Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases Mycobacterium tuberculosis

La tuberculosis (TB) sigue siendo una grave amenaza mundial de la salud a pesar de la disponibilidad de regímenes de quimioterapia contra la tuberculosis durante más de 40 años ^1. Esto se debe en parte a la necesidad de largos períodos de tratamiento de más de 6 meses utilizando múltiples combinaciones de fármacos, lo que conduce a paciente incumplimiento ^2. La aparición de la tuberculosis resistente a los medicamentos en los últimos años se ha agravado aún más los problemas en un campo en el éxito del desarrollo de fármacos clínicamente aprobados es prácticamente inexistente ^3. De hecho, a pesar del desarrollo exhaustiva fármaco anti-TB, sólo un único fármaco ha sido aprobado por la FDA para uso clínico en los últimos 40 años ^4. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas generaciones de fármacos antituberculosos para hacer frente a este problema.

Un problema clave en el descubrimiento de fármacos TB es la falta de éxito de la transferencia a partir de compuestos con actividad in vitro de la eficacia en el ámbito clínico= "xref"> ^{5, 6, 7.} Inicialmente, los enfoques basados diana se utilizan para la detección de drogas anti-Mtb ^5, que no se tradujo en células bacterianas enteras. Incluso cuando se utilizan células Mtb, a menudo se lleva a cabo utilizando cultivos de caldo crecido, que no predicen con precisión la eficacia del fármaco in vivo ^{8, 9.} Estos problemas han sido reconocidos y ensayos de cribado de fármacos contra macrófagos que contienen Mtb o latente Mtb se han establecido con éxito ^{8, 10, 11, 12.} Sin embargo, incluso estos ensayos más avanzados no dan suficiente consideración a las barreras de penetración que los medicamentos encuentran en las lesiones pulmonares no vascularizados, y en los focos necróticos en el sitio de la infección. En efecto, Incluso para la primera línea de la tuberculosis rifampicina fármaco, la dosis subóptima ha sido cuestionada debido a insuficiente en el tejido vivo y el líquido cefalorraquídeo (LCR) La penetración de ^{13, 14, 15,} así como una disminución de la eficacia contra intracelular Mtb ^{8, 9.} Como tal, los nuevos modelos y ensayos que tengan en cuenta estos parámetros durante el proceso de desarrollo temprana ventaja, mejoraría sin duda los esfuerzos de descubrimiento de fármacos antituberculosos.

Para hacer frente a esta necesidad, hemos establecido recientemente un modelo de bajo costo, rápida, y BSL-2 compatibles alternativa infección para las pruebas de eficacia de drogas Mtb ^16. Este modelo de infección producida densamente poblado Mtb dentro de grandes estructuras de agregados de macrófagos, que recapitula las barreras de penetración celular fisiológicamente relevantes y generó macrófagos passaged Mtb. Mtb derivado de este modelo de infección se combinó con el ensayo de la resazurina de microtitulación (REMA) para evaluar la eficacia del fármaco, que produjo resultados consistentes con otros modelos de infección intracelular y se correlacionó bien con la capacidad reportada de medicamentos comunes de TB para conseguir altas concentraciones de CSF en relación con las concentraciones séricas ^16.

A continuación se describe en detalle la generación de estructuras agregadas MTB / macrófagos para producir macrófagos pases Mtb adecuada para las pruebas de sensibilidad a los medicamentos utilizando REMA. En particular, se muestra cómo este sistema la infección podría ser adaptado a un formato de 96 pocillos para la compatibilidad con la detección rendimiento de los fármacos antituberculosos de candidatos.

NOTA: Como M. tuberculosis mc ² 6206 es una cepa no virulenta ^{17, 18,} todos los trabajos en este protocolo se puede realizar en una instalación de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2).

1. Condiciones de cultivo para la proteína verde fluorescente que expresan M. tuberculosis mc ² 6206 (Mtb-GFP)

NOTA: La M. tuberculosis H37Rv derivado auxótrofo cepa 6206 mc ² (Δ PANCD, Δ leuCD) transformada con el plásmido que expresa GFP pMN437 se utiliza en este protocolo ^16. Es posible sustituir la cepa Mtb-GFP con no expresan GFP cepa de tipo salvaje para permitir un acceso más fácil de la cepa para los investigadores. Sin embargo, la expresión de GFP es deseable para permitir la confirmación visual de la fagocitosis y la formación de agregados de Mtb / macrófagos. para long almacenamiento a largo plazo, Mtb-GFP se congelaron a -80 ° C en 7H9 medio completo (descrito en el paso 1.1) suplementado con 20% de glicerol.

1. Preparar completa medios Mtb-GFP (7H9-C), completándolo medio 7H9 con 10% de Middlebrook OADC, 0,02% tiloxapol, / ml de ácido D-pantoténico 24 mg, 50 mg / ml de L-leucina y 50 mg / ml de higromicina B.
2. Descongelar un vial de Mtb-GFP y añadir a 10 ml de 7H9-C en un matraz de fondo cuadrado PETG 30 mL.
3. Incubar a 37 ° C en un agitador rotatorio (50 rpm). Tomar medidas de densidad óptica (OD ₆₀₀₎ cada pocos días hasta _DO600 alcanza 1,0 (aproximadamente 5-8 días).
4. Diluir y la cultura paso según sea necesario para mantener un OD ₆₀₀ entre 0,2 a 1,0.
5. Para la infección, utilice una cultura establecida de Mtb-GFP dentro de la fase de crecimiento logarítmico (DO ₆₀₀ de 0,6-1). Para evitar culturas clumpy, sonicar el frasco de cultivo de Mtb en un baño de agua (130 W; 3 x 5 s pulsos) once o dos veces a la semana

2. Las condiciones de cultivo para THP-1 células

1. Preparar completa THP-1 medio celular (RPMI-C), completándolo RPMI 1640 con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal, 2 mM L-glutamina y HEPES 10 mM.
2. Se incuban las células en un matraz T-75 a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO _2.
3. Recuento de células utilizando un hemocitómetro o citometría de flujo cada dos días y mantener las células THP-1 a una densidad entre ,1-0.600.000 por ml.

3. Protocolo de infección para generar estructuras de Mtb / macrófagos de agregado

1. THP-1 de preparación de células (por placa de 96 pocillos)
   1. Centrifugar 7 x 10 ⁶ células THP-1 a 250 g durante 5 min. Volver a suspender en 7 ml de RPMI-C.
2. Preparación de Mtb-GFP
   1. Centrifugar 2,8 x 10 ⁸ Mtb-GFP a 3200 xg durante 5 min en una centrífuga de balanceo-cubo ucantar una conversión de OD ₆₀₀ = 1,0 x 10 3 ⁸ bacterias / ml.
   2. Lavar una vez con RPMI-C y se centrifuga como en el paso 3.2.1.
   3. Volver a suspender en 7 ml de RPMI-C y agitar durante 10 s.
3. Infección
   NOTA: Véase la figura 1 para la plantilla.
   1. Preparar una placa de 96 pocillos mediante la adición de 200 l de agua estéril en las filas A y H y las columnas 1 y 12 para una llanta de agua para evitar la evaporación del medio de cultivo.
   2. Añadir 200 l RPMI-C a la columna 2 (B2 a G2) para el control de fondo (blanco).
   3. Para infectar, añadir la suspensión de Mtb-GFP (paso 3.2) para THP-1 suspensión de células (paso 3.1) y mezclar bien con la pipeta. La final de la densidad de células THP-1 es 5 x 10 ⁵ por ml y la multiplicidad correspondiente de la infección es 40.
   4. Verter el / Mtb-GFP suspensión THP-1 en un depósito de 25 ml.
   5. Añadir 200 l de células THP-1 / Mtb-GFP suspensión de los 96 pozos restantes (B3 a G11) usinga pipeta multicanal.
      NOTA: Si se trabaja con placas múltiples de 96 pocillos, resuspender regularmente el THP-1 suspensión / Mtb queda en el depósito para asegurar que se añadió una mezcla homogénea a cada pocillo.
   6. Incubar a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 7-10 días.
   7. Cambiar el medio cada 2 días retirando lentamente 100 l pasó medios desde la parte superior de cada pocillo y suavemente la adición de 100 l de pre-calentado medio RPMI-C utilizando una pipeta multicanal. No resuspender pozos y molestar a los agregados Mtb / macrófagos en el fondo de los pocillos.
   8. Examinar visualmente los pozos por microscopía de fluorescencia (objetivo 4-10X) al día, tomando nota del tamaño de los agregados Mtb / macrófagos. Durante el día 7-10, Mtb agregados / macrófagos deben ser lo suficientemente grande (véase la figura 2 para referencia) para proceder a las pruebas de la eficacia del fármaco (Sección 4).
   9. Si se desea, imágenes de la captura de los 96 pocillos utilizando un sistema de imágenes de células automatizado equipadoscon campo brillante y el filtro de GFP establece para documentar Mtb formación de agregados / macrófagos.
      NOTA: Si los usuarios no tienen acceso a un sistema automatizado de imágenes, las imágenes de pozos representativos pueden ser tomadas con cualquier microscopio adecuado con capacidad de GFP y de campo brillante.

4. Ensayo de inhibición del crecimiento para evaluar la eficacia de medicamentos contra Mtb Derivado de MTB / agregados de macrófagos

1. Preparación de la droga (por triplicado condiciones para dos fármacos)
   NOTA: Consulte la Figura 1A para la plantilla.
   1. En una placa de 96 pocillos separada, añadir 125 l de los medios de comunicación 7H9-C a través de B2 a G10.
   2. Preparar dos fármacos en el doble de la más alta concentración final deseada en 1 ml de 7H9-C para tener en cuenta la dilución en el paso 4.2.4.
   3. Añadir 250 l de cada fármaco a los pocillos B11-C11-D11 y E11-F11-G11, respectivamente, para los tratamientos por triplicado.
   4. Usando una pipeta multicanal, en serie dilute los fármacos de ensayo de dos veces moviendo 125 l de B11-B10-G11 en G10. Mezclar pipeteando 5 veces en cada paso.
   5. Continuar para pasar 125 l de una columna a otra (derecha a izquierda) a través de la placa, y dejar después de la columna 4.
   6. Después de mezclar la columna 4, deseche 125 l en un contenedor de residuos. Las columnas 2 y 3 no deben contener alguna droga para permitir su uso como fondo (espacio en blanco) y los controles de crecimiento positivas.
      NOTA: Como alternativa, siga plantilla en la figura 1B para las bibliotecas de pruebas de drogas. Cada placa de 96 pocillos puede acomodar a 58 medicamentos en una sola concentración. Preparar esta placa de fármaco usando el doble de la concentración final deseada, ya que se diluirá en un medio en el paso 4.2.4.
2. El tratamiento farmacológico:
   1. Recuperar la placa de 96 pocillos que contenía el Mtb infectados con macrófagos (agregados Mtb / macrófagos).
   2. decantar cuidadosamente todos los pozos correspondientes (B2) a través de G11 con una pipeta multicanal.Realice esto de una manera de dos pasos: primero eliminar 150 l sin inclinar la placa, y luego eliminar residuos de medios (~ 50 l) por la inclinación de la placa y la inserción de la punta de la pipeta hasta el borde inferior del pozo. Como MTB / macrófagos agregados son adherentes a la parte inferior del pozo, ningún material se debe perder.
   3. Añadir con cuidado 100 l de 7H9-C medios de comunicación a todos los pocillos pertinentes (B2 a través de G11) de la placa que contiene los agregados / macrófagos Mtb.
   4. Con una pipeta de múltiples canales, transferir 100 l de la droga que contiene 96 pocillos de placa (etapa 4.1) a los pocillos correspondientes de la placa de la infección.
   5. Colocar en bolsa sellada y se incuba durante 3 días a 37 ° C.

5. La cuantificación de la eficacia de medicamentos usando el ensayo de microtitulación resazurina

1. Preparar resazurina solución madre a una concentración final de 0,8 mg / ml en H ₂ O. Se filtra a través de 0,22 micras de tamaño de poro de membrana de PVDF para la esterilización.
2. Preparar la solución de trabajo resazurina mezclando resazurina solución madre, _H2O y Tween-80 (solución al 20% en _H2O) en una proporción de 2: 1: 1. Las concentraciones finales son 0,4 mg / ml de resazurina y 5% de Tween-80.
3. El uso de un lector de placas, la configuración de un programa para leer la fluorescencia a 530 nm de excitación y 590 nm de emisión cada 30 minutos durante 24 horas a 37 ° C. lector de placas pre-calentamiento a 37 ° C.
4. Añadir 20 l de solución de trabajo de la resazurina a todos los pocillos pertinentes (B2 a través de G11) de la placa tratado con fármaco (etapa 4.11) usando una pipeta multicanal.
5. Colocar la placa en el lector de placas e iniciar el programa establecido en el paso 5.3.
   NOTA: Para facilitar el procesamiento de grandes volúmenes de placas de ensayo, es suficiente para desarrollar el ensayo en una incubadora a 37 ° y realizar solo fluorescencia lee cada 24 h. Esto es aplicable a los usuarios que no tienen acceso a un lector de placas con capacidades cinéticas e incubación también.

Para confirmar la solidez de la adaptación de este modelo de infección al formato de placa de 96 pocillos, que aquí examinamos la sensibilidad a los medicamentos de Mtb derivado de nuestra 96 pocillos adaptada modelo de infección a la rifampicina (RIF) y moxifloxacina (moxi) de acuerdo con la plantilla dada en la figura 1A. Se demuestra que la generación de estructuras de agregados de macrófagos MTB / clave para este ensayo se puede producir de forma fiable en un formato de placa de 96 pocillos (Figura 2), lo que permite la compatibilidad rendimiento (Figura 1B). Macrófagos passaged Mtb producido de esta manera se puede utilizar directamente para las pruebas de la eficacia del fármaco usando el ensayo de microtitulación de resazurina bien caracterizado (Figura 3).

Como el ensayo de la resazurina se basa en las especies oxidativas producidas por Mtb metabólicamente activa para convertir la resazurina azul a la fluorescent resorufina rosa, el cambio de color y la fluorescencia se puede utilizar como un marcador sustituto para determinar la cantidad de crecimiento bacteriano. En la Figura 3A, se muestra que hay suficiente sensibilidad en el ensayo de la resazurina a detectar de forma fiable las bacterias Mtb viables capaces de replicarse en ausencia de fármacos después de sólo 3 días de incubación. Mientras que la confirmación visual de cambio de color de punto final es solamente una evaluación aproximada del crecimiento, podemos cuantificar con precisión mediante la medición de esta cinéticamente la conversión de la resazurina a su metabolito fluorescente resorufina usando un lector de placas (Figura 3B). Usando estos datos, la normalización para el control de crecimiento positivo (ausencia de fármacos) permite el cálculo de las curvas de la matanza de susceptibilidad para visualizar la eficacia del fármaco contra Mtb macrófagos a pases (Figura 4).

Aquí, los resultados representativos en las figuras 3 4 muestran que la concentración mínima inhibitoria (MIC), definida como la concentración más baja del antibiótico a la que se observó la inhibición del crecimiento del 90%, es mayor que 2 g / ml tanto para la rifampicina y moxifloxacina contra Mtb derivado de nuestro modelo de infección. Esto demuestra que nuestro modelo de infección predice la eficacia de los medicamentos contra Mtb que están más en línea con los valores de MIC contra determinados intracelular Mtb 8, y por lo tanto refleja las propiedades de barrera de difusión que son abandonados en la mayoría de los ensayos de sensibilidad a los medicamentos Mtb utilizando células bacterianas en caldo crecido.

Es importante destacar que los datos obtenidos mediante el ensayo descrito en el formato de 96 pocillos mostraron resultados altamente comparables a los que habíamos determinado previamente para la rifampicina y moxifloxacina contra Mtb macrófagos passaged 16.

Figura 2: Generación de Mtb / estructuras agregadas de macrófagos en placas de 96 pocillosformato. (A) Representante de campo claro y GFP se fusionaron imágenes de Mtb agregados -macrophage el día 9 después de la infección. Las imágenes fueron capturadas con un objetivo 4X usando un programa de formación de imágenes de células automatizado que documenta todo el pozo por la costura de un montaje de 3 por 3 imágenes capturadas de forma individual. (B) Una imagen individual no cosido del campo visual se muestra en (A). Imagen del campo brillante y GFP (C) Un representante fusionada de una estructura agregada Mtb / macrófagos capturado con un objetivo de 10X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Usando el ensayo de microtitulación resazurina para medir la viabilidad de Mtb. (A) La presencia de viablcélulas e Mtb se pueden determinar simplemente mediante la conversión del colorante resazurina azul a su rosa, forma reducida. Los resultados representativos se muestran aquí usando rifampicina (RIF) y moxifloxacina (moxi) de acuerdo con la plantilla en la Figura 1A. (B) Para medir cuantitativamente la conversión de la resazurina, la fluorescencia de los pocillos individuales (que corresponde a la figura 3A) se controla cinéticamente durante 24 h como se describe en el paso 5. representativos mini-gráficos muestran unidades de fluorescencia relativa (eje y) frente al tiempo (x -eje). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Determinación de la susceptibilidad al fármaco matar curvas a partir de datos REMA. unidades de fluorescencia relativa en el momento de máxima resazseñal urin en rifampicina (A) y (B) tratado con moxifloxacino pozos (de la Figura 3B) se normalizaron a la no control de drogas (crecimiento Mtb máxima) como 100% de supervivencia. control de fondo señales (en blanco) se restaron de cada pocillo de muestra. El porcentaje de supervivencia se trazó para cada concentración individual de tratamiento de drogas para generar una curva de muerte. Los datos de esta figura representan la media ± SD de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.