Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

Summary

En este sentido, describimos un microscopio de luz para visualizar el infiltrado de leucocitos CD45 ⁺ cardíaco en un modelo murino de miocarditis fulminante aséptica, que es inducido por el tratamiento de la toxina diftérica intratraqueal de ratones CD11c.DTR.

Abstract

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM), en combinación con los protocolos de eliminación química, se ha convertido en el estándar de oro para el análisis de estructuras marcadas con fluorescencia en muestras biológicas grandes, y es hasta la resolución celular. Mientras tanto, el refinamiento constante de los protocolos subyacentes y la mayor disponibilidad de sistemas comerciales especializados nos permiten investigar la microestructura de los órganos de ratones enteros e incluso permitir la caracterización del comportamiento celular en varios enfoques de imágenes de células vivas. Aquí, describimos un protocolo para la visualización y cuantificación de todo el espacio espacial de la población de leucocitos CD45 ⁺ en corazones de ratón inflamados. El método emplea una cepa de ratón transgénico (CD11c.DTR) que recientemente se ha mostrado que sirve como un modelo robusto e inducible para el estudio del desarrollo de la miocarditis fatal fulminante, caracterizada por arritmias cardíacas letales. Este protocolo incluye la inducción de miocarditis, intravitAl mediada por anticuerpos, preparación de órganos y LSFM con subsiguiente procesamiento de imágenes asistido por ordenador. Aunque presentado como un método altamente adaptado para nuestra particular cuestión científica, el protocolo representa el modelo de un sistema fácilmente ajustable que también puede dirigirse a estructuras fluorescentes completamente diferentes en otros órganos e incluso en otras especies.

Introduction

Durante la evolución de la microscopía óptica, aparecieron muchas formas especializadas, todas ellas desarrolladas para minimizar las limitaciones en el proceso de visualización de especímenes particulares. Uno de estos métodos es la microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM). Desarrollado en 1903 por Siedentopf y Zsigmondy ¹ y encontrando sus primeras aplicaciones biológicas fundamentales a principios de la década de 1990 ² , LSFM se ha convertido en la herramienta microscópica más poderosa hasta la fecha para la visualización de especímenes grandes, como órganos de ratones intactos, con una resolución de señ....

Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de la UE y fueron aprobados por las autoridades locales competentes en Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Alemania). Los animales fueron utilizados y alojados en condiciones específicas libres de patógenos (SPF).

1. Inducción de miocarditis por toxina diftérica (DTX)

1. Preparar la solución DTX para la inducción de miocarditis diluyendo la solución madre de DTX con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una solución de trabajo de 1 μg / mL.
2. Apli....

Results

El enfoque LSFM presentado analiza la distribución y la cantidad de leucocitos en los corazones murinos tras la inducción de miocarditis grave. La Figura 1A explica el protocolo de pretratamiento para los ratones CD11c.DTR transgénicos para la inducción de miocarditis. Este paso representa el desencadenante necesario para el reclutamiento de leucocitos en el miocardio. Después de una aplicación DTX exitosa, los animales desarrollan síntomas severos de la enfermedad, tale.......

Discussion

En la ciencia de la vida moderna, la visualización microscópica de los procesos biológicos desempeña un papel cada vez más importante. En este contexto, se han logrado muchos desarrollos durante los dos últimos siglos que ayudan a responder a preguntas no abordables hasta este punto,. En primer lugar, ha habido una clara tendencia a aumentar fundamentalmente la capacidad de resolución de los microscopios de luz. Con microscopía de iluminación estructurada (SIM) ^{21 , 2.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
toxina diftérica	Sigma Aldrich	D0564
solución salina tamponada con fosfato	Biochrom	L182-10
ketamina [50 mg/mL]	Inresa	PZN 4089014
xilacina [2 %]	Jeringa Ceva
	Braun	REF 9161502	Braun Omincan F
catéter venoso indwound	Becton Dickinson	REF 381923	BD Insyte Autoguard
respirador para animales pequeños	Harvard Apparatus	73-0044	MiniVent
anticuerpo anit-CD45 (AF647)	BioLegend	103124
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) sal disódica disódica	Carl Roth	8043.2
catéter (21 g)	BD Biosciences	REF 387455	BD valu-set
paraformaldehído	Sigma Aldrich	P6148
Tubo de PE (5 mL)	Carl Roth	EKY9.1	Etanol Rotilabo
	Carl Roth	9065.4
éter dibencílico	Sigma-Aldrich
	Miltenyi Biotec	130-090-753	MACSmix
agarosa (baja gelificación)	Sigma Aldrich	Molde A4018
(15 x 15 x 5 mm)	Tissue Tek	4566	Cryomold
sistema de microscopio de lámina de luz	LaVision Biotec		Ultramicroscope
cuerpo de microscopio	Olympus		MVX10
objetivo	Olympus		0.5  NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5  mm
Cámara sCMOS 5.5MP	Tecnología Andor 488
nm Láser OPSL (50mW)	Láser de
de 647 nm (50 mW)	coherente
de análisis y procesamiento de imágenes 3D	Bitplane		IMARIS Ver. 8.3
cepa de ratón transgénico	Steffen Jung et al.		CD11c.DTR
wt cepa de ratón	Envigo		Balb/c Ola Hsd J
Módulo láser	LaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Objetivo Lente