La identificación de un epítopo lineal de células B reconocido por anticuerpos monoclonales péptido Escaneo-asistida

Resumen

Aquí, los autores presentan un protocolo simple y eficiente para definir un epítopo antigénico lineal utilizando un anticuerpo monoclonal purificado y escaneo de péptidos a través de hibridación dot-blot. El epítopo identificado puede utilizarse en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.

Resumen

La identificación de un epítopo antigénico por el sistema inmune permite la comprensión del mecanismo de protección de anticuerpos neutralizantes que pueden facilitar el desarrollo de vacunas y fármacos peptídicos. de barrido de péptidos es un método simple y eficiente que los mapas de forma directa el epítopo lineal reconocido por un anticuerpo monoclonal (mAb). A continuación, los autores presentan una metodología de determinación epítopo participación de las proteínas truncadas recombinantes en serie, el diseño de péptidos sintéticos, y la hibridación dot-blot para el reconocimiento antigénico de la proteína de cubierta del virus de la necrosis nerviosa utilizando un anticuerpo monoclonal neutralizante. Esta técnica se basa en la hibridación dot-blot de péptidos y mAbs sintéticos sobre una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La región antigénica mínima de una proteína de la cubierta viral reconocido por el RG-M56 mAb puede ser reducido a paso a paso recortado mapeo de péptidos en un péptido epítopo 6-mer. Además, barrido de alanina y mutagénesis residuo subinstitución puede llevar a cabo para caracterizar el significado unión de cada residuo de aminoácido que compone el epítopo. Se encontró que los residuos que flanquean el sitio epítopo para jugar un papel crítico en la regulación del péptido conformación. El péptido epítopo identificado puede ser utilizado para formar cristales de complejos de péptido-anticuerpo de epítopo para un estudio de difracción de rayos X y la competencia funcional, o para la terapéutica.

Introducción

En el sistema inmune, la recombinación de los segmentos V, D y J permite anticuerpos para crear enormes variaciones de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) para la unión a diversos antígenos para proteger al huésped de la infección patógena. La defensa de neutralización de anticuerpos contra los antígenos depende de la complementariedad espacial entre las CDR de los anticuerpos y los epítopos de los antígenos. Por lo tanto, la comprensión de esta interacción molecular ayudará diseño vacuna profiláctica y desarrollo de fármacos péptido terapéutico. Sin embargo, esta interacción de neutralización puede estar influenciada t....

Protocolo

1. Preparación del anticuerpo monoclonal

1. Cultivar las células de hibridoma monoclonales de ratón RG-M56 ² en medio libre de suero en matraces 175T a 37 ºC con 5% de CO ₂ suplemento. Recoger el sobrenadante cuando el color del medio se vuelve amarillo después de cinco días de incubación.
   NOTA: Las células de hibridoma se cultivaron en medio libre de suero para evitar la contaminación de anticuerpos de suero bovino fetal.
2. Centrifugar el sobrenadante a 4.500 xg durante 30 min a 4 ºC y desechar el sedimento de restos celulares.
3. Añadir 2 ml de agarosa de proteína G (suministrado como una suspensión 5....

Resultados

El objetivo de este experimento fue identificar un epítopo a través de transferencia de puntos usando mAb. Para obtener rápida y eficientemente por la región antigénica reconocida por mAb, de longitud completa y proteínas de la cubierta recombinante YGNNV en serie truncado con un marcador de fusión 6xHis en el extremo C-terminal se expresaron a partir de un sistema de expresión de E. coli PET ¹⁰ (Figura 1A). Las proteínas recombinantes re.......

Discusión

Este protocolo ofrece una técnica rápida y simple para identificar un epítopo lineal mAb-reconocido. Teniendo en cuenta el coste de la síntesis de péptidos y la eficiencia de la producción de péptidos que sintetizan, la región antigénica de la proteína de cubierta del virus se redujo mediante la expresión de proteínas recombinantes en serie truncados antes del análisis de barrido de péptidos. Como tal, se utilizó el sistema de expresión de E. coli pET confiable y eficiente para producir estas proteínas recombin.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio híbrido-SFM	Gibco	12045-076
Solución salina tamponada con fosfatos de Dulbeccos (PBS)	Gibco	21600-069
Pfu ADN polimerasa	Thermo Scientific	EP0502	Incluyendo búferes
T4 ADN Ligasa	Roche	10799009001	Incluyendo tampones
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Incluyendo tampones
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Incluyendo tampones
pET-20b(+) vector	Novagen, Merck Millipore	69739
E. coli DH-5α célula competente	RBC Bioscience	RH617
E. coli BL-21(DE3) célula competente	RBC Bioscience	RH217
Ampicilina Amresco		0339-25G
Caldo LB	Invitrongen	12780-052
Isopropiltio-β-D-tiogalactósido (IPTG)	MDBio, Inc.	101-367-93-1
Metanol	Merck Millipore	106009
Polioxietileno 20 Monolaurato de sorbitán (Tween-20)	J.T.Baker	X251-07
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Glicina	Amresco	0167-5KG
Tris	Affymetrix, USB	75825
NaCl	Amresco	0241-1KG
EDTA	Amresco	0105-1KG
Glicerol	Amresco	0854-1L
NaN3	Sigma	S2002-500G
BCIP/NBT	PerkinElmer	NEL937001PK
Cabra Anti-Ratón IgG, anticuerpo de fragmento Fc	Jackson ImmunoResearch	115-055-008
Immobilon-P (fluoruro de polivinilideno, PVDF)	Merck Millipore	IPVH00010
Proteína G Agarosa Fast Flow	Merck Millipore	16-266
QIAquick PCR Kit de purificación	Qiagen	28106
UVP BioSpectrum 600 Sistema de imagen	UVP	n/a
VisionWorks LS Software de análisis Ver 6.8	UVP	n/a
Termociclador MyCycler	BioRad	1709713