фрагменты антител разработаны такие как сингл цепь переменной фрагменты3 (ScFvs ≈ 25 кДа). Они состоят из переменной доменов соответственно один из тяжелых и один легкие цепи, которые связаны ковалентно синтетических аминокислотной последовательности. Однако эти фрагменты часто отображения бедных стабильности и имеют тенденцию к совокупности, поскольку они предоставляют большую часть их гидрофобные регионах растворителя4. В этом контексте одной цепи верблюдовые фрагментов антитела, называют nanobodies или VHHs, похоже отличные альтернативы ScFvs. Эти домены соответствуют переменной домены верблюдовые сингл цепь антител. В отличие от обычных антитела антитела верблюдовые лишены легких цепей и содержать только две тяжелые цепи5. Таким образом nanobodies являются наименьшей мономерных антитела фрагменты (12 кДа) способны связывать к антигену с сродство похож на обычного антитела6. Кроме того они представляют, улучшена стабильность и растворимость, по сравнению с другими полнометражного антител или фрагментов антитела. Наконец их малых размеров и их расширенные петли CDR3 позволяют им признать загадочные эпитопов и привязка к фермента активных сайтов7,8. В настоящее время эти домены получают значительное внимание и были объединены в биосенсор технологии. Например, Хуан и др. разработали на основе наночастицы биосенсора для обнаружения и количественного определения человека простат специфический антиген (PSA)9.
Как упоминалось выше важным параметром в анализов биодатчик является эффективность системы, используемая для создания электрического сигнала. По этой причине на основе ферментов электрохимических биодатчики привлекают все большее внимание и широко используются для различных приложений таких, как здравоохранение, продовольственная безопасность и мониторинг окружающей среды. Эти биодатчики полагаются на каталитического гидролиза субстрата ферментом для генерации электрического сигнала. В этом контексте чтобы быть более конкретным, более чувствительную и легче реализовать, чем многие другие ферменты, такие как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена10экспериментально были показаны β-лактамаз. Β-лактамаз являются ферменты, которые отвечают за бактериальной резистентности к β-лактамные антибиотики, ГТФ их. Они являются мономерных, очень стабильных, эффективных и небольших размеров. Кроме того домен/пептид вставок в β-лактамаз генерировать Би функциональные химерных белки, которые оказались эффективными инструментами для изучения взаимодействий протеин лиганд. Действительно недавние исследования показали что включение переменной фрагментов антитела в результаты β-лактамаз ТЭМ1 в химерных белок, который по-прежнему способны связывать с высоким сродством к своей целевой антигена. Интересно, что было показано антиген-связывая побудить аллостерический регулирование ТЭМ1 каталитической активности11,12. Кроме того мы показали в нескольких исследованиях вставки домен белка в разрешительной петлю Bacillus licheniformis я β-лактамаз создает функциональные химерных белки, которые хорошо подходят для отслеживания взаимодействий протеин лиганд13 ,14. Мы недавно вставлены наночастицы, названный кабины Lys3, в этом разрешительной вставки сайт я15. Этот наночастицы было показано для привязки к курица яичного белка лизоцима (HEWL) и подавлять свою ферментативную активность16. Мы показали, что созданные гибридный белок, именем я такси Lys3, сохраняется высокая специфичность / сродство против HEWL в то время как активность β-лактамаз оставалась без изменений. Затем мы успешно объединены β-лактамаз гибридные технологии электрохимический биодатчик и показал, что количество создаваемых электрического сигнала зависит от взаимодействия между я такси Lys3 и HEWL, иммобилизованных на электрод. Действительно гидролиз β-лактамные антибиотики, я индуцирует Протон выпуска, который может быть преобразован в количественных Электрический сигнал. Эта комбинация гибридной технологии β-лактамаз с электрохимический биодатчик быстро, чувствительных, количественных и позволяет в реальном времени измерения генерируемого сигнала. Эта методология описана здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. белка Подготовка образца
- Производить и очистить гибридного белка я такси Lys3 как отмечалось в наших предыдущих исследования15. Хранить белка в 50 мм фосфатного буфера рН 7,4 в следующем составе: 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4 и 0,24 г х2PO4 растворяют в 800 мл дистиллированной воды исправить рН раствора до 7,4 до Регулировка громкости окончательного решения к 1 л фильтр стерилизовать раствор белка.
- Готовить курицу яичный белок лизоцим (HEWL) раствор. Растворите 100 мг (40 000 единиц/мг) коммерчески приобретенных HEWL 10 мл фосфатный буфер (PBS см шаг 2.1.1). Стерилизация раствора белка фильтрация с помощью фильтров с 0,22 мкм отсечки.
2. биосенсор анализов
-
Подготовка раствора и буфера
- Подготовка 50 мм PBS, растворяя 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4и 0,24 г х2PO4 800 мл дистиллированной воды. Приспособиться к рН 7,4 с 1 N HCl или 1 N NaOH прежде чем корректировать объем раствора на 1 л фильтр стерилизовать и хранить при 4 ° C.
- Приготовляют раствор насыщенность/блокирование путем растворения 3 g Гидролизат казеина в 100 мл PBS, подготовленных как описано выше (см. шаг 2.1.1). Фильтр стерилизовать и хранить при 4 ° C.
- Приготовляют раствор привязки, растворяя 1 g Гидролизат казеина в 100 мл PBS, подготовленных как описано выше (см. шаг 2.1.1). Фильтр стерилизовать и хранить при 4 ° C.
- Приготовить моющий раствор (0,1% анимации - PBS), добавив 100 мкл Tween-20 (100%) в 100 мл PBS, подготовленных как описано выше (см. шаг 2.1.1). Хранить при 4 ° C.
- Подготовить электрода для приготовления раствора (1% тритон X-100-PBS), добавив 1 мл X-100 Тритон (100%) в 100 мл PBS, подготовленных как описано выше (см. шаг 2.1.1). Хранить при 4 ° C.
- Подготовить раствор регенерации электрода (3,5 М KCl) путем растворения 26 g KCl в дистиллированной воде в окончательный объем 100 мл. Фильтр стерилизации и хранить при 4 ° C.
- Подготовить 5 мм раствор NaCl, растворяя 0,29 г NaCl в дистиллированной воде в окончательный объем 1 л фильтр стерилизовать и хранить при 4 ° C. Затем приготовляют раствор обнаружения (бензилпенициллин 4 мм), растворяя 26,7 мг бензилпенициллина в 20 мл 5 мм раствор NaCl. Фильтр стерилизовать и хранить при температуре от-20 ° C.
-
Датчик приготовления и регенерации
Примечание: Полианилин покрытием датчик чипов были разработаны и любезно предоставленных д-р P. Bogaerts, д-р S. Юнус и профессор ю. Glupczynski (католического университета в Лувен ла Нев - Чу Мон-Godinne). Описание датчика, а также полианилин электро полимеризации протоколы, используемые для синтезировать эти датчики подробно изложены в их предыдущей работы17. Вкратце эта система использует Многоразовые датчики восемь отдельных чипов, которые были изготовлены методами классической печатной платы (PCB). Отдельные чипы состоят из трех электрода круглые пятна. Верхний является рабочих электродом на котором полианилин был синтезирован электро. Средний электрод сравнения и нижней электрод является счетчик электрода. Как ссылка, так и Счетчик электроды являются функционализированных с помощью твердых Ag/AgCl амальгама поверх слоя углерода.- Выполняют 3 моет электродов, опуская советы в скважины 96-луночных пластины, содержащий 300 мкл/хорошо электрода приготовления раствора (см. 1% тритон X-100-PBS, шаг 2.1.5.). Выполните каждый мыть на 2 мин с нежным смешивания при комнатной температуре.
- Ополосните электроды, опуская советы в скважины 96-луночных пластины, содержащий 300 мкл/хорошо дистиллированной воды на 2 мин с нежным смешивания при комнатной температуре.
- Регенерировать электродов, опуская советы в скважины 96-луночных пластины, содержащий 300 мкл/хорошо регенерации раствора (см. 3.5 M KCl, шаг 2.1.6) на ночь при 4 ° C или 1 ч при комнатной температуре.
- Выполнять 3 моет электродов, опуская советы в скважины 96-луночных пластины, содержащий 300 мкл/колодец фосфатный буфер (см. шаг 2.1.1.). Выполните каждый мыть за 2 минуты с нежным смешивания при комнатной температуре.
-
Привязка пробирного выполнена на датчик
- Пальто HEWL на Пани (полианилин) поверхность электрода путем сдачи на хранение 15 мкл капля 40 мкг/мл HEWL, подготовленный в PBS на поверхность электрода. Инкубируйте на ночь при 4 ° C или 1 час при комнатной температуре.
- Выполните три автомойки электродов с фосфатный буфер (см. шаг 2.1.1) путем погружения электродов части обломоки датчика в скважины 96-луночных пластины, содержащий 300 мкл/колодец фосфатный буфер. Выполните каждый мыть на 2 мин с нежным смешивания при комнатной температуре.
- Насыщают электродов, добавляя 50 мкл падение блокирования решения (см. шаг 2.1.2) на поверхности электрода. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре. Затем вымойте три раза, как описано в предыдущем шаг (см. шаг 2.3.2).
- Разбавить раствор я такси Lys3 до 20 мкг/мл в обязательную силу решение (см. шаг 2.1.3) и применить капли 15 мкл этой разбавленный раствор на электроды. Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре. После реакции антиген наночастицы, мыть три раза как описано на предыдущем шаге, с использованием вымойте решения (см. шаг 2.1.4). Затем промойте электрод с PBS (см. шаг 2.1.1).
- Для обнаружения Подключите датчик чип через часть медь схемотехника для цифровой мультиметр. Затем, инициировать датчик ответ путем нанесения капли 50 мкл раствора обнаружения (см. шаг 2.1.7) на положительные электроды и нанесения капли 50 мкл раствора NaCl 5 мм на отрицательные электроды, (см. шаг 2.1.7). Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре. Контролировать проводимости с цифровой мультиметр.
Примечание: Мультиметр была предоставлена д-р P. Bogaerts, д-р S. Юнус и профессор ю. Glupczynski (католического университета в Лувен ла Нев - Чу Мон-Godinne. Этот потенцио управляется компьютером через USB-порт и анализирует восемь различных обломоки датчика одновременно. Программное обеспечение, созданное Юнус и коллеги17 создает в реальном времени участок, представляющий измерения проводимости разницу между ссылку и образцы электродов против времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дизайн и инженерия химерных белка я кабины Lys3
Рисунок 1 представляет включение cAb-Lys3 в цикле разрешительных BalP класс A β-лактамаз из Bacillus licheniformis. Вставки была выполнена между Asp198 и Lys199 остатков. На сайте расщепления тромбина была введена на каждой стороне кабины Lys3. Клетки превращается с учредительным выражение плазмида, шифруя протеин химерных я кабины Lys3 имели возможность расти в присутствии небольшой концентрации ампициллина. Этот результат означает, что гибридные β-лактамаз растворим, правильно сложить и может быть успешно экскретируется в Периплазматическое пространство бактерий, где он может эффективно предоставлять сопротивление против ампициллин. Мы также проанализировали bifunctionality нашей химерных белка. Как указывалось в наших предыдущих исследований, наши данные показали, что β-лактамаз, а также кабины Lys3 постановление химерных белка сохранить их биологической деятельности15.
Conductimetric биосенсор пробирного
Датчик чипов для этот assay показано на рисунке 2. Датчики, используемые для этих экспериментов содержат 8 чипов. Каждый чип содержит три электроды: один из рабочих электродом, один борьбе с электрода и ссылку на один электрод. Эти 8 чипы организуются как 4 пары в датчике. Для каждой пары, один из чипов с надписью «-» соответствует отрицательный контроль, в то время как чип надписью «+» соответствует испытуемого образца.
Рисунок 3 представляет собой схематическое описание экспериментальной установки, используемые в этой работе, которая сочетает в себе технологии β-лактамаз гибрид для потенциометрических биодатчик. В этом случае используются два электрода: i электрод сравнения и ii) с покрытием электрода полианилин (ПАНИ). HEWL адсорбированные на покрытых электродов Пани, как сообщалось в других исследованиях18,19. После надлежащего моет, я кабины Lys3 (для «+» помечены чипов) или я без вставленной наночастицы (для «-«помечены чипов) применяются на электродах. После добавления β-лактамные (бензилпенициллин) на электродах измеряются изменения проводимости электрода. Действительно β-лактамные гидролиза, β-лактамаз генерирует выхода протонов; который был показан для создания значительных изменений в проводимости электрод с очень короткий ответ время. Биосенсор анализов, представлены на рисунке 4 указывают что привязки я такси lys3 для HEWL, иммобилизованных на электроде Пани можно обнаружить и контролируется путем измерения выпуска Протон, результатом деятельности иммобилизованных β-лактамаз. В противоположность этому при эксперимент проводился с я без каких-либо вставлена наночастицы была обнаружена разницы проводимости.
Рисунок 1: схема, представляющая химерных белка я такси Lys3 взаимодействия с HEWL. Я показано в голубой, кабина Lys3 в оранжевый и HEWL синим цветом. Эта цифра была получена путем комбинирования трехмерных структур я (PDB ID: 4BLM) и комплекс кабины Lys3/HEWL (PDB ID: 1MEL). Β-лактамаз содержит 2 доменов: α/β и доменом α, стимулирующую сайт расположен на стыке между обоими доменами. Цикл, используемый для вставки выделены желтым цветом и расположены в цикле воздействию растворителей в домене α. N - и C-терминал части кабины Lys3 показаны красным цветом. Цикла CDR3 из кабины Lys3 делает большинство контактов с сайтом HEWL катализатора. Связывание кабины Lys3 для HEWL ингибирует ферментативную активность. Эта цифра и представленные здесь результаты были опубликованы в нашей предыдущей работы15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: фотография используется в эксперименте датчика. Каждый датчик включает в себя группу 8 отдельных чипов. На каждой фишке, существует три электроды: один из рабочих электродом, электрод сравнения и электроде Ион счетчика. Медь охватывает часть подключен к цифровой мультиметр, подключенный к компьютеру. Отдельные чипы организуются в виде 4-х пар где»-«помечены чипы отрицательный контроль электродов и «+» обозначенные чипы являются образцы электродов. Эта установка позволяет различные экспериментальные реплицирует или HEWL / β-лактамаз концентрации испытываемого одновременно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Схематическое представление экспериментальной установки, используемые в наших биосенсор assay. HEWL была иммобилизованных на Пани (полианилин) с покрытием электрода. Химерных белка я такси Lys3 затем применяется на электрод. Иммобилизованных β-лактамаз деятельность, которая определяется путем измерения выпуска протонов, вызванных гидролиза бензилпенициллин, прямо пропорциональна взаимодействия между HEWL и химерных белка. Протон релиз вызывает изменения электрическая проводимость, которые преобразуются в сигнал, который может интерпретироваться пользователем. Эволюция проводимость разница наблюдается между Пани покрытием и электрод сравнения как функцию от времени. Эта цифра и представленные здесь результаты были опубликованы в нашей предыдущей работы15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: графическое представление conductimetric измерения показаны специфическое взаимодействие я такси Lys3 HEWL. Добавление бензилпенициллин обозначается стрелкой. Эта разность результатов от выпуска Протон, происходящих после антибиотикотерапии гидролиза. Измерения проводились с гибридный белок я такси Lys3 (красный) и родной β-лактамаз я без каких-либо вставлена наночастицы (синий), как отрицательный контроль. Различные кривые представляют независимые измерения выполняются на различных фишек. Эта цифра и представленные здесь результаты были опубликованы в нашей предыдущей работы15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе мы представляем метод functionalize наночастицы, используя я β-лактамаз как перевозчика белка и мы показываем, что мы можем успешно реализовать полученный гибридного белка в assay потенциометрических датчиков. Главное нововведение аспект нашей работы, по сравнению с другими биосенсор анализов является ковалентной соединительной части антитела к ферментативной активности, который генерирует электрический сигнал. Эта технология вставки так называемые белка представляет преимущества и ограничения, которые будет основной темой данного раздела.
Преимущества технологии гибридных β-лактамаз.
Β-лактамаз являются эффективным ферментов
Одним из наиболее важных параметров, которые влияют на чувствительность и соотношение сигнал шум биодатчик является ферментативной активности, используется для генерации сигнала. В этом контексте, β-лактамаз представить ряд преимуществ: они являются малые (≈29 кДа), мономерных, очень стабильный и более важно, демонстрируют высокой удельной активности и высокой текучести кадров, по сравнению с другими ферментов, используемых в потенциометрических датчиков анализов например глюкозы Оксидаза, уреазы, липаза, пероксидаза или щелочной фосфатазы20. По всем этим причинам β-лактамаз являются ферменты выбора для различных анализов биодатчик.
Прямое включение в β-лактамаз может улучшить доходность производства и стабильности вставленной белка/домена.
Один из ограничивающих аспектов многих immunosensor анализов является качество (например, стабильность, чистоты) антитела используются для обнаружения аналита2. В настоящее время систем низкой стоимости производства антител или фрагменты антител (например, кишечной палочки) остается сложной и часто приводят к агрегированных белки с плохой растворимости и стабильности21. Наша технология β-лактамаз гибрид, как представляется, хороший подход к преодолению этих трудностей, поскольку ранее мы показали, что эта стратегия улучшает выражение урожайности и стабильность вставленной белков доменов14. В частности в настоящем исследовании, используя нашу систему β-лактамаз гибрид, химерных белок, именем я такси Lys3 был успешно выражена в E. coli с очень хороший урожай (≈10 мг чистого белка на литр культуры) и очищен до однородности.
Ковалентная связь между антителом и ферментативные постановление делает дешевле и быстрее датчик анализов
В обычных immunosensors обнаружение аналита требует использования первичных антител, которые иммобилизованных на чипе датчика. Впоследствии вторичное антитело, которое сочетается фермента или помечены зонд также требуется для создания измеримых сигнала. Этот подход включает в себя несколько инкубаций и стиральная шаги и поэтому может занять много времени. Кроме того этот протокол является дорогостоящим, поскольку требуются несколько антител и ковалентной связью между вторичные антитела и фермента/зонд также необходима. В противоположность этому наша система использует гибридный белок только для выявления и количественной оценки аналита и поэтому позволяет в реальном времени мониторинг без использования вторичных антител.
Кроме того важно отметить, что домен вставки класс, β-лактамаз был показан для создания гибридных белки экспонируется аллостерический переключатель подобное поведение22,23. Такие коммутаторы могут найти множество приложений в биосенсор на основе анализов.
Ограничения β-лактамаз гибридной технологии.
Ограничений, вызванных белка инженерии.
В этой системе основная трудность заключается в разработке и получить гибридный белок, вставив общие антитела в β-лактамаз. Этот результирующий химерных белка должно быть бифункциональных: энзимный группу должна оставаться возможность эффективно гидролиз β-лактамные антибиотики для генерации электрического сигнала, тогда как общие антитела должны привязываться к целевой аналита с высоким сродством и специфика. Чтобы получить бифункциональных химерных белков, различные параметры должны рассматриваться для того, чтобы избежать их пространственной ограничений. Первая критическая точка является позиция вставки сайте. Хотя было показано, что несколько точек вставки являются возможные24,25,26, вставки, которые позиции часто находятся в растворителе воздействию циклов вдали от активного узла перевозчика белка. Это минимизирует потенциальные конформационные изменения или их пространственной помех, вызванных вставленной белка. По тем же причинам рекомендуется также, что на активном узле вставленной белка быть расположен вдали от вставки сайт с целью предотвращения изменения своей деятельности. Наконец будет лучше переносится вставки белков, которые представляют конечностей гибкие или соседних N - и C-терминала. Действительно далекой и жесткой конечностей может их пространственной ограничения на обоих партнеров химерных белка и таким образом изменить их соответствующей биологической деятельности. Таким образом важно отметить, что размер вставленного белка имеет только незначительное влияние на результате химерных белка. Действительно было показано, что больших структурированных домены могут быть успешно вставлены в β-лактамаз, до тех пор, пока их N - и C-терминал конечностей являются гибкими или рядом друг с другом13,14,2, 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. в настоящем исследовании, вставки сайт в я расположен вдали от своего активного узла и вставленных наночастицы имеет сравнительно длинный и гибкий конечностей (не виден в структуре рентген), которые расположены далеко от paratope. Эти особенности убедитесь, что минимальное их пространственной ограничения на биологически активных поверхностей обоих партнеров гибридного белка. Однако когда вставленный белка не представляют Рекомендуемые критерии для оптимального вставки перевозчика белка, возможна инженер компоновщика регионов с целью снижения потенциальных их пространственной ограничений. Действительно было показано наличие гибкого компоновщик (например Gly-Ser повторений) для подключения перевозчика и вставленных белка резко увеличить толерантность к вставки больших и структурированные белки в перевозчик, один30 ,12.
Ограничения, присущие электрохимические биосенсорах.
Хотя разработка электрохимических/потенциометрическое биодатчики стал постоянно растущего поля, эти анализы имеют важные ограничения, которые необходимо учитывать при проектировании биосенсор эксперимент. Во-первых, все биодатчики, включающие H+ -релиз или поглощения требуют использования очень слабо буферизации решений (т.е. < 5 мм)31 для того чтобы измерить значительные потенциальные различия. Вариация рН, индуцированной освобождении H+ может повлиять на свойства белков и ферментативной активности, используется для генерации сигнала. Во-вторых рН и ионной силы в biofluids может значительно различаться и следовательно привести важные различия в ответ и увеличить фоновый шум биодатчики32. Вот почему, различных исследовательских групп пытались разрабатывать нанотехнологии для уменьшения размеров элементов Электрохимический датчик для того чтобы увеличить соотношение сигнал шум для процессов, которые происходят в интерфейсе устройства33, 34 , 35. как следствие, это также возможно развивать молекулы антитела, помечены с несколькими молекулами же фермент для увеличения сигнала, результатом связывания одной молекулы для своей целевой32. Однако несмотря на эти ограничения, кондуктометрические/биодатчики остаются весьма эффективным и чувствительных устройств с оценкам пределов обнаружения (LOD ' ы) в диапазоне от 10-8 до 10-11 M36.
В этом исследовании, мы показали, что мы успешно можно вставить наночастицы, использующий HEWL в класс A β-лактамаз именем я, и что сгенерированный гибридного белка сохраняет как биологической деятельности: i) жесткой привязки HEWL и ii способность гидролиз Β-лактамные антибиотики. Это исследование представляет собой доказательство концепции для вставки различных nanobodies или антитело фрагментов в я и осуществление этой гибридной технологии белка в потенциометрических датчиков анализов. Эта технология может быть потенциально используется для обнаружения различных эпитопов белка и реализована в многочисленных диагностических инструментов. Действительно развитие и эффективное использование таких анализов стали решающую роль в нашем обществе и по существу обусловлен социально-экономических потребностей для лоу кост и легко управлять технологиями в различных областях, таких как продукты питания и систем здравоохранения, особенно в развивающихся стран. Кроме того нанотехнологии играют все большую роль в развитии таких датчиков. В настоящее время на портативных устройствах, таких как смартфоны и планшеты и различных смартфон приложений уже существуют для обработки сигнала37доступны технологии обработки сигнала. Например недавно, потенциометрических датчиков устройство интегрирована в смартфон, чтобы позволить контроля38концентрации глюкозы. Эксперты в области здравоохранения уверены, что эти виды инновационных устройств станет важнее здоровья решения в ближайшие годы39,-40.
В заключение эта работа представляет собой пример, который показывает потенциал и преимущества нашей технологии вставки белка. Мы надеемся, что эта работа будет способствовать разработке инновационных и полезных технологий для научных и медицинских целях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают, Валлонский регион Бельгия в рамках исследовательских проектов SENSOTEM и NANOTIC, а также национальные фонды для научных исследований (Ричмонд-F.N.R.S) за их финансовую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L.
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D'Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E.
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).
