Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

Resumen

En este sentido, describimos un microscopio de luz para visualizar el infiltrado de leucocitos CD45 ⁺ cardíaco en un modelo murino de miocarditis fulminante aséptica, que es inducido por el tratamiento de la toxina diftérica intratraqueal de ratones CD11c.DTR.

Resumen

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM), en combinación con los protocolos de eliminación química, se ha convertido en el estándar de oro para el análisis de estructuras marcadas con fluorescencia en muestras biológicas grandes, y es hasta la resolución celular. Mientras tanto, el refinamiento constante de los protocolos subyacentes y la mayor disponibilidad de sistemas comerciales especializados nos permiten investigar la microestructura de los órganos de ratones enteros e incluso permitir la caracterización del comportamiento celular en varios enfoques de imágenes de células vivas. Aquí, describimos un protocolo para la visualización y cuantificación de todo el espacio espacial de la población de leucocitos CD45 ⁺ en corazones de ratón inflamados. El método emplea una cepa de ratón transgénico (CD11c.DTR) que recientemente se ha mostrado que sirve como un modelo robusto e inducible para el estudio del desarrollo de la miocarditis fatal fulminante, caracterizada por arritmias cardíacas letales. Este protocolo incluye la inducción de miocarditis, intravitAl mediada por anticuerpos, preparación de órganos y LSFM con subsiguiente procesamiento de imágenes asistido por ordenador. Aunque presentado como un método altamente adaptado para nuestra particular cuestión científica, el protocolo representa el modelo de un sistema fácilmente ajustable que también puede dirigirse a estructuras fluorescentes completamente diferentes en otros órganos e incluso en otras especies.

Introducción

Durante la evolución de la microscopía óptica, aparecieron muchas formas especializadas, todas ellas desarrolladas para minimizar las limitaciones en el proceso de visualización de especímenes particulares. Uno de estos métodos es la microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM). Desarrollado en 1903 por Siedentopf y Zsigmondy ¹ y encontrando sus primeras aplicaciones biológicas fundamentales a principios de la década de 1990 ² , LSFM se ha convertido en la herramienta microscópica más poderosa hasta la fecha para la visualización de especímenes grandes, como órganos de ratones intactos, con una resolución de señal de fluorescencia Hasta el nivel celular. Debido a estos beneficios, en combinación con su potencial de imágenes de células vivas, Nature Methods nombró a LSFM como el "Método del Año 2014 ³ ".

Como su nombre sugiere, la iluminación de la muestra en un LSFM es conducida por hojas de luz, que están orientadas perpendicularmente al eje del objetivo utilizado fO la recolección de luz de emisión y posterior formación de imagen. La lámina de luz se genera generalmente centrando los rayos láser colimados anchos con una lente cilíndrica o por el movimiento lateral rápido de rayos láser estrechos enfocados en apenas un plano horizontal o vertical ^{4 , 5} . De esta forma, sólo se ilumina el plano focal de la óptica de formación de imágenes, típicamente con un espesor de 1-4 μm. Por consiguiente, para una muestra fluorescente colocada en el plano de iluminación, tanto la generación de luz dispersa como los efectos del fotoblanqueo desde regiones por encima o por debajo del plano focal se eliminan o se suprimen en gran medida ^{6 , 7} . Como todos los planos fuera de foco no se iluminan, los efectos de fotoblanqueo se omite en estas áreas. En contraste con la microscopía confocal o multi-fotónica estándar, los caminos de la luz iluminada y emitida están separados unos de otros, por lo que la imagen final qual No depende del enfoque perfecto del haz de luz de excitación a través de los objetivos. Dependiendo de la pregunta subyacente, es posible utilizar objetivos con un campo de visión enorme (FOV) de modo que la mayor área posible del plano iluminado pueda ser visualizada sin ninguna parte componente que se mueva en la dirección xy.

En los modernos sistemas LSFM, se capta una imagen fluorescente de la sección óptica generada en un dispositivo de carga acoplada altamente sensible (CCD) o cámaras de semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS), que son capaces de adquirir todo el campo de visión (FOV) En microsegundos. Por lo tanto, moviendo la muestra a través de la lámina de luz y adquiriendo imágenes a pasos z definidos, es posible obtener la información 3D completa de una muestra en una cantidad de tiempo razonable ^{8 , 9} , haciendo esta técnica aplicable para células vivas Estudios ^{10 ,}Asno = "xref"> 11 ^{, 12} .

Sin embargo, aunque LSFM ofrece un método rápido, sensible y amigable a la fluorescencia, la transmisión de luz a través de la muestra sigue siendo un problema importante, especialmente cuando las grandes muestras biológicas son el blanco para un análisis 3D. La transmisión de la luz se modifica críticamente por los aspectos físicos de la absorción y por la dispersión de la luz en las interfaces de las estructuras con diferentes índices de refracción [ ^13] . Por lo tanto, cuando las muestras de imagen de varios milímetros de tamaño, LSFM se combina en su mayoría con los protocolos de limpieza para hacer las muestras ópticamente transparente. Estas técnicas se basan en la idea de eliminar el agua del respectivo tejido biológico y de intercambiarlo con medios de inmersión a base de disolventes acuosos o orgánicos, los cuales se eligen para ajustarse estrechamente a los índices de refracción de los componentes de tejido diana particulares. Como resultado, la dispersión de luz lateral se minimiza, y todas las longitudes de ondaDe luz puede pasar mucho más eficientemente a través del tejido ¹³ . En muchos casos, los especímenes biológicos tratados de esta manera aparecen macroscópicamente cristalinos, lo que permite que el LSFM se lleve a cabo, incluso en órganos enteros de ratón, usando objetivos de ampliación de larga distancia de trabajo y de baja ampliación.

Aquí presentamos un protocolo de preparación para la obtención de imágenes de gran muestra en un microscopio de lámina (ver tabla de materiales), que hemos establecido para investigar el infiltrado cardíaco celular en un modelo murino de miocarditis ¹⁵ . Los ratones CD11c.DTR expresan el receptor de la toxina diftérica de primate (DTR) bajo el control del promotor ^{16 de} CD11c. En consecuencia, las células de estos ratones, que expresan CD11c junto con el DTR, se hacen sensibles a la exotoxina de Corynebacterium diphtheria (toxina diftérica, DTX); El tratamiento sistémico de estos animales con DTX produce un agotamiento de todos los CD11c ⁺ ceLls CD11c es una integrina y, como receptor de la superficie celular para una variedad de diferentes factores solubles, está involucrado en procesos de activación y maduración, principalmente en las células del linaje monocítico [ ^17] . En consecuencia, el modelo de ratón CD11c.DTR se ha utilizado intensivamente para estudiar el papel de las células dendríticas y los subgrupos de macrófagos en el contexto de muchas preguntas inmunológicas diferentes. Con el tiempo, se ha reportado que los ratones CD11c.DTR tratados sistemáticamente con DTX pueden desarrollar efectos secundarios adversos y pueden mostrar tasas de mortalidad fuertemente elevadas ^{18 , 19} . Recientemente, hemos sido capaces de identificar la causa subyacente de la muerte ¹⁵ , que describe el desarrollo de miocarditis fulminante después de la aplicación intratraqueal DTX en estos animales. El desafío de la toxina causó la destrucción celular, incluso en las partes centrales del sistema de transmisión del estímulo en el corazón. Esto fue acompañado por un masivo CD45+ Infiltrado de leucocitos, lo que finalmente conduce a arritmias cardíacas letales. En este caso, no sólo fue importante la aparición de la población de leucocitos, sino también su distribución espacial dentro del corazón. Esta pregunta experimental es un desafío para la moderna imagen microscópica, que hemos resuelto por una luz microscopía de la hoja de enfoque que se apoya por la tinción de anticuerpos intravital y un disolvente orgánico basado en el protocolo de compensación óptica.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de la UE y fueron aprobados por las autoridades locales competentes en Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Alemania). Los animales fueron utilizados y alojados en condiciones específicas libres de patógenos (SPF).

1. Inducción de miocarditis por toxina diftérica (DTX)

1. Preparar la solución DTX para la inducción de miocarditis diluyendo la solución madre de DTX con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una solución de trabajo de 1 μg / mL.
2. Aplique 100 μL de esta solución intratraquealmente en ratones CD11c.DTR de 8 a 10 semanas de edad (aproximadamente 5 ng / g de peso corporal (peso corporal)), como muestra Hasenberg et al. Para la aplicación de una suspensión de esporas fúngicas ²⁰ .
   NOTA: La aplicación intraperitoneal de la toxina podría resultar en una inducción similar deMiocarditis mortal. Sin embargo, este enfoque tendría que ser validado en primer lugar.
   1. Para su aplicación, anestesiar a los animales mediante una inyección intraperitoneal (ip) de 100 mg / kg de cetamina y 10 mg / kg de xilazina.
   2. Después de alcanzar la narcosis profunda (prueba del pinzamiento del dedo del pie), intubate a los animales usando un catéter venoso del domicilio 22 G a través de la cavidad oral. Compruebe el correcto posicionamiento del tubo de la lente ventilando a los animales con un respirador de animal pequeño a una velocidad de 250 respiraciones por minuto y un volumen de inhalación de 250 μL por respiración, también mostrado por Hasenberg et al. Alabama. ²⁰ .
      NOTA: Cuando se coloca correctamente, la velocidad de respiración de los animales cambiará según los ajustes de ventilación aplicados.
   3. Desconecte el sistema de ventilación e inculque los 100 μl de solución DTX o una cantidad igual de PBS como control a través del catéter en el pulmón y continúe ventilando a los animales durante 1 minuto adicional.
3. Deje que los animales se recuperen de la anestesia y controlar el estado general de salud y el cambio de peso corporal durante 4 días.
   NOTA: Dependiendo del antecedente genético, la cepa del ratón o el peso inicial, la gravedad y el inicio de la miocarditis pueden variar y deben determinarse primero.

2. Preparación de muestras para microscopía de lámina

1. 4 días después de la aplicación de la toxina, anestesiar los ratones mediante el lavado de una cámara de inducción con una mezcla vaporizada de isoflurano / oxígeno al 2%. Inyectar 15 μg de un anticuerpo anti-CD45 marcado directamente (clon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) en 50 μL de PBS por vía intravenosa (iv) utilizando la vía de aplicación retroorbitaria, lo que garantiza una aplicación muy rápida y altamente precisa de la Cantidad correcta de anticuerpo.
   NOTA: La profundidad de narcosis deseada se ha alcanzado cuando los ratones están recostados y no reaccionan a la prueba de pinzamiento del dedo del pie.
2. Después de 2 h de incubación, sacrificar los ratones por dislocación cervical yD perfunden los corazones in situ con 5 ml de PBS / EDTA (5 mM).
   1. Exponer el corazón e inyectar la solución de perfusión en el ventrículo derecho usando un catéter de 21 G. Perfundir con una presión lenta y constante y asegurarse de que la sangre se puede drenar después de cortar la aorta abierta.
      NOTA: Esta perfusión transcardial podría resultar en pequeños artefactos de preparación, lo que podría perturbar la visualización 3D final del órgano. Por lo tanto, los experimentadores experimentados avanzados podrían realizar la perfusión a través de la vena cava inferior, extirpando la aorta abdominal.
3. Para la fijación química, perfundir el corazón a través del mismo receso con 5 mL de paraformaldehído al 4% (PFA). Mantenga el catéter en su lugar y simplemente coloque una jeringa nueva llena de PFA. Perfume con presión lenta y constante.
   NOTA: Paraformaldehído es altamente tóxico; Evitar el contacto con la piel, los ojos y otras mucosas.
   1. Sujete suavemente el corazón con una pinza dentada; PuLl ligeramente hacia arriba; Y cortar todas las conexiones de tejido, incluyendo las arterias y venas entrantes y salientes. Guarde el órgano durante 4 h adicionales en PFA al 4% para una fijación adicional.
4. Para deshidratar el órgano, incubar el corazón en una serie de etanol ascendente al 50%, 70% y dos veces al 100%, cada una durante 12 h, a 4ºC en la oscuridad. En este caso, utilice tubos de reacción negros de polipropileno de 5 ml, lo que les permite girar constantemente en un rotador de tubos con una velocidad de rotación lenta para evitar la formación de burbujas de aire.
5. Preparación completa de la muestra mediante limpieza química. Para que los corazones sean transparentes, incubelos en éter dibencilico (DBE) al 98% mientras gira constantemente durante la noche.
   NOTA: DBE es irritante para los ojos, la piel y el sistema respiratorio.

3. Microscopía de lámina

1. Realizar LSFM usando el microscopio de la lámina-hoja (vea la tabla de materiales). Coloque la muestra en el soporte estándar de la muestra del microscopio en el DB lleno de DBEVette, que es adecuado para especímenes de hasta 30 mm x 30 mm x 15 mm.
2. Mantenga la muestra firmemente en su lugar durante la adquisición de la imagen utilizando bloques de agarosa deshidratados y despejados.
   1. Para preparar los bloques de agarosa, se vierte 2% de agarosa fundida en un molde (15 mm x 15 mm x 5 mm). Deje que la agarosa se enfríe hasta que se solidifique.
   2. Deshidratarla en una serie de etanol ascendente (50%, 70% y dos veces al 100%). Incubar los bloques de agarosa durante la noche en 98% DBE. Guarde la agarosa en DBE hasta que se use.
      NOTA: Como la agarosa está compuesta principalmente de agua, los tiempos de incubación para cada paso de deshidratación pueden extenderse, dependiendo del tamaño del bloque.
      NOTA: DBE es irritante para los ojos, la piel y el sistema respiratorio.
   3. Cuando sea necesario, corte el bloque de agarosa preparado a la forma deseada usando un bisturí afilado. Típicamente, corte las formas en forma de prisma o de cuña para colocarlas en los bordes del adaptador de muestra.
      NOTA: Como los bloques de agarosa son elásticos,La muestra permanece en su lugar cuando se empuja con poca fuerza.
3. Detectar las señales de fluorescencia de interés (en este caso, autofluorescencia y tinción de anticuerpos anti-CD45) con los ajustes de filtro de emisión y excitación apropiados.
   1. Para la detección de la señal de autofluorescencia derivada del tejido conectivo, utilice un filtro de paso de banda de 525/50 nm a una longitud de onda de excitación de 488 nm (OPSL: 50 mW); La tinción de CD45 con un anticuerpo acoplado a AF647 se detecta a 668 nm (filtro de paso de banda: 680/30 nm) ya una longitud de onda de excitación de 647 nm (láser de diodo: 50 mW).
   2. Elija 4 μm como la distancia entre los dos planos z individuales.

4. Postprocesamiento de imágenes

NOTA: Los datos de imagen digital adquiridos se procesaron posteriormente con un software de procesamiento y análisis de imágenes 3D / 4D científico (ver tabla de materiales).

1. Apertura y preajuste de los ficheros de datos.
2. Después de iniciar el software de análisis, seleccione el botón "Superar" en la esquina superior izquierda. Para abrir las pilas de imágenes, seleccione "Archivo", "Abrir" y seleccione una carpeta que contenga los datos del primer canal adquirido. Elija "Editar" y "Añadir canales" para agregar otros canales adquiridos.
   NOTA: Dependiendo del tamaño de los datos y del sistema informático, este proceso puede tardar varios minutos. El protocolo presentado demuestra todos los pasos para 2 canales de adquisición (autofluorescencia y AF647).
3. Corrija las dimensiones de voxel x, y y z haciendo clic en "Editar" y seleccionando "Propiedades de imagen". Cuando se abra la nueva ventana, ajuste los parámetros.
   NOTA: Este paso depende del sistema de microscopio empleado y del formato de datos en particular. Los valores xyz correctos son críticos para el tamaño subsiguiente y las mediciones distantes. En la mayoría de los casos, estos parámetros se almacenan como metadatos en los archivos de micrografía. Sin embargo, si el archivo foRmat no puede ser interpretado correctamente por el software de análisis, es importante introducir manualmente el tamaño del píxel. El tamaño de píxel en las dimensiones x e y depende del tamaño del píxel de la cámara, del binning potencialmente aplicado y de la ampliación del objetivo y del objetivo. El tamaño de píxel en z es equivalente al tamaño de paso z autodefinido ( por ejemplo, 4 μm).

Ajustes del canal

1. Primero transforme la señal de autofluorescencia en escala de grises abriendo el "Ajuste de pantalla" ("Editar" y "Mostrar ajuste de pantalla"). Una nueva ventana mostrará todos los canales abiertos y los ajustes de visualización para todos ellos; Para cambiar su color predeterminado, seleccione el canal de autofluorescencia y elija el estilo de visualización "blanco". Haga clic en "Aceptar" para aplicar.
2. Para el ajuste de nivel de negro, vuelva a "Ajuste de visualización" y ajuste el valor de nivel de negro para excluir las señales de fondo no deseadas que no representan la estructura de la muestraS
   1. Para ello, utilice el triángulo superior izquierdo de la barra de canales y arrástrelo de izquierda a derecha.
      NOTA: Los cambios se visualizarán inmediatamente. Asegúrese de suprimir únicamente las señales que no derivan de la muestra. Los valores mínimos en el fondo nunca deben ser "0" para evitar píxeles negros, ya que las señales de ruido podrían ser necesarias para cálculos adicionales. Asegúrese de que todos los cambios de nivel de negro se realicen después de la adquisición de imágenes. De lo contrario, se podría perder información valiosa sobre la muestra. El ajuste de nivel de negro sólo sirve para propósitos representativos. Para usar la misma configuración de visualización en diferentes muestras, se pueden introducir valores precisos en el campo numérico "min" debajo de la lista de canales. Esto es muy útil para los análisis cuantitativos.
3. Realice el ajuste de intensidad, ya sea utilizando el triángulo superior derecho para ajustar la intensidad del canal respectivo o introduciendo valores precisos en el campo numérico "máximo" debajo del canalL lista.
4. Realice el ajuste de contraste arrastrando el triángulo inferior en el centro de la barra de canales para aumentar o disminuir el valor gamma o introduciendo los valores precisos.
5. Ajuste el canal AF647 según el canal de autofluorescencia. Como diferencia, configure la visualización de la señal AF647 en una tabla de búsqueda de color de mapa de calor. Para ello, elija el modo de canal "fuego" en un enfoque similar al del paso 4.2.1.
   NOTA: Como las intensidades totales de la señal son significativamente más bajas en comparación con el canal de autofluorescencia, los niveles de negro normalmente se ajustan a valores mucho más bajos. En cuanto al canal de autofluorescencia, el brillo de este canal suele aumentar.
6. Seleccione el "modo de mezcla" para visualizar las estructuras de tejido en detalle. Analizar todas las muestras de una serie con los mismos valores de los parámetros.

Recorte virtual

1. Para virtualmente abrir el órgano antes de la escena 3D expoRt, aplique un plano de recorte en el objeto 3D representado.
   1. Haga clic en el icono "Clipping Plane" (tijeras) en la lista de objetos. Dentro de la vista de imagen, aparecerá un marco amarillo y un manipulador (eje blanco). Gire el husillo en el extremo más fino con el ratón, cambiando de este modo la orientación del plano de recorte y mueva la parte central más gruesa del eje para seleccionar la profundidad de recorte deseada.
   2. Ocultar el marco y el manipulador desmarcando las respectivas casillas de verificación debajo de la lista de objetos y crear las instantáneas deseadas.

Resultados

El enfoque LSFM presentado analiza la distribución y la cantidad de leucocitos en los corazones murinos tras la inducción de miocarditis grave. La Figura 1A explica el protocolo de pretratamiento para los ratones CD11c.DTR transgénicos para la inducción de miocarditis. Este paso representa el desencadenante necesario para el reclutamiento de leucocitos en el miocardio. Después de una aplicación DTX exitosa, los animales desarrollan síntomas severos de la enfermedad, tale...

Discusión

En la ciencia de la vida moderna, la visualización microscópica de los procesos biológicos desempeña un papel cada vez más importante. En este contexto, se han logrado muchos desarrollos durante los dos últimos siglos que ayudan a responder a preguntas no abordables hasta este punto,. En primer lugar, ha habido una clara tendencia a aumentar fundamentalmente la capacidad de resolución de los microscopios de luz. Con microscopía de iluminación estructurada (SIM) ^{21 , 2...}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
toxina diftérica	Sigma Aldrich	D0564
solución salina tamponada con fosfato	Biochrom	L182-10
ketamina [50 mg/mL]	Inresa	PZN 4089014
xilacina [2 %]	Jeringa Ceva
	Braun	REF 9161502	Braun Omincan F
catéter venoso indwound	Becton Dickinson	REF 381923	BD Insyte Autoguard
respirador para animales pequeños	Harvard Apparatus	73-0044	MiniVent
anticuerpo anit-CD45 (AF647)	BioLegend	103124
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) sal disódica disódica	Carl Roth	8043.2
catéter (21 g)	BD Biosciences	REF 387455	BD valu-set
paraformaldehído	Sigma Aldrich	P6148
Tubo de PE (5 mL)	Carl Roth	EKY9.1	Etanol Rotilabo
	Carl Roth	9065.4
éter dibencílico	Sigma-Aldrich
	Miltenyi Biotec	130-090-753	MACSmix
agarosa (baja gelificación)	Sigma Aldrich	Molde A4018
(15 x 15 x 5 mm)	Tissue Tek	4566	Cryomold
sistema de microscopio de lámina de luz	LaVision Biotec		Ultramicroscope
cuerpo de microscopio	Olympus		MVX10
objetivo	Olympus		0.5  NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5  mm
Cámara sCMOS 5.5MP	Tecnología Andor 488
nm Láser OPSL (50mW)	Láser de
de 647 nm (50 mW)	coherente
de análisis y procesamiento de imágenes 3D	Bitplane		IMARIS Ver. 8.3
cepa de ratón transgénico	Steffen Jung et al.		CD11c.DTR
wt cepa de ratón	Envigo		Balb/c Ola Hsd J
Módulo láser	LaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Objetivo Lente