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La identificación de un epítopo lineal de células B reconocido por anticuerpos monoclonales péptido Escaneo-asistida

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DOI:

10.3791/55417

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24 de marzo de 2017

 , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

En este artículo

Resumen

Aquí, los autores presentan un protocolo simple y eficiente para definir un epítopo antigénico lineal utilizando un anticuerpo monoclonal purificado y escaneo de péptidos a través de hibridación dot-blot. El epítopo identificado puede utilizarse en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.

Resumen

La identificación de un epítopo antigénico por el sistema inmune permite la comprensión del mecanismo de protección de anticuerpos neutralizantes que pueden facilitar el desarrollo de vacunas y fármacos peptídicos. de barrido de péptidos es un método simple y eficiente que los mapas de forma directa el epítopo lineal reconocido por un anticuerpo monoclonal (mAb). A continuación, los autores presentan una metodología de determinación epítopo participación de las proteínas truncadas recombinantes en serie, el diseño de péptidos sintéticos, y la hibridación dot-blot para el reconocimiento antigénico de la proteína de cubierta del virus de la necrosis nerviosa utilizando un anticuerpo monoclonal neutralizante. Esta técnica se basa en la hibridación dot-blot de péptidos y mAbs sintéticos sobre una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La región antigénica mínima de una proteína de la cubierta viral reconocido por el RG-M56 mAb puede ser reducido a paso a paso recortado mapeo de péptidos en un péptido epítopo 6-mer. Además, barrido de alanina y mutagénesis residuo subinstitución puede llevar a cabo para caracterizar el significado unión de cada residuo de aminoácido que compone el epítopo. Se encontró que los residuos que flanquean el sitio epítopo para jugar un papel crítico en la regulación del péptido conformación. El péptido epítopo identificado puede ser utilizado para formar cristales de complejos de péptido-anticuerpo de epítopo para un estudio de difracción de rayos X y la competencia funcional, o para la terapéutica.

Introducción

En el sistema inmune, la recombinación de los segmentos V, D y J permite anticuerpos para crear enormes variaciones de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) para la unión a diversos antígenos para proteger al huésped de la infección patógena. La defensa de neutralización de anticuerpos contra los antígenos depende de la complementariedad espacial entre las CDR de los anticuerpos y los epítopos de los antígenos. Por lo tanto, la comprensión de esta interacción molecular ayudará diseño vacuna profiláctica y desarrollo de fármacos péptido terapéutico. Sin embargo, esta interacción de neutralización puede estar influenciada tanto por múltiples dominios antigénicos de un antígeno único y de múltiples CDR de anticuerpos, que en consecuencia hacen que el proceso de determinación de epítopo más complejo. Afortunadamente, el desarrollo de la tecnología de hibridoma, que se fusiona células productoras de anticuerpos individuales con células de mieloma, permite para un lote dividen constantemente de las células para secrete un anticuerpo específico, conocido como un anticuerpo monoclonal (mAb) 1. Las células de hibridoma producen estos mAbs, puros de alta afinidad para unirse a un único dominio antigénico de un antígeno específico. Con la relación de la antígeno-anticuerpo establecido, varios enfoques, incluyendo la exploración de péptidos, se puede utilizar para determinar el epítopo de un antígeno utilizando su mAb correspondiente. Los acontecimientos recientes en la tecnología de péptidos sintéticos han hecho que la técnica de exploración de péptidos más accesible y más conveniente para llevar a cabo. En pocas palabras, un conjunto de la superposición de péptidos sintéticos se producen según una secuencia de antígeno objetivo y están asociados a una membrana en un soporte sólido para el mAb hibridación. de barrido de péptidos no sólo ofrece una forma simple de un mapa de la región de unión a anticuerpo, sino que también facilita de aminoácidos (aa) mutagénesis de barrido a través de residuo o sustitución para evaluar la interacción de unión entre cada residuo aa del péptido epítopo y las CDR del anticuerpo.

Aquí, el presente estudio describe un protocolo para la identificación eficiente del epítopo lineal de la proteína de la cubierta amarilla mero virus de la necrosis nerviosa (YGNNV) utilizando un anticuerpo monoclonal neutralizante 2, 3, 4. El protocolo incluye mAb preparación, construcción y expresión de proteínas recombinantes en serie truncadas, diseño de péptidos solapantes sintético, la hibridación dot-blot, barrido de alanina, y mutagénesis de sustitución. Teniendo en cuenta el alto costo de la síntesis de péptidos, el paso de truncar en serie las proteínas recombinantes de una proteína diana deseada se modificó, y la región antigénica se redujo a alrededor de 100 a 200 residuos de aa antes de que se realizó el análisis dot-blot array péptido sintético.

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Protocolo

1. Preparación del anticuerpo monoclonal

  1. Cultivar las células de hibridoma monoclonales de ratón RG-M56 2 en medio libre de suero en matraces 175T a 37 ºC con 5% de CO 2 suplemento. Recoger el sobrenadante cuando el color del medio se vuelve amarillo después de cinco días de incubación.
    NOTA: Las células de hibridoma se cultivaron en medio libre de suero para evitar la contaminación de anticuerpos de suero bovino fetal.
  2. Centrifugar el sobrenadante a 4.500 xg durante 30 min a 4 ºC y desechar el sedimento de restos celulares.
  3. Añadir 2 ml de agarosa de proteína G (suministrado como una suspensión 50%) a una columna de 5 ml y se equilibre con 10 volúmenes de resina (10 ml) de PBS enfriado en hielo.
  4. Carga de 200 ml del sobrenadante de anticuerpo (paso 1.2) en la columna y deseche el paso a través.
  5. Añadir 10 ml de helado de PBS a la columna para lavarla. Repetir dos veces.
  6. Añadir 10 ml de glicina 50 mM, pH 2,7 a la columna para eluir el anticuerpo asociado a la proteína G. Columnalect 900 fracciones mu l en un tubo de microcentrífuga que contiene 100 l de 10x tampón de neutralización (1 M Tris, 1,5 M NaCl, y EDTA 1 mM, pH 8,0).
  7. Almacenar el anticuerpo purificado en 50% de glicerol con 0,03% NaN 3 a -20 ºC.

2. Construcción y expresión de proteínas recombinantes en serie truncadas

  1. Preparar una mezcla de reacción PCR: 5 l de 10x tampón Pfu, 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 mM de cebador directo 3, 0,2 M cebador inverso 3, 2 mM MgSO 4, 1 ng de pET20b-1A59 DNA 3 plásmido, y 2,5 U ( unidad) de ADN polimerasa Pfu; añadir ddH 2 O a un volumen final de 50 mL.
    1. Las muestras se ejecutan en un termociclador automático utilizando los siguientes parámetros: Ciclo 1 (94 ºC durante 5 min); 2-36 ciclos (94 ° C durante 30 s, 63 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 60 s); y el ciclo 37 (72 ºC durante 7 minutos).
  2. Se extrae la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) los productos mediante el uso de un kit de purificación de PCR 5 para facilitar la continuación de la digestión con enzimas de restricción.
  3. Digerir los fragmentos de ADN amplificados por PCR con enzimas de restricción Nde I y Xho I y se liga a cada uno de estos fragmentos de ADN en Xho I enzima escindido pET-20b (+) Nde I y vector. Transformar las construcciones en las células DH-5a-competente de Escherichia coli 6.
    1. Preparar la mezcla de digestión en tampón de digestión (20 mM Tris-acetato, Mg 10 mM (CH 3 COO) 2, KCH 50 mM 3 COO, y DTT 1 mM, pH 7,9) con 1 g de ADN amplificado por PCR o pET-20b (+) DNA vector, y 2 U de Nde I y Xho I restricción enzimas en un volumen final de 20 mL.
    2. Mezclar la mezcla de digestión suave y rápidamente girar hacia abajo. Incubar a 37 ºC durante 2 h en un baño seco para asegurar el corte completo de la restricción sentarseES.
    3. Extraer la enzima de fragmentos de ADN digerido de restricción usando un kit de purificación de PCR 5 para facilitar la siguiente construcción de plásmido.
    4. Preparar la mezcla de ligación en tampón de ligación (Tris 66 mM, 5 mM MgCl 2 mM, ATP 1, y DTT 5 mM, pH 7,5) con 100 ng de ADN predigerido, amplificado por PCR, 10 ng de predigerido pET-20b (+) ADN vector, y 5 U de la ligasa de T4 ADN en un volumen final de 10 mL.
    5. Mezclar la mezcla de unión suave y rápidamente girar hacia abajo. Se incuba a 16 ° C durante 18 h en un baño de agua.
    6. Ponga 10 l de las muestras de ligación en 100 l de las células DH-5α-competentes y mezclar suavemente antes de colocar el tubo de microcentrífuga en hielo durante 30 min. Poner el tubo de microcentrífuga en un baño seco a 42 ºC durante 90 s para inducir choque térmico 7. transferir inmediatamente el tubo en hielo durante 2 min.
    7. Añadir 900 l de caldo de Luria-Bertani (LB) (1% de Bacto triptona, 0,5% Bacto EXTRACTION levadurat, y 0,5% de NaCl, pH 7,0) al tubo. Incubar a 37 ºC con 150 rpm agitación durante 45 min. Sedimentar las células por centrifugación a 4000 x g durante 10 min y descartar el sobrenadante.
    8. Resuspender el precipitado con 50 l de caldo LB y se extendió cada transformación en placas LB precalentado que contienen 100 mg / ml de ampicilina. Incubar las placas a 37 ° C durante 16 h.
    9. Recoger una sola colonia usando una punta de 200 l y colocarlo en un caldo de 3 ml de LB que contiene 100 mg / ml de ampicilina en un tubo sin cubiertas 15 ml. Incubar a 37 ºC con 150 rpm agitación durante 12 h.
    10. Extraer el ADN plasmídico de cada cultivo 8 y la secuencia usando el promotor T7 y cebadores del terminador T7 para confirmar la secuencia 9.
  4. Después de la confirmación de secuencia, transformar 10 ng de ADN de estos pET-20b (+) plásmidos con diferentes longitudes de gen de la proteína capa YGNNV en la cepa BL-21 (DE3) de E. coli por nosotrosing el método de choque térmico-7. Siga los pasos 2.3.6-2.3.8 para llevar a cabo la transformación.
  5. Transferir una sola colonia de cada E. coli transformado BL-21 de células en caldo de 3 ml de LB que contiene 100 mg / ml de ampicilina en un tubo sin cubiertas 15 mL. Incubar el cultivo a 37 ºC con agitación 150 rpm.
  6. Se enfría la cultura a 25 ºC cuando la OD 600 del cultivo es aproximadamente 0,6 y añadir IPTG a una concentración final de 0,4 mM para inducir la expresión de la proteína recombinante. Incubar el cultivo de un extra de 4 horas a 25 ° C con 200 rpm de agitación.
  7. Transferir 1 ml del cultivo en un tubo de microcentrífuga. Sedimentar las células por centrifugación a 12.000 xg durante 1 min y descartar el sobrenadante.
  8. Resuspender el sedimento celular en 100 l de tampón de desnaturalización (8 M urea, fosfato de sodio 20 mM, y 0,5 M NaCl, pH 7,4) pipeteando arriba y abajo con una micropipeta. Mezclar mediante agitación vigorosa.
    NOTA: El sol de la muestraluciones ahora deben ser semi-transparente, un poco pegajoso, y listo para el ensayo de hibridación dot-blot.

3. Diseño y síntesis de péptidos superpuestos

  1. Diseño y síntesis de péptidos 3 de 20 unidades de serie que cada superposición con su sucesor por 10 aa residuos de la región de 195 a 338 aa de la proteína de la cubierta YGNNV para delimitar la región epítopo de RG-M56 mAb mediante transferencia de puntos.
  2. Diseñar y sintetizar péptidos 3 tres 8-mer (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 y 199 VLCRWSVR 206) con un solapamiento de 6 aa residuos a la siguiente péptido sintético para limitar la región de epítopo 195-206 aa mediante transferencia de puntos.
  3. Diseño y síntesis de 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 y 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, y 197 VSVLCR 202), y 5-mer péptidos (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, y 198 SVLCR 202) con una superposición de 6, 5, y 4 residuos de aa, respectivamente, en sus péptidos vecinos para reducir al mínimo la región epítopo mediante transferencia de puntos.

4. La hibridación dot-blot

  1. Disolver cada péptido sintetizado en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración final de 10 mg / mL.
    NOTA: Para superar la variada solubilidad de péptidos sintéticos, todos los péptidos sintéticos debe disolverse en DMSO. DMSO es un buen disolvente para disolver completamente los péptidos hidrófobos o hidrófilos.
  2. Remojar la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) con metanol durante 2 min.
    NOTA: membrana de PVDF es de hasta resistente a DMSO 100%; otros pueden no serlo.
  3. Equilibrar la membrana de PVDF con tampón modificado Towbin (Tris 25 mM, glicina 192 mM, y 0,1% de SDS, pH 8,3) para2 minutos.
    NOTA: 10-20% (v / v) de metanol se puede añadir a un tampón de Towbin modificado para mejorar los resultados de la transferencia.
  4. Enjuague un pedazo de papel de cromatografía con el tampón de Towbin modificado. Colocar la membrana de PVDF en el papel de cromatografía. Espere hasta que el tampón Towbin modificado ha desaparecido de la superficie de la membrana de PVDF antes de continuar con el siguiente paso.
  5. Añadir 2 l de cada muestra de péptido a la membrana con una punta de 10 l. El aire seco de la membrana de PVDF en el papel de cromatografía durante 10 minutos. Añadir cada muestra péptido lenta y gradualmente sobre la membrana para evitar demasiada difusión.
  6. Bloquear la membrana en tampón de TBST (0,05% (v / v) pH Tween-20, Tris 20 mM, y NaCl 150 mM, 7,4) con 5% de leche sin grasa para 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.
  7. Añadir RG-M56 mAb a una dilución final de 1: 1000 en tampón TBST con 5% de leche sin grasa a la membrana. Incubar la membrana a 37 ° C durante 1 h con agitación suave.
  8. Retire el anticuerpo asílución. Lavar la membrana en tampón de TBST durante 5 min con agitación suave. Repetir dos veces.
  9. Añadir el anticuerpo secundario (de cabra anti-IgG de ratón, Fc, conjugado con fosfatasa alcalina) en una dilución final de 1: 5000 en tampón TBST con 5% de leche sin grasa a la membrana. Incubar la membrana a 37 ° C durante 1 h con agitación suave.
  10. Descartar la solución de anticuerpo. Lavar la membrana en tampón de TBST durante 5 min con agitación suave. Repita el paso de lavado dos veces.
  11. Desarrollar la membrana con solución de sustrato BCIP / NBT a temperatura ambiente durante 15 min en la oscuridad. Detener el desarrollo lavando la membrana con ddH2O cuando aparezca la señal.
  12. El aire seco de la membrana y capturar la imagen de transferencia puntual usando un sistema de imagen.
  13. Medir la intensidad de cada transferencia de puntos utilizando el software de análisis de imagen 3.

5. barrido de alanina y sustitución

  1. Diseñar y sintetizar 3 alanina y methipéptidos de sustitución onine. Reemplazar cada residuo a bis con alanina para el péptido 8-mero 195 VNVSVLCR 202 y sintetizar péptidos 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 y 195 VNVSVLCA 202 . Reemplazar leucina residuos aa 200 a metionina para crear el genotipo SJNNV epítopo péptido 195 202 VNVSVMCR.
  2. Siga la sección 4 para realizar el rastreo de alanina y mutagénesis de sustitución transferencia de puntos.

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Resultados

El objetivo de este experimento fue identificar un epítopo a través de transferencia de puntos usando mAb. Para obtener rápida y eficientemente por la región antigénica reconocida por mAb, de longitud completa y proteínas de la cubierta recombinante YGNNV en serie truncado con un marcador de fusión 6xHis en el extremo C-terminal se expresaron a partir de un sistema de expresión de E. coli PET 10 (Figura 1A). Las proteínas recombinantes re...

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Discusión

Este protocolo ofrece una técnica rápida y simple para identificar un epítopo lineal mAb-reconocido. Teniendo en cuenta el coste de la síntesis de péptidos y la eficiencia de la producción de péptidos que sintetizan, la región antigénica de la proteína de cubierta del virus se redujo mediante la expresión de proteínas recombinantes en serie truncados antes del análisis de barrido de péptidos. Como tal, se utilizó el sistema de expresión de E. coli pET confiable y eficiente para producir estas proteínas recombin...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses relacionados con este informe.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la señorita Ching-Chun Lin y a la señorita Diana Lin del Centro del Instituto de Biología Celular y Organísmica (ICOB) de la Academia Sinica por ofrecer su experiencia en la síntesis de péptidos y la secuenciación del ADN, respectivamente. Este estudio contó con el apoyo de la Academia Sinica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medio híbrido-SFMGibco12045-076
Solución salina tamponada con fosfatos de Dulbeccos (PBS)Gibco21600-069
Pfu ADN polimerasa Thermo Scientific EP0502 Incluyendo búferes
T4 ADN LigasaRoche10799009001Incluyendo tampones
NdeI New England BiolabsR0111SIncluyendo tampones
XhoI New England BiolabsR0146SIncluyendo tampones
pET-20b(+) vectorNovagen, Merck Millipore69739
E. coli DH-5α célula competenteRBC BioscienceRH617
E. coli BL-21(DE3) célula competenteRBC BioscienceRH217
Ampicilina Amresco0339-25G
Caldo LB Invitrongen12780-052
Isopropiltio-β-D-tiogalactósido (IPTG)MDBio, Inc.101-367-93-1
MetanolMerck Millipore106009
Polioxietileno 20 Monolaurato de sorbitán (Tween-20)J.T.BakerX251-07
Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD2650
GlicinaAmresco0167-5KG
TrisAffymetrix, USB75825
NaClAmresco0241-1KG
EDTAAmresco0105-1KG
GlicerolAmresco0854-1L
NaN3SigmaS2002-500G
BCIP/NBTPerkinElmerNEL937001PK
Cabra Anti-Ratón IgG, anticuerpo de fragmento FcJackson ImmunoResearch115-055-008
Immobilon-P (fluoruro de polivinilideno, PVDF)Merck MilliporeIPVH00010
Proteína G Agarosa Fast FlowMerck Millipore16-266
QIAquick PCR Kit de purificaciónQiagen28106
UVP BioSpectrum 600 Sistema de imagenUVPn/a
VisionWorks LS Software de análisis Ver 6.8UVPn/a
Termociclador MyCyclerBioRad1709713

Referencias

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