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Artículo de método

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases

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DOI:

10.3791/55453

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24 de marzo de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

En este artículo

Resumen

Son muy deseables nuevos modelos y ensayos que mejorarían el proceso de desarrollo temprano de fármacos antituberculosos de próxima generación. Aquí, describimos un ensayo rápido, económico y compatible con BSL-2 para evaluar la eficacia de un fármaco contra Mycobacterium tuberculosis que se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.

Resumen

El proceso temprano de desarrollo de fármacos antituberculosos se ve obstaculizado por la ineficiente traducción de compuestos con actividad in vitro a la eficacia en el entorno clínico. Es probable que esto se deba a la falta de consideración de las barreras de penetración celular fisiológicamente relevantes que existen en el huésped infectado. Recientemente establecimos un modelo de infección alternativo que genera grandes estructuras agregadas de macrófagos que contienen M. tuberculosis (Mtb) densamente empaquetada en su núcleo, que era adecuado para las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos. Este modelo de infección es barato, rápido y, lo que es más importante, compatible con BSL-2. Aquí, describimos los procedimientos experimentales para generar estructuras agregadas de Mtb/macrófagos que producirían Mtb pasadas por macrófagos para pruebas de susceptibilidad a medicamentos. En particular, demostramos cómo este sistema de infección podría adaptarse directamente al formato de placa de 96 pocillos, mostrando capacidad de rendimiento para el cribado de bibliotecas de compuestos contra Mtb. En general, este ensayo es una valiosa adición a la caja de herramientas de descubrimiento de fármacos Mtb actualmente disponible debido a su simplicidad, rentabilidad y escalabilidad.

Introducción

La tuberculosis (TB) sigue siendo una grave amenaza mundial de la salud a pesar de la disponibilidad de regímenes de quimioterapia contra la tuberculosis durante más de 40 años 1. Esto se debe en parte a la necesidad de largos períodos de tratamiento de más de 6 meses utilizando múltiples combinaciones de fármacos, lo que conduce a paciente incumplimiento 2. La aparición de la tuberculosis resistente a los medicamentos en los últimos años se ha agravado aún más los problemas en un campo en el éxito del desarrollo de fármacos clínicamente aprobados es prácticamente inexistente 3. De hecho, a pesar del desarrollo exhaustiva fármaco anti-TB, sólo un único fármaco ha sido aprobado por la FDA para uso clínico en los últimos 40 años 4. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas generaciones de fármacos antituberculosos para hacer frente a este problema.

Un problema clave en el descubrimiento de fármacos TB es la falta de éxito de la transferencia a partir de compuestos con actividad in vitro de la eficacia en el ámbito clínico= "xref"> 5, 6, 7. Inicialmente, los enfoques basados diana se utilizan para la detección de drogas anti-Mtb 5, que no se tradujo en células bacterianas enteras. Incluso cuando se utilizan células Mtb, a menudo se lleva a cabo utilizando cultivos de caldo crecido, que no predicen con precisión la eficacia del fármaco in vivo 8, 9. Estos problemas han sido reconocidos y ensayos de cribado de fármacos contra macrófagos que contienen Mtb o latente Mtb se han establecido con éxito 8, 10, 11, 12. Sin embargo, incluso estos ensayos más avanzados no dan suficiente consideración a las barreras de penetración que los medicamentos encuentran en las lesiones pulmonares no vascularizados, y en los focos necróticos en el sitio de la infección. En efecto, Incluso para la primera línea de la tuberculosis rifampicina fármaco, la dosis subóptima ha sido cuestionada debido a insuficiente en el tejido vivo y el líquido cefalorraquídeo (LCR) La penetración de 13, 14, 15, así como una disminución de la eficacia contra intracelular Mtb 8, 9. Como tal, los nuevos modelos y ensayos que tengan en cuenta estos parámetros durante el proceso de desarrollo temprana ventaja, mejoraría sin duda los esfuerzos de descubrimiento de fármacos antituberculosos.

Para hacer frente a esta necesidad, hemos establecido recientemente un modelo de bajo costo, rápida, y BSL-2 compatibles alternativa infección para las pruebas de eficacia de drogas Mtb 16. Este modelo de infección producida densamente poblado Mtb dentro de grandes estructuras de agregados de macrófagos, que recapitula las barreras de penetración celular fisiológicamente relevantes y generó macrófagos passaged Mtb con un estado fisiológico alterado parecido latente Mtb. Mtb derivado de este modelo de infección se combinó con el ensayo de la resazurina de microtitulación (REMA) para evaluar la eficacia del fármaco, que produjo resultados consistentes con otros modelos de infección intracelular y se correlacionó bien con la capacidad reportada de medicamentos comunes de TB para conseguir altas concentraciones de CSF en relación con las concentraciones séricas 16.

A continuación se describe en detalle la generación de estructuras agregadas MTB / macrófagos para producir macrófagos pases Mtb adecuada para las pruebas de sensibilidad a los medicamentos utilizando REMA. En particular, se muestra cómo este sistema la infección podría ser adaptado a un formato de 96 pocillos para la compatibilidad con la detección rendimiento de los fármacos antituberculosos de candidatos.

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Protocolo

NOTA: Como M. tuberculosis mc 2 6206 es una cepa no virulenta 17, 18, todos los trabajos en este protocolo se puede realizar en una instalación de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2).

1. Condiciones de cultivo para la proteína verde fluorescente que expresan M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb-GFP)

NOTA: La M. tuberculosis H37Rv derivado auxótrofo cepa 6206 mc 2 (Δ PANCD, Δ leuCD) transformada con el plásmido que expresa GFP pMN437 se utiliza en este protocolo 16. Es posible sustituir la cepa Mtb-GFP con no expresan GFP cepa de tipo salvaje para permitir un acceso más fácil de la cepa para los investigadores. Sin embargo, la expresión de GFP es deseable para permitir la confirmación visual de la fagocitosis y la formación de agregados de Mtb / macrófagos. para long almacenamiento a largo plazo, Mtb-GFP se congelaron a -80 ° C en 7H9 medio completo (descrito en el paso 1.1) suplementado con 20% de glicerol.

  1. Preparar completa medios Mtb-GFP (7H9-C), completándolo medio 7H9 con 10% de Middlebrook OADC, 0,02% tiloxapol, / ml de ácido D-pantoténico 24 mg, 50 mg / ml de L-leucina y 50 mg / ml de higromicina B.
  2. Descongelar un vial de Mtb-GFP y añadir a 10 ml de 7H9-C en un matraz de fondo cuadrado PETG 30 mL.
  3. Incubar a 37 ° C en un agitador rotatorio (50 rpm). Tomar medidas de densidad óptica (OD 600) cada pocos días hasta DO600 alcanza 1,0 (aproximadamente 5-8 días).
  4. Diluir y la cultura paso según sea necesario para mantener un OD 600 entre 0,2 a 1,0.
  5. Para la infección, utilice una cultura establecida de Mtb-GFP dentro de la fase de crecimiento logarítmico (DO 600 de 0,6-1). Para evitar culturas clumpy, sonicar el frasco de cultivo de Mtb en un baño de agua (130 W; 3 x 5 s pulsos) once o dos veces a la semana

2. Las condiciones de cultivo para THP-1 células

  1. Preparar completa THP-1 medio celular (RPMI-C), completándolo RPMI 1640 con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal, 2 mM L-glutamina y HEPES 10 mM.
  2. Se incuban las células en un matraz T-75 a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2.
  3. Recuento de células utilizando un hemocitómetro o citometría de flujo cada dos días y mantener las células THP-1 a una densidad entre ,1-0.600.000 por ml.

3. Protocolo de infección para generar estructuras de Mtb / macrófagos de agregado

  1. THP-1 de preparación de células (por placa de 96 pocillos)
    1. Centrifugar 7 x 10 6 células THP-1 a 250 g durante 5 min. Volver a suspender en 7 ml de RPMI-C.
  2. Preparación de Mtb-GFP
    1. Centrifugar 2,8 x 10 8 Mtb-GFP a 3200 xg durante 5 min en una centrífuga de balanceo-cubo ucantar una conversión de OD 600 = 1,0 x 10 3 8 bacterias / ml.
    2. Lavar una vez con RPMI-C y se centrifuga como en el paso 3.2.1.
    3. Volver a suspender en 7 ml de RPMI-C y agitar durante 10 s.
  3. Infección
    NOTA: Véase la figura 1 para la plantilla.
    1. Preparar una placa de 96 pocillos mediante la adición de 200 l de agua estéril en las filas A y H y las columnas 1 y 12 para una llanta de agua para evitar la evaporación del medio de cultivo.
    2. Añadir 200 l RPMI-C a la columna 2 (B2 a G2) para el control de fondo (blanco).
    3. Para infectar, añadir la suspensión de Mtb-GFP (paso 3.2) para THP-1 suspensión de células (paso 3.1) y mezclar bien con la pipeta. La final de la densidad de células THP-1 es 5 x 10 5 por ml y la multiplicidad correspondiente de la infección es 40.
    4. Verter el / Mtb-GFP suspensión THP-1 en un depósito de 25 ml.
    5. Añadir 200 l de células THP-1 / Mtb-GFP suspensión de los 96 pozos restantes (B3 a G11) usinga pipeta multicanal.
      NOTA: Si se trabaja con placas múltiples de 96 pocillos, resuspender regularmente el THP-1 suspensión / Mtb queda en el depósito para asegurar que se añadió una mezcla homogénea a cada pocillo.
    6. Incubar a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 7-10 días.
    7. Cambiar el medio cada 2 días retirando lentamente 100 l pasó medios desde la parte superior de cada pocillo y suavemente la adición de 100 l de pre-calentado medio RPMI-C utilizando una pipeta multicanal. No resuspender pozos y molestar a los agregados Mtb / macrófagos en el fondo de los pocillos.
    8. Examinar visualmente los pozos por microscopía de fluorescencia (objetivo 4-10X) al día, tomando nota del tamaño de los agregados Mtb / macrófagos. Durante el día 7-10, Mtb agregados / macrófagos deben ser lo suficientemente grande (véase la figura 2 para referencia) para proceder a las pruebas de la eficacia del fármaco (Sección 4).
    9. Si se desea, imágenes de la captura de los 96 pocillos utilizando un sistema de imágenes de células automatizado equipadoscon campo brillante y el filtro de GFP establece para documentar Mtb formación de agregados / macrófagos.
      NOTA: Si los usuarios no tienen acceso a un sistema automatizado de imágenes, las imágenes de pozos representativos pueden ser tomadas con cualquier microscopio adecuado con capacidad de GFP y de campo brillante.

4. Ensayo de inhibición del crecimiento para evaluar la eficacia de medicamentos contra Mtb Derivado de MTB / agregados de macrófagos

  1. Preparación de la droga (por triplicado condiciones para dos fármacos)
    NOTA: Consulte la Figura 1A para la plantilla.
    1. En una placa de 96 pocillos separada, añadir 125 l de los medios de comunicación 7H9-C a través de B2 a G10.
    2. Preparar dos fármacos en el doble de la más alta concentración final deseada en 1 ml de 7H9-C para tener en cuenta la dilución en el paso 4.2.4.
    3. Añadir 250 l de cada fármaco a los pocillos B11-C11-D11 y E11-F11-G11, respectivamente, para los tratamientos por triplicado.
    4. Usando una pipeta multicanal, en serie dilute los fármacos de ensayo de dos veces moviendo 125 l de B11-B10-G11 en G10. Mezclar pipeteando 5 veces en cada paso.
    5. Continuar para pasar 125 l de una columna a otra (derecha a izquierda) a través de la placa, y dejar después de la columna 4.
    6. Después de mezclar la columna 4, deseche 125 l en un contenedor de residuos. Las columnas 2 y 3 no deben contener alguna droga para permitir su uso como fondo (espacio en blanco) y los controles de crecimiento positivas.
      NOTA: Como alternativa, siga plantilla en la figura 1B para las bibliotecas de pruebas de drogas. Cada placa de 96 pocillos puede acomodar a 58 medicamentos en una sola concentración. Preparar esta placa de fármaco usando el doble de la concentración final deseada, ya que se diluirá en un medio en el paso 4.2.4.
  2. El tratamiento farmacológico:
    1. Recuperar la placa de 96 pocillos que contenía el Mtb infectados con macrófagos (agregados Mtb / macrófagos).
    2. decantar cuidadosamente todos los pozos correspondientes (B2) a través de G11 con una pipeta multicanal.Realice esto de una manera de dos pasos: primero eliminar 150 l sin inclinar la placa, y luego eliminar residuos de medios (~ 50 l) por la inclinación de la placa y la inserción de la punta de la pipeta hasta el borde inferior del pozo. Como MTB / macrófagos agregados son adherentes a la parte inferior del pozo, ningún material se debe perder.
    3. Añadir con cuidado 100 l de 7H9-C medios de comunicación a todos los pocillos pertinentes (B2 a través de G11) de la placa que contiene los agregados / macrófagos Mtb.
    4. Con una pipeta de múltiples canales, transferir 100 l de la droga que contiene 96 pocillos de placa (etapa 4.1) a los pocillos correspondientes de la placa de la infección.
    5. Colocar en bolsa sellada y se incuba durante 3 días a 37 ° C.

5. La cuantificación de la eficacia de medicamentos usando el ensayo de microtitulación resazurina

  1. Preparar resazurina solución madre a una concentración final de 0,8 mg / ml en H 2 O. Se filtra a través de 0,22 micras de tamaño de poro de membrana de PVDF para la esterilización.
  2. Preparar la solución de trabajo resazurina mezclando resazurina solución madre, H2O y Tween-80 (solución al 20% en H2O) en una proporción de 2: 1: 1. Las concentraciones finales son 0,4 mg / ml de resazurina y 5% de Tween-80.
  3. El uso de un lector de placas, la configuración de un programa para leer la fluorescencia a 530 nm de excitación y 590 nm de emisión cada 30 minutos durante 24 horas a 37 ° C. lector de placas pre-calentamiento a 37 ° C.
  4. Añadir 20 l de solución de trabajo de la resazurina a todos los pocillos pertinentes (B2 a través de G11) de la placa tratado con fármaco (etapa 4.11) usando una pipeta multicanal.
  5. Colocar la placa en el lector de placas e iniciar el programa establecido en el paso 5.3.
    NOTA: Para facilitar el procesamiento de grandes volúmenes de placas de ensayo, es suficiente para desarrollar el ensayo en una incubadora a 37 ° y realizar solo fluorescencia lee cada 24 h. Esto es aplicable a los usuarios que no tienen acceso a un lector de placas con capacidades cinéticas e incubación también.

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Resultados

Para confirmar la solidez de la adaptación de este modelo de infección al formato de placa de 96 pocillos, que aquí examinamos la sensibilidad a los medicamentos de Mtb derivado de nuestra 96 pocillos adaptada modelo de infección a la rifampicina (RIF) y moxifloxacina (moxi) de acuerdo con la plantilla dada en la figura 1A. Se demuestra que la generación de estructuras de agregados de macrófagos MTB / clave para este ensayo se puede producir de forma fi...

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Discusión

Aquí, hemos descrito en detalle un modelo de infección de Mtb alternativa adecuada para las pruebas de la eficacia del fármaco. Este modelo tiene en cuenta dos factores clave que deben ser considerados en mayor medida durante el proceso de desarrollo de la primera medicamentos contra la tuberculosis: la presencia de barreras fisiológicamente relevantes a la penetración del fármaco y cambios metabólicos de Mtb durante la infección. Si bien ya hemos demostrado los beneficios de nuestro modelo de infecció...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Frank Wolschendorf por el acceso al lector automático de placas de imágenes Cytation 3. Este trabajo fue financiado en parte por la subvención R01-AI104499 de los NIH a OK. Partes del trabajo se realizaron en las instalaciones del CFAR de la UAB y por el UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, que están financiados por el AI027767 P30 de los NIH/NIAID y por el NIH 5P30 AR048311.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
7H9BD Difco271310Siga las recomendaciones del fabricante
Middlebrook OADCBD Biosciences212351
TyloxapolSigmaT8761Prepare una solución madre al 20% en H2O; filtro esterilizar
sal hemicálcica de ácido D-pantoténicoSigmaP5710Prepare una solución madre de 24 mg/mL en H2O; filtro esterilizar
L-leucinaMP Biomedicals 194694Prepare una solución madre de 50 mg/ml en H2O; filtro de esterilización
Hygromycin BEMD Millipore400051Prepare una solución madre de 200 mg/mL en H2O
Nalgene Square Botella de medios de PETG ThermoFisher2019-0030
RPMI 1640 mediosHycloneSH30027.01
Suero fetal bovinoAtlanta BiologicalsS12450H
L-glutaminaCorningMT25005CI
HEPESHycloneSH30237.01
Citación 3 lector de placasBiotekIntercambiable con cualquier lector de placas fluorescente y microscopio
Gen5 Software BiotekRegistro y análisis de coversión de rezasurin
rifampicina Fisher ScientificBP2679250Prepare una solución madre de 10 mg/ml en H2O
Clorhidrato de moxifloxacinaAcros Organics 457960010Prepare una solución madre de 10 mg/mL en H2O
Resazurin Sodium Salt SigmaR7017Prepare 800 μ g/mL de solución madre en H2O; esterilizar por filtro
Tween-80Fisher Scientific T164500Prepare una solución madre al 20% en H2O; esterilizar por filtro
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Referencias

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