Análisis de terminación de la transcripción Uso Enfoque BrUTP-capítulo específico de la transcripción de ejecución en (TRO)

Resumen

Describimos un enfoque experimental básico para el análisis de la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II in vivo utilizando BrUTP mediante el enfoque de rodaje de transcripción específica de cadena (TRO) en levadura en ciernes. Este protocolo puede extenderse para estudiar la terminación de la transcripción por otras ARN polimerasas tanto en levaduras como en eucariotas superiores.

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo para la detección de defecto de terminación de la transcripción in vivo. El protocolo TRO capítulo específico utilizando BrUTP describe aquí es un enfoque experimental poderosa para analizar el defecto terminación de la transcripción en condiciones fisiológicas. Al igual que el ensayo de TRO tradicional, se basa en la presencia de una polimerasa transcripcionalmente activo más allá del extremo 3 'del gen como un indicador de un defecto de terminación de la transcripción ^1. Supera dos problemas importantes con el ensayo TRO tradicional. En primer lugar, se puede detectar si la polimerasa lectura a través de la señal de terminación es el que inicia la transcripción de la región próxima al promotor, o si es simplemente representa una polimerasa penetrante transcripción que inició de manera no específica de algún lugar del cuerpo o de la 3 ' final del gen. En segundo lugar, se puede distinguir si la señal de la polimerasa transcripcionalmente activo más allá de laregión terminadora es realmente la polimerasa mRNA sentido transcripción de lectura completa o una señal de ARN anti-sentido no codificante terminador iniciada. Brevemente, el protocolo implica permeabilización de las células de levadura en crecimiento exponencial, permitiendo que las transcripciones que iniciaron in vivo para alargar en presencia del nucleótido BrUTP, purificando el ARN marcado con BrUTP por el enfoque de afinidad, transcripción inversa el ARN naciente purificada y amplificar el ADNc usando cebadores específicos de cadena que flanquean las regiones de terminación del gen promotor y ^2.

Introducción

El ciclo de la transcripción eucariótica consiste en tres pasos principales; iniciación, elongación y terminación. La terminación de la transcripción por la RNA polimerasa II consta de dos etapas distintas interdependientes ^3. El primer paso implica la escisión, de poliadenilación y liberación de ARNm a partir de la plantilla, y es seguida inmediatamente por el segundo paso, marcado por el desacoplamiento de la polimerasa a partir de la plantilla. La terminación adecuada es crucial para el reciclado de la polimerasa durante la iniciación / reinicio de la transcripción, para la prevención de interferencia con la transcripción de genes aguas aba....

Protocolo

NOTA: Este método fue utilizado en el artículo de investigación publicada en Medler, S y Ansari, A. ^2.

1. cultivo y recogida de las células

1. Iniciar un ml de cultivo de 5 de las células en medio YPD (10 g de extracto / L de levadura, 20 g / L de peptona, 2% de dextrosa) a partir de una placa de Saccharomyces cerevisiae recién rayada.
2. Cultivar las células durante la noche en un agitador orbital a 30 ° C y 250 rpm.
3. Diluir el cultivo crecido durante la noche de 100 veces a un volumen final de 100 ml en medio YPD en un matraz desconcertado a 250 ml.
   NOTA: Se necesita un tot....

Resultados

Para demostrar la aplicabilidad del procedimiento TRO BrUTP cadena específica en la detección de un defecto de terminación de la transcripción, hemos utilizado un mutante sensible a la temperatura de terminación defectuosa de RNA14 llama rna14-1. El papel de Rna14 en la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II se demostró usando el ensayo de TRO tradicional que detectó ARN en la región del terminador-proximal de genes seleccionados ^1.

Discusión

El protocolo TRO capítulo específico utilizado aquí es una adaptación del protocolo utilizado para GRO-Sec (Global Run on-Sequencing) análisis en células de mamíferos ^12. Hemos modificado con éxito el protocolo para estudiar la transcripción incipiente levadura en ciernes. Para analizar específicamente el defecto terminación de la transcripción, se ajustó el protocolo adicional mediante la eliminación de la etapa de hidrólisis de ARN. Esto nos permitió detectar específicamente la longitud nacient.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico	Sigma-Aldrich	77619	pH 4-5
Reactivo TRIzol	Life technologies	15596-026
Inhibidor de ARNasa, placenta humana	New England Biolabs	M0307S
Perlas anti-BrdU	Cruz Biotechnology	sc-32323AC
Protoscript II	New England Biolabs	M03368L	o una enzima equivalente
Advantage 2 polymerase Mix	Clontech	639201	o una enzima equivalente
5-Bromouridina 5' trifosfato sodio sal	Cruz Biotechnology	sc-214314A
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
ATP	New England Biolabs	N0451AA
CTP		N0454AA
GTP		N0452AA
Albúmina sérica bovina ultrapura (BSA)	MC Labs	UBSA-100
Asc1 B			AGATTCGTCGGTCACAAGTCC
Asc1 C			GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC
Asc1 D			TGTACATATGTATTTTCGCAGCA
Asc1 E			GCCAAGGAGACTGAATTTAATG
asc1 f			ctatggaatgggggttttaag
asc1 g			GGTTATGGCAGACATGCCAC
5s cDNA			AGATTGCAGCACCTGAGT
5' 5s inverso			GGTTGCGGCCATATCTAC
3' 5s reverso			TGAGTTTCGCGTATGGTC